花青素積累與谷子低溫脅迫響應(yīng)的關(guān)系

張 彬 李 萌 蔣茂雙 王俊杰 侯思宇 韓淵懷 李紅英

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

谷子[Setariaitalica(L.) P. Beauv.]，禾本科狗尾草屬，是我國北方重要的雜糧作物和飼草作物，至今已有8 700年的栽培歷史[1]。谷子脫去穎殼后稱小米，具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值。谷子的抗逆性強(qiáng)，不僅較玉米等作物具有更強(qiáng)的抗旱性[2]，而且部分品種具有較強(qiáng)的抗寒性，可在黑龍江、內(nèi)蒙古等高寒地區(qū)種植[3]。

花青素屬于類黃酮化合物，是植物中重要的次生代謝產(chǎn)物，廣泛存在于植物的果實(shí)、花和葉片中，使植物呈現(xiàn)紫色、紅色和藍(lán)色。花青素不僅可以吸引昆蟲幫助植物進(jìn)行授粉，還參與調(diào)節(jié)植物對生物及非生物脅迫損傷的抵抗[4]，在植物生長過程中具有重要作用。此外，花青素在抗氧化、抗癌以及抗病方面也有一定的醫(yī)療和保健作用，如降低膽固醇和血脂，防治心血管疾病，治療視網(wǎng)膜疾病等，是當(dāng)今科學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。

低溫脅迫限制作物的種植范圍，并嚴(yán)重影響作物的品質(zhì)和產(chǎn)量。低溫對植物的損害主要表現(xiàn)為代謝失調(diào)、膜通透性改變、呼吸作用紊亂、光合作用降低和有機(jī)大分子物質(zhì)水解等[5-6]。植物花青素的積累受多種環(huán)境因素的誘導(dǎo)，低溫是主要因素之一。低溫處理可顯著提高血橙[7]、蘋果[8]、甘藍(lán)[9]的花青素含量，進(jìn)而提高其營養(yǎng)品質(zhì)。在低溫誘導(dǎo)下，茶樹紫娟[10]、紅葉大頭芥[11]、北美短葉松[12]可通過積累花青素進(jìn)而適應(yīng)逆境的變化。

部分谷子品種苗期遭遇冷害時其葉片和莖稈會積累花青素而呈現(xiàn)紫紅色表型，在擬南芥[13]、番茄[14]等研究中發(fā)現(xiàn)低溫可以通過誘導(dǎo)花青素的合成來提高植物的抗逆性，但有關(guān)谷子花青素的合成代謝及環(huán)境因素對其調(diào)控機(jī)制的研究卻鮮有報道。本研究以苗期綠葉谷子品種豫谷1號(YG1)、晉谷21(JG21)和紫葉谷子品種龍爪(B13)、向陽谷(B45)、繩頭黃谷(B55)為材料，研究花青素的積累與谷子低溫響應(yīng)的相關(guān)性，以期為谷子積累花青素以適應(yīng)低溫環(huán)境提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為富含花青素的紫葉谷子品種龍爪(B13)、向陽谷(B45)、繩頭黃谷(B55)和綠葉谷子品種豫谷1號(YG1)、晉谷21(JG21)。紫葉谷子品種由2017—2019年在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田種植的420個谷子品種中篩選得到，綠葉谷子品種由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物工程研究所種質(zhì)資源庫提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計

將試驗(yàn)材料種植于26℃溫室，待谷子生長至五葉期，設(shè)置2個處理：常溫處理為對照組，置于28℃光照16 h/20℃黑暗8 h的人工氣候培養(yǎng)箱培養(yǎng)；低溫處理為處理組，置于16℃光照16 h/8℃黑暗8 h的人工氣候培養(yǎng)箱培養(yǎng)。處理后第8和第12天分別取處理組(記作LTD1，LTD2)和對照組(記作CKD1，CKD2)每個品種的葉片進(jìn)行生理指標(biāo)的測定和顯微觀察。

