布魯氏桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)可以長(zhǎng)期存在的原因

耿慧娟

【摘要】目的 觀察分析布魯氏桿菌對(duì)巨噬細(xì)胞容易感染原因。方法 采用同組體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞進(jìn)行分組，并分別采用抑制劑3-MA與自噬激活劑雷帕霉素對(duì)于巨噬細(xì)胞進(jìn)行處理，并預(yù)留一組不做處理，分為巨噬細(xì)胞組、3-MA組與雷帕霉素組，處理完成后進(jìn)行綠色熒光表達(dá)的重組豬種布魯氏菌接種，并在接種完成后對(duì)于兩組細(xì)胞內(nèi)部的巨噬細(xì)胞數(shù)量與布魯氏菌數(shù)量進(jìn)行對(duì)比，觀察兩種細(xì)胞數(shù)量變化與細(xì)胞內(nèi)LC3-II的含量變化。結(jié)果 在出現(xiàn)布魯氏菌感染后，巨噬細(xì)胞發(fā)生了一定的自噬作用，雷帕霉素組巨噬細(xì)胞內(nèi)的LC3-II的含量明顯上升且高于其他組;同時(shí)雷帕霉素組內(nèi)的布魯氏菌數(shù)量明顯高于另外兩組，而在2 h、6 h、12 h、24 h四個(gè)時(shí)間段內(nèi)對(duì)比我們發(fā)現(xiàn)，各組的布魯氏菌數(shù)量均出現(xiàn)上漲的情況，且隨著時(shí)間的推移巨噬細(xì)胞內(nèi)的LC3-II的含量明顯增加。結(jié)論 在布魯氏菌感染巨噬細(xì)胞的過(guò)程中，巨噬細(xì)胞體內(nèi)的LC3-II的含量會(huì)出現(xiàn)明顯上升，提示自噬作用的發(fā)生，但是隨著時(shí)間的推移，此種自噬作用雖然能夠殺滅部分布魯氏菌，但是也會(huì)使得布魯氏菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)部出現(xiàn)增殖的情況，當(dāng)達(dá)到感染數(shù)量飽和時(shí)，巨噬細(xì)胞將無(wú)法抑制布魯氏菌的大量增殖。

【關(guān)鍵詞】布魯氏桿菌;巨噬細(xì)胞;雷帕霉素;3-MA;LC3-II;自噬作用

【中圖分類(lèi)號(hào)】R37 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】ISSN.2095.6681.2020.28..02

細(xì)胞的自噬過(guò)程是一種細(xì)胞基于自我消化與降解的高度保守行為，多是由于真核細(xì)胞生物體內(nèi)為維持機(jī)體的環(huán)境穩(wěn)定所進(jìn)行的一種過(guò)程[1]。同時(shí)自噬行為的發(fā)生往往也是機(jī)體內(nèi)部固有的免疫應(yīng)答重要標(biāo)志，在進(jìn)行自噬的過(guò)程中，會(huì)對(duì)于機(jī)體內(nèi)部細(xì)胞中存在的病原體進(jìn)行有效的清除，同時(shí)也能夠在抗原的提呈過(guò)程中起到一定的作用[2]。但是近年來(lái)有一些文獻(xiàn)指出[3]，自噬雖然能夠有效的對(duì)于外來(lái)入侵的病原體與微生物進(jìn)行有效的殺滅與清除，但是部分胞內(nèi)寄生菌與病毒往往能夠通過(guò)自身或者機(jī)體對(duì)于自噬作用進(jìn)行一定的改變或者逃避，甚至進(jìn)而在機(jī)體內(nèi)借助大量增殖，引發(fā)相關(guān)疾病。本次研究中的布魯氏菌就是一種主要寄生與巨噬細(xì)胞與胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞內(nèi)部的包內(nèi)寄生革蘭氏陰性菌種，此類(lèi)菌種能夠通過(guò)其表面的O-鏈LPS對(duì)于巨噬細(xì)胞表面脂伐產(chǎn)生一定作用，進(jìn)而進(jìn)入巨噬細(xì)胞內(nèi)部，改變內(nèi)部pH值的同時(shí)，使自身大量繁殖[4]。但是對(duì)于自噬細(xì)胞遭受相關(guān)感染的原因與在感染過(guò)程中是否存在一定的抑制布魯氏菌增長(zhǎng)的作用一直未曾明晰。本次研究中巨噬細(xì)胞進(jìn)行分組，并分別采用抑制劑3-MA與自噬激活劑雷帕霉素對(duì)于巨噬細(xì)胞進(jìn)行處理，并預(yù)留一組不做處理，觀察分析布魯氏桿菌對(duì)巨噬細(xì)胞容易感染原因，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本次研究選取的重組豬種布魯氏菌與小鼠巨噬細(xì)胞等實(shí)驗(yàn)材料均來(lái)源于外院實(shí)驗(yàn)室采購(gòu)保存，研究中所采用的相關(guān)實(shí)驗(yàn)材料有：LC3-II抗體試劑、3-MA抑制劑、自噬誘導(dǎo)劑Ra、LC3-IIELISA檢測(cè)試劑盒。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

