陳 嫣，顧桂敏，龐載元，楊曉蓉，雷高鵬，封正娟，沈來紅，白永華，許學(xué)斌

2019年5月15日，我們從攀枝花市中心醫(yī)院1例臨床疑似膿毒血癥感染男性患者血液標(biāo)本中分離的1株腸道沙門菌(亞種Ⅰ)，通過形態(tài)學(xué)、系統(tǒng)生化和血清學(xué)鑒定為烏撒拉茂沙門菌(SalmonellaUzaramo，1,6,14,25:z4,z24:-)，經(jīng)國內(nèi)同行驗(yàn)證和沙門菌血清型數(shù)據(jù)庫比對屬國內(nèi)首次分離并報(bào)道的食源性沙門菌的致病菌型和臨床血流感染病例，病例株耐藥和分子克隆特征有別于環(huán)境水源菌株?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1病例調(diào)查 患者為50歲男性，四川省攀枝花市人。2019年5月14日上午因房顫、高血壓、高血壓心臟病至四川省攀枝花市中心醫(yī)院心血管內(nèi)科住院治療。入院體檢時(shí)體征正常，主訴午餐在院外米線店點(diǎn)食過1份米線(主料為加工熟制米線，其他葷素配料和輔食均不詳)，餐后回家取住院物品后即返回病房。15日凌晨(2點(diǎn))，患者經(jīng)過潛伏期后的急性發(fā)病期：高熱、寒顫、頭痛伴腹瀉、體溫達(dá)39.9 ℃、呼吸困難，實(shí)驗(yàn)室檢查：白細(xì)胞12.97×109/L(比值87.80%)；糞便性狀黃色水樣、紅細(xì)胞0～2個(gè)/高倍視野(HP)，白細(xì)胞30～50個(gè)/HP，隱血試驗(yàn)陽性；臨床緊急以黃連素口服和慶大霉素8萬單位肌注處置；1 h后患者體溫有所下降(39.0 ℃)、2 h后患者體溫突然升高(40 ℃)伴黃色水樣便伴里急后重、有惡心和嘔吐，臨床改施頭孢派酮/舒巴坦和泮托拉唑抑酸處置；第2 d(16日)患者體溫正常、無腹痛和里急后重、仍黃色水樣腹瀉伴惡心、嘔吐，醫(yī)囑繼續(xù)抗感染和蒙脫石散止瀉；第3 d(17日)主治醫(yī)生查房：病情好轉(zhuǎn)，白細(xì)胞7.53×109/L(比值84.10%)；第5 d(19日)患者體溫正常、無腹瀉，血培養(yǎng)報(bào)告檢出沙門菌、糞便培養(yǎng)未見沙門菌和志賀菌，臨床據(jù)此診斷為感染性腹瀉并發(fā)菌血癥，繼續(xù)以頭孢噻肟鈉聯(lián)合帕珠沙星、鹽酸小檗堿強(qiáng)化治療。第8 d(22日)患者體征正常，血常規(guī)正常，?？股兀坏? d(23日)二次血培養(yǎng)陰性。回顧性流行病調(diào)查：患者1個(gè)月內(nèi)無旅游史，家中無飼養(yǎng)寵物，直系親屬亦無不適。根據(jù)診斷病原菌的潛伏期判斷患者暴露源于不潔(或交叉污染)就餐環(huán)境，偶然攝入病原菌所致孤立、散發(fā)案例，調(diào)查中也未見后續(xù)和加工熟制米線相關(guān)病例，見圖1。

圖1 烏撒拉茂沙門菌血流感染病例的病程時(shí)間軸Fig.1 Timeline of course in cases of blood stream infection with Salmonella Uzaramo

1.2培養(yǎng)基、試劑和儀器 木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板(XLD，北京路橋技術(shù)有限公司，北京)；腸道菌發(fā)酵雙糖管和沙門菌顯色瓊脂平板(無錫市賽微生物技術(shù)有限公司，無錫)；全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)VITEK2(生物梅里埃，法國)；沙門菌H抗原誘導(dǎo)培養(yǎng)基swarmagar和60種、130種沙門菌分型診斷血清(SSI，丹麥)；沙門菌分型智能導(dǎo)航系統(tǒng)(上海景學(xué)微生物應(yīng)用技術(shù)有限責(zé)任公司，上海)；抗生素藥敏定量測試板條(CMV3AGNF，賽默飛，美國)；限制性內(nèi)切酶XbaⅠ(TAKARA，日本)；低熔點(diǎn)瓊脂糖(伯樂，美國)，以上試劑和血清等均避光置10 ℃以下保存，有效期內(nèi)使用。PCR電泳儀和脈沖凝膠電泳儀(CHEF mapper system)與凝膠成像系統(tǒng)(GEL Doc2000，伯樂公司，美國)；菌液比濁儀(生物梅里埃，法國)；抗生素自動(dòng)分液和讀數(shù)系統(tǒng)(賽默飛，美國)。