1.3 測定項目與方法

利用DFC450C光學(xué)顯微鏡(德國徠卡公司)觀測葉片中色素的分布；采用鹽酸甲醇法測定谷子葉片花青素的相對含量[15]；使用LI-6400XT便攜光合測定儀(美國LI-COR公司)測定谷子葉片的光合參數(shù)：氣孔導(dǎo)度(stomatal conductanc，Gs)、胞間CO2濃度(intercellular carbon dioxide concentration，Ci)、凈光合速率(net photosynthetic rate，Pn)、蒸騰速率(transpiration rate，Tr)、水分利用率(water use efficiency，WUE)；使用SPAD-502PLUS手持葉綠素儀(石家莊泛勝科技有限公司)測定谷子葉片葉綠素相對含量；采用硫代巴比妥酸法測定丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量[16]；采用酸性茚三酮法測定脯氨酸(proline，Pro)含量[17]；采用蒽酮比色法測定可溶性糖(soluble sugar，SS)含量[18]。

1.4 統(tǒng)計分析

采用Microsoft Excel 2010處理數(shù)據(jù)并作圖，利用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行相關(guān)性分析和Duncan法多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫誘導(dǎo)下綠葉和紫葉品種谷子幼苗花青素含量的變化

通過顯微鏡觀測，常溫和低溫處理下的綠葉品種幼苗均為綠色；而低溫處理8 d后，紫葉品種幼苗的葉脈和葉尖開始逐漸積累花青素而呈現(xiàn)紫色；低溫處理12 d后，紫葉品種幼苗的整個葉片均轉(zhuǎn)變?yōu)樽霞t色。如圖1所示，在顯微鏡下可清晰觀察到低溫處理的紫色品種葉片上下表皮由于積累了較多的花青素而呈紫紅色；而低溫處理的綠色品種葉片的葉脈和上下表皮中，未觀察到花青素的存在。

苗期谷子葉片中花青素含量測定結(jié)果如圖2所示，與常溫對照相比，低溫條件下YG1花青素含量減少，低溫處理8 d的JG21葉片花青素含量顯著增加。低溫處理下，紫葉品種的花青素含量均顯著高于常溫對照，說明低溫可顯著誘導(dǎo)紫葉谷子品種葉片中花青素的積累。

圖1 低溫處理12 d紫葉品種(A)和綠葉品種YG1(B)的色素分布Fig.1 Pigment distribution of purple leaf variety B13(A) and green leaf variety YG1(B) after 12 days of low temperature treatment

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Note: Different lowercase letters mean significant difference at 0.05 level. The same as following.圖2 低溫處理對綠葉和紫葉谷子葉片花青素含量的影響Fig.2 Effect of low temperature treatment on anthocyanin contents in green and purple leaves of foxtail millet

2.2 低溫誘導(dǎo)下綠葉和紫葉品種谷子幼苗相對葉綠素含量的變化

苗期谷子葉片中相對葉綠素含量如圖3所示，綠葉品種YG1在低溫處理12 d后，其相對葉綠素含量較常溫對照無顯著變化。與常溫對照相比，低溫處理的紫葉品種相對葉綠素含量總體降低，且低溫誘導(dǎo)12 d相對的葉綠素含量顯著降低。說明低溫誘導(dǎo)對綠葉品種谷子幼苗相對葉綠素含量影響較小，但可使紫葉品種谷子幼苗的相對葉綠素含量明顯降低。