具體實(shí)驗(yàn)方法如下：①首先進(jìn)行重組豬種布魯氏菌與布魯氏菌的培養(yǎng)，均按照1%的比例于培養(yǎng)基中接種，隨后37℃培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)完成后進(jìn)行收獲并置于冰箱內(nèi)保存與菌落計(jì)數(shù);②隨后將巨噬細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)并置于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，2×106個(gè)/孔，直至細(xì)胞長(zhǎng)至單層，隨后選擇終濃度為10nM的Ra與10nM的3-MA進(jìn)行作用，作用2h后棄細(xì)胞液并加入培養(yǎng)基，單孔100uL/孔;③將培養(yǎng)好的布魯氏菌以1∶500的比例接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并分為巨噬細(xì)胞組、3-MA組與雷帕霉素組，隨后進(jìn)行培養(yǎng)在2 h、6 h、12 h、24 h四個(gè)時(shí)間段加入蛋白酶抑制劑，并隨后進(jìn)行3此低溫凍融;④對(duì)于標(biāo)本進(jìn)行離心5 min并取上清液，進(jìn)行LC3-II含量測(cè)定。

1.3 觀察指標(biāo)

對(duì)比三組兩種細(xì)胞數(shù)量變化與細(xì)胞內(nèi)LC3-II的含量變化。

2 結(jié) 果

2.1 檢測(cè)結(jié)果一覽

在出現(xiàn)布魯氏菌感染后，巨噬細(xì)胞發(fā)生了一定的自噬作用，雷帕霉素組巨噬細(xì)胞內(nèi)的LC3-II的含量明顯上升且高于其他組;同時(shí)雷帕霉素組內(nèi)的布魯氏菌數(shù)量明顯高于另外兩組;而在2 h、6 h、12 h、24 h四個(gè)時(shí)間段內(nèi)對(duì)比我們發(fā)現(xiàn)，各組的布魯氏菌數(shù)量均出現(xiàn)上漲的情況，且隨著時(shí)間的推移巨噬細(xì)胞內(nèi)的LC3-II的含量明顯增加，見(jiàn)表1、2。

3 討 論

本次研究中所提及的布魯氏菌能夠通過(guò)一系列的策略逃避免疫監(jiān)視，從而改善巨噬細(xì)胞內(nèi)部的環(huán)境，從而使得其內(nèi)部有利于其自身的復(fù)制與增殖。國(guó)內(nèi)有研究認(rèn)為胞內(nèi)病原微生物主要能夠通過(guò)抑制自噬小體的形成或者抑制吞噬小體與溶酶體的融合來(lái)干擾機(jī)體內(nèi)部自噬作用的發(fā)生，本次研究中采用了3-MA與雷帕霉素對(duì)于巨噬細(xì)胞的自噬能力進(jìn)行了放大或者降調(diào)，且并為對(duì)于巨噬細(xì)胞的活力造成影響，同時(shí)基于自噬能力的大小對(duì)于布魯氏菌生長(zhǎng)的影響進(jìn)行了對(duì)比，發(fā)現(xiàn)了兩者之間的關(guān)聯(lián)性[5]。

同時(shí)本次研究中對(duì)于細(xì)胞內(nèi)LC3-II的表達(dá)量進(jìn)行了一定的測(cè)定，此類(lèi)指標(biāo)的含量往往是反映細(xì)胞內(nèi)部自噬作用能力的重要指標(biāo)，通過(guò)對(duì)于此指標(biāo)的測(cè)定能夠有效的測(cè)定自噬作用與布魯氏菌的關(guān)聯(lián)性[6]。我們發(fā)現(xiàn)，布魯氏菌感染后巨噬細(xì)胞內(nèi)LC3-II的表達(dá)量明顯增加，并對(duì)于巨噬細(xì)胞的自噬能力進(jìn)行了有效的增強(qiáng)，同時(shí)也導(dǎo)致了布魯氏菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)部的增殖，隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的推進(jìn)我們不難發(fā)現(xiàn)，隨著細(xì)胞內(nèi)LC3-II的表達(dá)量下降，細(xì)胞內(nèi)部的布魯氏菌數(shù)量卻一直在增加，主要是由于在細(xì)胞數(shù)量有限的情況下，當(dāng)布魯氏菌的數(shù)量飽和后，自噬細(xì)胞雖然啟動(dòng)了自噬作用，LC3-II為溶酶體降解，并使得布魯氏菌被部分殺滅，但是存留的布魯氏菌已然在其內(nèi)部大量增殖，這也解釋了布魯氏桿菌對(duì)巨噬細(xì)胞容易感染的原因所在。

綜上所述，在布魯氏菌感染巨噬細(xì)胞的過(guò)程中，巨噬細(xì)胞體內(nèi)的LC3-II的含量會(huì)出現(xiàn)明顯上升，提示自噬作用的發(fā)生，但是隨著時(shí)間的推移，此種自噬作用雖然能夠殺滅部分布魯氏菌，但是也會(huì)使得布魯氏菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)部出現(xiàn)增殖的情況，當(dāng)達(dá)到感染數(shù)量飽和時(shí)，巨噬細(xì)胞將無(wú)法抑制布魯氏菌的大量增殖。

參考文獻(xiàn)

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