1.3脈沖場凝膠電泳(PFGE) 按照PulseNet China技術(shù)方案規(guī)定的非傷寒沙門菌PFGE-XbaⅠ標(biāo)準(zhǔn)方法，完成2株烏撒拉茂沙門菌(四川攀枝花1株臨床血源；廣西南寧1株自然水體源)的酶切分型、凝膠電泳使用BioNumerics(Version 6.0)軟件進(jìn)行聚類分析。

1.4藥敏試驗(yàn) 檢測方法參考美國國家腸道病原菌耐藥監(jiān)測系統(tǒng)(NARMS，2014年度版)更新的9類14種抗生素和操作流程(SOP)及最低抑菌濃度(MIC)判讀標(biāo)準(zhǔn)，質(zhì)控菌株為大腸埃希菌(ATCC25922)：頭孢西丁(FOX)、阿奇霉素(AZI)、氯霉素(CHL)、四環(huán)素(TET)、頭孢曲松(AXO)、阿莫斯林-克拉維酸(AUG2)、環(huán)丙沙星(CIP)、慶大霉素(GEN)、萘啶酸(NAL)、頭孢噻呋(XNL)、磺胺異噁唑(FIS)、復(fù)方新諾明(SXT)、氨芐西林(AMP)、鏈霉素(STR)。多重耐藥菌(MDR)：至少同時(shí)耐3類以上抗生素的菌株。分別測試2株不同來源的烏撒拉茂沙門菌。

1.5基因表型 根據(jù)文獻(xiàn)的耐藥和毒力基因進(jìn)行引物合成(生工，上海)、PCR擴(kuò)增和凝膠電泳檢測2株烏撒拉茂沙門菌的耐藥基因：β-內(nèi)酰胺酶類(blaTEM、blaOXA、blaSHV);磺胺類(sull、sul2、sul3、dfr);四環(huán)素類(tetA、tetB)；鏈霉素類(strA、strB、aadA);1類整合子(intll、qacEDI);毒力基因(inv4、hilA、ssaQ、ssrB、mgtC、spi4D、sopB、sciN、safB、viaB、stn、pltA)[1]。分別測試2株不同來源的烏撒拉茂沙門菌。

2 結(jié) 果

2.1菌株表型特征 菌株接種XLD經(jīng)36 ℃培養(yǎng)24 h后，菌落呈圓形、濕潤、邊緣光滑無色半透明、中心黑色；沙門菌顯色平板呈紫紅色、圓形、濕潤的菌落特征。分別挑選XLD和沙門菌顯色平板生長單個(gè)典型菌落穿刺接種腸道菌發(fā)酵雙糖管，36 ℃培養(yǎng)24 h：管1發(fā)酵甘露醇，葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，尿酶陰性；管2蔗糖、吲哚陰性，動(dòng)力、硫化氫陽性，初步生化篩選符合沙門菌屬特征。全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)鑒定為沙門菌屬，見表1。

2.2血清學(xué)鑒定 分別使用哥倫比亞斜面和抗原誘導(dǎo)培養(yǎng)基配合丹麥沙門菌分型血清診斷菌株O、H抗原，其抗原式為1,6,14,25:z4,z24:-。依據(jù)最新公布的國際沙門菌抗原表[2]判斷為：烏撒拉茂沙門菌。經(jīng)四川省疾病預(yù)防控制中心驗(yàn)證復(fù)核，結(jié)果一致、后經(jīng)上海市疾病預(yù)防控制中心許學(xué)斌教授比對復(fù)核并經(jīng)沙門菌分型智能導(dǎo)航系統(tǒng)驗(yàn)證，均鑒定為烏撒拉茂沙門菌。

2.3藥敏試驗(yàn) 本次血流分離的烏撒拉茂沙門菌除對氯霉素中度敏感、對鏈霉素耐藥外，對其他抗生素菌敏感；環(huán)境水體的烏撒拉茂沙門菌屬M(fèi)DR：對頭孢噻呋和環(huán)丙沙星中度敏感；對四環(huán)素、頭孢西丁、氯霉素、復(fù)方新諾明、磺胺異噁唑、萘啶酸、鏈霉素均耐藥，見圖2。

2.4基因表型 血流的烏撒拉茂沙門菌對5類耐藥基因除鏈霉素(strA、srtB、aad)外均為陰性，水源株對四環(huán)素(tetA、tetB)和鏈霉素(strA、strB、aad)耐藥基因陽性，耐藥基因結(jié)果和藥敏試驗(yàn)結(jié)果一致；血流烏撒拉茂沙門菌12個(gè)毒力基因均為陽性，水源株僅有6個(gè)為陽性(invA、hilA、ssaQ、ssrB、mgtC、sopB)，見圖2。

2.5PFGE 本次來自血流的人源型烏撒拉茂沙門菌和數(shù)據(jù)庫收錄來自廣西南寧市北溝湖分離的1株烏撒拉茂沙門菌通過酶切和電泳圖譜聚類分析比對，兩者的帶型存在較大差異，遺傳同源性僅有58%的相似度，見圖2。

圖2 烏撒拉茂沙門菌PFGE聚類分析(限制性內(nèi)切酶：XbaI)Fig.2 Cluster analysis based on PFGE of Salmonella Uzaramo (Restrictive Endochase:XbaI)