2.3 低溫誘導(dǎo)對綠葉與紫葉品種谷子幼苗光合參數(shù)的影響

由表1可知，低溫處理下紫葉和綠葉品種谷子幼苗葉片的Gs均低于常溫對照。低溫處理第8天，除YG1外，綠葉品種JG21和紫葉品種谷子幼苗葉片的Ci均高于常溫對照；5個品種低溫處理第12天葉片的Ci較常溫對照無明顯變化規(guī)律。低溫處理下，綠葉品種JG21和所有紫葉品種葉片的Pn均低于常溫對照；YG1的Pn在低溫處理8 d時高于常溫對照，而在低溫處理12 d時低于常溫對照。低溫處理下紫葉品種和綠葉品種谷子幼苗葉片的Tr均低于常溫對照。除B55外，低溫處理下綠葉品種和其他紫葉品種谷子幼苗葉片的WUE均高于常溫對照?？梢?，低溫誘導(dǎo)在不同程度上影響著谷子品種的光合作用。

圖3 低溫處理對綠葉、紫葉谷子葉片相對 葉綠素含量的影響Fig.3 Effect of low temperature treatment on relative chlorophyll contents in green and purple leaves of foxtail millet

表1 低溫處理對綠葉、紫葉谷子葉片光合參數(shù)的影響Table 1 Effect of low temperature treatment on photosynthetic parameters in green and purple leaves of foxtail millet

2.4 低溫誘導(dǎo)對綠葉和紫葉品種谷子幼苗相關(guān)生理指標(biāo)的影響

2.4.1 低溫對綠葉與紫葉谷子幼苗MDA含量的影響 由圖4可知，低溫處理的綠葉品種幼苗葉片MDA含量與常溫對照相比無明顯差異；低溫處理12 d時紫葉品種幼苗葉片MDA含量均高于常溫對照，且低溫處理12 d的MDA含量顯著高于低溫處理8 d。結(jié)果表明，低溫誘導(dǎo)較長時間可使紫色品種幼苗葉片MDA含量顯著增加。

圖4 低溫處理對綠葉、紫葉谷子葉片MDA含量的影響Fig.4 Effect of low temperature treatment on MDA content in green and purple leaves of foxtail millet

2.4.2 低溫對綠葉和紫葉品種谷子幼苗Pro含量的影響 低溫處理12 d后紫葉和綠葉品種葉片Pro含量如圖5所示。常溫對照的5個品種葉片Pro含量差異較?。坏蜏卣T導(dǎo)后，5個品種的Pro含量均顯著高于常溫對照，且紫葉品種幼苗葉片Pro含量顯著高于綠葉品種。說明低溫可能通過誘導(dǎo)谷子葉片中Pro積累，從而增強(qiáng)其抵抗低溫的能力。

圖5 低溫處理對綠葉、紫葉谷子葉片Pro含量的影響Fig.5 Effect of low temperature treatment on Pro in green and purple leaves of foxtail millet

2.4.3 低溫對綠葉和紫葉品種谷子幼苗中SS含量的影響 由圖6可知，低溫處理后，5個品種葉片的SS含量均高于常溫對照，且綠葉品種SS含量顯著低于紫葉品種。結(jié)果表明，低溫可顯著誘導(dǎo)紫葉品種幼苗葉片中SS的積累。

圖6 低溫處理對綠葉、紫葉谷子葉片SS含量的影響Fig.6 Effect of low temperature treatment on SS contents in green and purple leaves of foxtail millet

2.5 低溫誘導(dǎo)下谷子幼苗中花青素含量與相關(guān)生理指標(biāo)的相關(guān)性分析

谷子葉片中花青素含量與Pn、相對葉綠素含量、MDA含量、Pro含量以及SS含量之間的相關(guān)性分析結(jié)果表明，低溫處理8 d，花青素含量與Pn呈顯著負(fù)相關(guān)，與SS、Pro含量呈極顯著正相關(guān)(表2)。低溫處理12 d，花青素含量與Pn、相對葉綠素含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與SS、MDA、Pro含量呈極顯著正相關(guān)(表3)。

