程棟 韋玲 劉煥

肺癌是全世界最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，2018年約有210萬(wàn)新病例和180萬(wàn)死亡病例[1]。因此，迫切需要確定肺癌發(fā)展的潛在機(jī)制，并開(kāi)發(fā)新的診斷性生物標(biāo)志物和治療策略。研究表明，氯普魯卡因(chloroprocaine，CP)可抑制宮頸癌CaSki和HeLa細(xì)胞的增殖[2]，還可抑制乳腺癌細(xì)胞活性[3]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)EZR反義RNA 1(EZR antisense RNA 1，EZR-AS1)在乳腺癌組織和細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)，干擾其表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[4]。但氯普魯卡因和EZR-AS1對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響，且氯普魯卡因是否通過(guò)調(diào)控EZR-AS1的表達(dá)影響肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲目前還尚未可知。本研究考察氯普魯卡因在肺癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲中的作用，并結(jié)合EZR-AS1探索其潛在的作用機(jī)制，為擴(kuò)大氯普魯卡因的臨床用途提供線索。

資料與方法

一、主要試劑

肺癌細(xì)胞株A549購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心細(xì)胞庫(kù)，RPMI-1640培養(yǎng)基(Roswell Park Memorial Institute)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，氯普魯卡因購(gòu)自山西晉城海斯制藥有限公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)相關(guān)試劑盒購(gòu)自日本Takara公司，細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)、p21、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(Matrix metalloprotease-2，MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(Matrix metalloprotease-9，MMP-9)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體購(gòu)自美國(guó)Cellular Signaling Technology公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，si-NC、si-EZR-AS1、pcDNA、pcDNA-EZR-AS1購(gòu)自上海吉瑪生物有限公司。

二、細(xì)胞培養(yǎng)與處理

將A549細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并在37℃、含5% CO2的環(huán)境中生長(zhǎng)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，使用1 mmol/L、1.5 mmol/L、2 mmol/L濃度的氯普魯卡因[4]處理細(xì)胞72 h，記為CP-L、CP-M、CP-H組，同時(shí)將正常培養(yǎng)的細(xì)胞設(shè)為對(duì)照(Con)。

三、噻唑藍(lán)(Methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)檢測(cè)細(xì)胞增殖

將A549細(xì)胞接種于96孔板，每孔5×104個(gè)細(xì)胞。將MTT溶液(0.5 mg/mL)加入到每孔中，并將細(xì)胞培養(yǎng)4 h。加入二甲基亞砜以溶解所得晶體，之后在酶標(biāo)儀中讀取490 nm波長(zhǎng)的吸光度(OD)值。

細(xì)胞抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%

四、Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移侵襲

A549細(xì)胞遷移能力測(cè)定：使用無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞為2×105個(gè)/mL，吸取100 μL于上室。下室加入500 μL含血清RPMI-1640培養(yǎng)基。細(xì)胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，用4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。

A549細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)：除實(shí)驗(yàn)前在上室添加Matrigel基質(zhì)膠外，其余操作均與遷移實(shí)驗(yàn)相同。

五、Western blot檢測(cè)CyclinD1、p21、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)

收集A549細(xì)胞，在RIPA緩沖液中裂解。12 000 rpm離心15 min后，收集上清液。根據(jù)制造商的方案，通過(guò)二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白測(cè)定法確定每個(gè)樣品的蛋白濃度。將蛋白溶解在十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate，SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(Polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE)上樣緩沖液中，100 ℃下煮沸5 min。將樣品在12% SDS-PAGE凝膠上分離，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脫脂牛奶封閉后，將PVDF膜與CyclinD1、p21、MMP-2、MMP-9、GAPDH抗體(1∶1 000稀釋)在4℃孵育過(guò)夜。用Tris-HCl-Tween緩沖鹽溶液(Tris buffered saline with Tween，TBST)洗滌3次后，將膜與二抗(1 ∶5 000稀釋)孵育60 min。以GAPDH為對(duì)照，通過(guò)增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光液可視化目的蛋白的信號(hào)。

六、qRT-PCR檢測(cè)EZR-AS1表達(dá)

根據(jù)制造商提供的方案，使用Trizol試劑從A549細(xì)胞中提取總RNA。使用Prime Script TM RT試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以得到cDNA。使用SYBR Premix Ex TaqTM II PCR試劑盒進(jìn)行qRT-PCR。EZR-AS1表達(dá)用2-ΔΔCt方法進(jìn)行量化。用于qRT-PCR的引物如下：EZR-AS1 5'-CCCTCTCCAATGAAGCCTCTC-3'(正向)和5'-ACCGAAAATGCCGAAACCAG-3'(反向)；內(nèi)參GAPDH 5'-TCCTCTGACTTCAACAGCGACAC-3'(正向)和5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAATTC-3'(反向)。