3 討 論

沙門菌血清型最新公布共2 659[3]。我國2006年至2014通過國際交流合作和技術(shù)引進(jìn)重新確認(rèn)人源和非人源沙門菌血清型有133個(gè)[2,4]。隨著國內(nèi)食物供應(yīng)鏈多樣化和食品安全機(jī)構(gòu)重視沙門菌風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測，將有更多非傷寒沙門菌型被報(bào)道[5]。本次自臨床血流感染病例分離和鑒定的烏撒拉茂沙門菌經(jīng)專業(yè)實(shí)驗(yàn)室復(fù)核和國內(nèi)醫(yī)學(xué)情報(bào)機(jī)構(gòu)查新證實(shí)屬國內(nèi)首次臨床報(bào)告病例?；谌蚪M測序的菌型確認(rèn)和數(shù)據(jù)分析另文報(bào)告。

本次烏撒拉茂病例源于當(dāng)?shù)匦⌒筒惋嫏C(jī)構(gòu)的食源性暴露，病菌經(jīng)口攝入經(jīng)消化道或腸內(nèi)粘膜入血致全身感染(嚴(yán)重可致膿毒血癥)，急性發(fā)作期導(dǎo)致機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)烈，所幸患者正值原發(fā)性高血壓住院期間，醫(yī)護(hù)搶救及時(shí)否則存在休克死亡風(fēng)險(xiǎn)。診療初期慶大霉素肌注的措施值得商榷，未考慮肌注入血的慶大霉素直接作用于菌體成為內(nèi)毒素致熱源(菌體抗原)刺激體溫迅速升高的應(yīng)激后果。細(xì)菌性腹瀉不用抗生素治療對預(yù)后有保護(hù)性作用的最近實(shí)踐是2012年德國EHECO104病例[6]。美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)機(jī)構(gòu)(CLSI)建議對感染沙門菌病例應(yīng)限制使用氨基糖苷類藥物。國內(nèi)臨床實(shí)驗(yàn)室普遍對沙門菌感染相關(guān)病原學(xué)與診療能力不足，是導(dǎo)致經(jīng)驗(yàn)用藥的直接原因[7]。血培養(yǎng)證實(shí)本次感染的病原為烏撒拉茂沙門菌，我們通過國內(nèi)沙門菌血清型數(shù)據(jù)庫比對證實(shí)屬國內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)的人感染沙門菌型[3,5]，1株同型菌來自廣西南寧市的湖水。兩者耐藥性不同，臨床菌株對抗生素幾乎全敏感，而水源株為MDR，提示菌株在環(huán)境中有機(jī)會(huì)獲得更強(qiáng)耐藥性；基因型和分子型提示兩者的耐藥、毒力基因和遺傳相似性較低，臨床株毒力強(qiáng)而耐藥性低，環(huán)境株表型特征則相反。該病例為充實(shí)我國現(xiàn)有非傷寒沙門菌型多樣性和臨床診療及溯源研究有重要意義。該菌型的生物學(xué)特征和臨床病例類傷寒、類膿毒血癥的侵襲性癥狀值得同行關(guān)注，因?yàn)槿巳簩Ψ侵髁魃抽T菌型可能缺少保護(hù)性抗體而變得易感，個(gè)別罹患基礎(chǔ)性疾病的患者可能增加致死率。

烏撒拉茂沙門菌首次報(bào)道于1951年[2]。感染者病例多和養(yǎng)殖寵物蛇有關(guān)[8]。兒童是罕見血清型易感者緣于家養(yǎng)寵物(龜、蜥蜴、蛇)的接觸[9]。美國是烏撒拉茂病例最多的國家：2006-2016年有13例[10]。本次患者無寵物接觸史和外出旅游史，暴露源于不潔飲食，未能對病例溯源取證調(diào)查找到烏撒拉茂的源頭使本次的結(jié)論存在局限性：無法明確米線污染源于加工過程還是環(huán)境導(dǎo)致(交叉污染)。攀枝花地區(qū)處于四川省最南部，毗鄰云貴，氣候濕熱、水系發(fā)達(dá)，烏撒拉茂本地或外來輸入均有可能，期待通過后續(xù)省級(jí)和國家致病菌監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)分享信息、追溯源頭。

近10年我國的食物供應(yīng)逐漸從傳統(tǒng)自足自給型向全球化采購轉(zhuǎn)變，加之人口老齡化因素，必然加重更多的侵襲性、非傷寒沙門菌型病例的疾病負(fù)擔(dān)[11]。我國侵襲性沙門菌血清型病例提示甲魚和寵物龜?shù)扰佬袆?dòng)物中存在高致病性克隆、對抗生素多敏感[12-13]。烏撒拉茂沙門菌是我們首次證實(shí)國內(nèi)臨床血流感染的罕見沙門菌型病例，建議從城市健康角度出發(fā)，加強(qiáng)醫(yī)防結(jié)合和傳染病生態(tài)行為宣教，結(jié)合暴發(fā)病例溯源，做好生態(tài)學(xué)監(jiān)測，防控重點(diǎn)人群降低非傷寒沙門菌疾病負(fù)擔(dān)。

利益沖突：無