3 討論

低溫脅迫會影響谷子的形態(tài)特征和生理特性[19]，嚴(yán)重時會影響谷子的生長發(fā)育和產(chǎn)量[20]，但在脅迫過程中植物可以通過調(diào)節(jié)次生代謝產(chǎn)物的積累來抵御或適應(yīng)不良環(huán)境的影響。本研究顯微觀察發(fā)現(xiàn)谷子葉片花青素主要分布在上下表皮細(xì)胞，這與Steyn等[21]對玉米葉片花青素的研究結(jié)果相似。且前期已有大量研究證明低溫誘導(dǎo)可促進(jìn)植物花青素的積累[22-24]，這也與本研究低溫處理下紫葉谷子幼苗花青素含量的測定結(jié)果一致。

表2 低溫處理8 d花青素含量與生理指標(biāo)的相關(guān)性Table 2 The correlation between anthocyanin content and physiological indexes after 8 days of low temperature treatment

表3 低溫處理12 d花青素含量與生理指標(biāo)的相關(guān)性Table 3 The correlation between anthocyanin content and physiological indexes after 12 days of low temperature treatment

研究表明植物組織中葉綠素含量及Pn與花青素含量呈負(fù)相關(guān)[25]。本研究發(fā)現(xiàn)低溫處理后紫葉谷子幼苗葉片的Pn和相對葉綠素含量均降低，而花青素含量增加。這與休眠期的小蘋果枝條隨著氣溫的降低，其葉綠素含量降低，花青素含量增加的結(jié)果一致[26]，表明紫葉谷子幼苗可通過調(diào)節(jié)光合作用、葉綠素及花青素含量的變化來提高其對低溫環(huán)境的適應(yīng)性。

MDA是細(xì)胞膜脂過氧化的產(chǎn)物之一，能間接體現(xiàn)細(xì)胞膜脂受損情況和植物的抗氧化能力。在黃瓜[27]、草莓[28]、番茄[29]等研究中證實(shí)通過抑制MDA含量的上升，可提高植株的抗寒性。但本研究中低溫脅迫的紫葉品種MDA含量顯著高于常溫對照，可能是由于低溫處理的時間不同而導(dǎo)致生理狀況有差異，也可能由于花青素在532 nm波長處也有吸收，所以導(dǎo)致紫葉谷子的MDA含量升高，今后還需通過進(jìn)一步試驗(yàn)予以驗(yàn)證。

Pro和SS是細(xì)胞內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可通過保護(hù)膜結(jié)構(gòu)的完整和調(diào)節(jié)環(huán)境與原生質(zhì)之間的滲透平衡提高植物抵御逆境的能力[30-31]。在玉米[32]、擬南芥[33]等研究中發(fā)現(xiàn)Pro和糖類大量積累可提高植株耐低溫能力。這與本研究低溫處理后，紫葉谷子幼苗花青素、Pro、SS含量均顯著提高的結(jié)果一致，且相關(guān)分析表明花青素含量與Pro含量及SS含量呈極顯著正相關(guān)，表明三者共同參與了紫葉谷子幼苗抵御低溫的生理代謝過程。而花青素糖基化可以促進(jìn)花青素的積累，使植物表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐逆性[34-35]，由此推測，低溫脅迫可能主要通過誘導(dǎo)紫葉谷子品種幼苗中SS的積累進(jìn)而使其花青素含量增加，從而提高谷子低溫耐受能力。

4 結(jié)論

通過對綠葉和紫葉谷子品種幼苗進(jìn)行低溫處理，發(fā)現(xiàn)紫葉谷子通過降低相對葉綠素含量和Pn，增加花青素含量來提高谷子對低溫環(huán)境的適應(yīng)性；SS、Pro與花青素共同參與了谷子幼苗對低溫脅迫的響應(yīng)。本研究為了解低溫脅迫花青素積累從而提高谷子的抗寒性提供了理論依據(jù)。未來可通過選育富含花青素的紫葉谷子品種，擴(kuò)大谷子在北方較寒冷地區(qū)的種植面積，為功能農(nóng)業(yè)的發(fā)展奠定基礎(chǔ)。