七、細(xì)胞轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前1 d，將A549細(xì)胞以適當(dāng)密度接種于6孔板，待其生長(zhǎng)至70%～80%匯合時(shí)，依照Lipofectamine 2000試劑說(shuō)明書(shū)的指示，將si-NC、si-EZR-AS1、pcDNA、pcDNA-EZR-AS1轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞。轉(zhuǎn)染pcDNA、pcDNA-EZR-AS1的細(xì)胞加入2 mmol/L 氯普魯卡因進(jìn)行處理。根據(jù)1.3～1.6中所述方法，檢測(cè)轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞增殖、遷移侵襲及相關(guān)蛋白、基因的表達(dá)。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、氯普魯卡因?qū)Ψ伟〢549細(xì)胞增殖的影響

MTT和Western blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Con組比較，不同濃度的氯普魯卡因明顯增加A549細(xì)胞增殖抑制率，顯著減少CyclinD1蛋白表達(dá)量，和提高p21蛋白水平，均呈濃度依賴(lài)性(P<0.05(見(jiàn)表1、圖1)。

圖1 增殖相關(guān)蛋白表達(dá)

二、氯普魯卡因?qū)Ψ伟〢549細(xì)胞遷移侵襲的影響

Transwell和Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，與Con組比較，不同濃度的氯普魯卡因明顯減少細(xì)胞A549的遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)，以及降低MMP-2蛋白和MMP-9蛋白表達(dá)量，均呈濃度依賴(lài)性(P<0.05)(見(jiàn)表2、圖2)。

表1 氯普魯卡因?qū)Ψ伟〢549細(xì)胞增殖的影響

圖2 遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

表2 氯普魯卡因?qū)Ψ伟〢549細(xì)胞遷移侵襲的影響

三、氯普魯卡因?qū)Ψ伟〢549細(xì)胞中l(wèi)ncRNA EZR-AS1表達(dá)的影響

qRT-PCR檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示，與Con組比較，不同濃度的氯普魯卡因顯著減少A549細(xì)胞中EZR-AS1的表達(dá)量，且呈濃度依賴(lài)性(P<0.05)(見(jiàn)表3)。

表3 氯普魯卡因?qū)Ψ伟┘?xì)胞中l(wèi)ncRNA EZR-AS1表達(dá)的影響

四、干擾lncRNA EZR-AS1表達(dá)對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響

在A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染si-EZR-AS1，發(fā)現(xiàn)EAR-AS1的表達(dá)量明顯低于si-NC組(P<0.05，表4)，提示成功構(gòu)建干擾lncRNA EZR-AS1表達(dá)的細(xì)胞。與si-NC組比較，干擾lncRNA EZR-AS1表達(dá)顯著增加A549細(xì)胞的抑制率、p21蛋白表達(dá)量，明顯降低遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)、CyclinD1蛋白、MMP-2蛋白、MMP-9蛋白水平(P<0.05，表4、圖3)。

圖3 增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

表4 干擾lncRNA EZR-AS1表達(dá)對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響

五、lncRNA EZR-AS1過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了氯普魯卡因(2 mmol/L)對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移侵襲的作用

與Con組比較，氯普魯卡因明顯減少A549細(xì)胞的EZR-AS1表達(dá)量、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)、CyclinD1蛋白、MMP-2蛋白、MMP-9蛋白表達(dá)量，顯著提高抑制率、p21蛋白水平(P<0.05)(見(jiàn)表5、圖4)。與CP+pcDNA組比較，CP+pcDNA-EZR-AS1組A549細(xì)胞的EZR-AS1表達(dá)量、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)、CyclinD1蛋白、MMP-2蛋白、MMP-9蛋白表達(dá)量明顯增加，抑制率、p21蛋白水平顯著降低(P<0.05)(見(jiàn)表5、圖4)。

圖4 增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

表5 lncRNA EZR-AS1過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了氯普魯卡因?qū)Ψ伟〢549細(xì)胞增殖、遷移侵襲的作用

討 論

在中國(guó)，肺癌是最常被診斷的癌癥，也是癌癥死亡的主要原因。其中，男性的肺癌發(fā)生率和死亡率幾乎是女性的兩倍，而不同地區(qū)之間沒(méi)有顯著差異[5]，中國(guó)肺癌的疾病負(fù)擔(dān)仍然很高。肺癌通常在晚期被診斷出來(lái)，患者的5年生存率約為16.1%[6]?，F(xiàn)階段，肺癌治療的方案已取得重大進(jìn)展，但由于高度的惡性和轉(zhuǎn)移性，肺癌的預(yù)后仍然不佳[7]。肺癌與其他癌癥具有共同的特征，包括無(wú)限增殖，轉(zhuǎn)移和侵襲，以及對(duì)細(xì)胞凋亡的抗性，而開(kāi)發(fā)治療肺癌的有效療法面臨著持續(xù)的挑戰(zhàn)。由此，尋找新型分子生物標(biāo)記物對(duì)肺癌的早期診斷，預(yù)后和潛在治療具有重要意義。

作為臨床常用麻醉藥普魯卡因的衍生物，氯普魯卡因也稱(chēng)納噻卡因，是一種氨基酯類(lèi)局部麻醉劑，半衰期非常短[8]。根據(jù)報(bào)道，普魯卡因可以抑制肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和NCI-H1975的增殖，和異種移植的肺癌小鼠腫瘤生長(zhǎng)[9]，擁有抗肺癌、肝癌、胃癌等多種癌癥的潛力[10]。氯普魯卡因除了應(yīng)用于臨床麻醉外，已被報(bào)道可以抑制宮頸癌、乳腺癌細(xì)胞的增殖[2-3]，但其在肺癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲中的作用仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)中，氯普魯卡因明顯提高A549細(xì)胞增殖抑制率、p21蛋白水平，顯著減少遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)量、EZR-AS1表達(dá)量，并呈濃度依賴(lài)性，說(shuō)明氯普魯卡因可以抑制肺癌細(xì)胞的增殖、遷移侵襲能力，顯現(xiàn)出一定的抗癌活性。

lncRNA是進(jìn)化上保守的轉(zhuǎn)錄本，沒(méi)有編碼蛋白質(zhì)的能力。既往研究已經(jīng)證明了異常lncRNA在癌癥等許多復(fù)雜的人類(lèi)疾病中的重要作用[11]。lncRNA涉及多種生物學(xué)功能，例如細(xì)胞周期進(jìn)程，細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞增殖，遷移侵襲和凋亡等，與腫瘤的發(fā)生，侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，在包括肺癌在內(nèi)的諸多癌癥中起著關(guān)鍵作用[12-14]。此外，癌癥中異常表達(dá)的lncRNA通常充當(dāng)癌基因或抑癌基因。根據(jù)報(bào)道，lncRNA EZR-AS1在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)上調(diào)，下調(diào)其表達(dá)促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡，抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的活性和侵襲能力[15]。lncRNA EZR-AS1可促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移[16]，表明EZR-AS1可能是一種癌基因，下調(diào)其表達(dá)具有腫瘤抑制活性。本項(xiàng)研究分析了氯普魯卡因?qū)Ψ伟┘?xì)胞中l(wèi)ncRNA EZR-AS1表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，不同濃度的氯普魯卡因顯著減少A549細(xì)胞中EZR-AS1的表達(dá)量，提示EZR-AS1參與氯普魯卡因調(diào)控的肺癌進(jìn)程。功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，干擾lncRNA EZR-AS1表達(dá)顯著增加A549細(xì)胞的抑制率、p21蛋白表達(dá)量，明顯降低遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平，這表明干擾EZR-AS1表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲具有抑制作用，與前人研究[4]相符。另外，進(jìn)一步探究氯普魯卡因的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)lncRNA EZR-AS1過(guò)表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)氯普魯卡因促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞抑制率、p21蛋白表達(dá)的作用，和逆轉(zhuǎn)其抑制細(xì)胞遷移侵襲、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)的作用。這些結(jié)果證實(shí)，氯普魯卡因抑制肺癌細(xì)胞的增殖、遷移侵襲可能是通過(guò)下調(diào)lncRNA EZR-AS1表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，1 mmol/L、1.5 mmol/L、2 mmol/L濃度的氯普魯卡因能夠有效抑制肺癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲，并且干擾lncRNA EZR-AS1表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲同樣具有抑制作用，氯普魯卡因?qū)Ψ伟┑目乖鲋?、抗遷移侵襲活性與調(diào)控lncRNA EZR-AS1表達(dá)有關(guān)，為肺癌的診治提供了有前景的藥物和靶點(diǎn)。