錢偉鋒，山 丹，郝 攀，劉 晶，劉 群

弓形蟲病是由剛地弓形蟲感染引起的一種呈全球流行的人獸共患原蟲病。剛地弓形蟲為專性有核細(xì)胞內(nèi)寄生的原蟲，對(duì)人和動(dòng)物的危害均較大，免疫力正常的人和動(dòng)物感染后一般不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀，但免疫力低下的人和動(dòng)物感染后，后果比較嚴(yán)重，甚至?xí)鹚劳鯷1]。目前，臨床上用于治療急性弓形蟲病的藥物主要是磺胺類藥物，但該類藥物的副作用比較大，該藥只對(duì)弓形蟲速殖子有抑制效果，對(duì)弓形蟲包囊無效[1-2]。因此，尋求具有良好抑制弓形蟲增殖、且毒副作用小、價(jià)廉的抗弓形蟲藥物一直是各國(guó)學(xué)者努力的方向。

目前，在篩選抗弓形蟲藥物方面已做了廣泛的研究，某些抗生素[3-4]、除草劑(如氟啶酮、草甘膦)[5-6]、中藥(如青蒿素、黃芩)[7-8]、抗癌藥物(如紫杉醇)等[9]均被發(fā)現(xiàn)具有一定的抗弓形蟲效果。以此為基礎(chǔ)，結(jié)合藥物的種類、分子結(jié)構(gòu)、作用機(jī)理及弓形蟲自身的特點(diǎn)，本研究從除草劑、中藥、抗癌藥和其他抗寄生蟲藥中分別篩選了部分藥物，利用HFF細(xì)胞和表達(dá)綠色熒光蛋白的弓形蟲RH株(Tg-GFP)作為評(píng)價(jià)系統(tǒng)[10-11]，試圖檢測(cè)藥物的抗弓形蟲活性。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞、弓形蟲和小鼠 人包皮成纖維細(xì)胞(HFF)為美國(guó) ATCC 公司產(chǎn)品；RH 株弓形蟲由本實(shí)驗(yàn)室傳代保存；穩(wěn)定發(fā)綠色熒光弓形蟲蟲株(RH-GFP)由日本代廣大學(xué)國(guó)家原蟲病研究中心玄學(xué)南教授饋贈(zèng)，本實(shí)驗(yàn)室傳代保存。SPF 級(jí) BALB/c 小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2試劑和藥物 四甲基偶氮唑鹽(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)為Sigma公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)為GIBICO產(chǎn)品。

乙胺嘧啶、鈣離子載體 a23187和鈣離子載體螯合劑 BAPTA-AM為Sigma公司產(chǎn)品；中藥姜黃素(≥98%)和蒿甲醚(≥98%)為成都曼思特生物科技有限公司產(chǎn)品；抗球蟲藥物妥曲珠利(≥98%)和泊那珠利(≥98%)為湖北遠(yuǎn)成賽創(chuàng)科技有限公司產(chǎn)品；除草劑草甘膦由西安豐旺達(dá)生物科技有限公司生產(chǎn)，阿特拉津?yàn)閟igma 公司產(chǎn)品；注射用三氮瞇、環(huán)磷酰胺和吡喹酮片為河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；磺胺嘧啶鈉注射液為北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品；常山酮為武漢馳飛化工品有限公司產(chǎn)品。

1.3細(xì)胞和弓形蟲的復(fù)蘇和培養(yǎng) 按常規(guī)方法復(fù)蘇、培養(yǎng)HFF細(xì)胞和弓形蟲RH-GFP蟲株。

1.4藥物的細(xì)胞毒性試驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)采用MTT的方法[11]。消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HFF細(xì)胞，反復(fù)吹打制成單個(gè)細(xì)胞懸液；調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為5×105個(gè)/mL，接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，200 μL/孔，置于37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)48 h；形成單層細(xì)胞后吸棄各孔中的舊培養(yǎng)液，加入含不同濃度藥物的新培養(yǎng)液，每孔100 μL，同時(shí)設(shè)試驗(yàn)對(duì)照組(不加藥物組)和空白對(duì)照組(無細(xì)胞組)，每種藥物分別設(shè)7個(gè)濃度(見表1和表2)，每個(gè)濃度6個(gè)重復(fù)。37 ℃、5% CO2中培養(yǎng)96 h，小心用PBS沖1遍后，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解；在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD490nm下測(cè)量各孔的吸光值。以6個(gè)重復(fù)孔的平均值表示HFF細(xì)胞存活情況，細(xì)胞的存活率(%)=(OD實(shí)驗(yàn)組-OD未加細(xì)胞對(duì)照組)/(OD空白對(duì)照組-OD未加細(xì)胞對(duì)照組)×100%。以90%的細(xì)胞存活作為藥物對(duì)細(xì)胞的最大安全濃度[11]。

1.5藥物對(duì)弓形蟲增殖的影響 收集并純化弓形蟲RH-GFP速殖子，感染已被 HFF 細(xì)胞鋪滿的96孔培養(yǎng)板，每孔5×103個(gè)弓形蟲速殖子。在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng) 2 h，用 PBS 洗2遍，去掉未粘附或未入侵的蟲體，再分別加入含有不同藥物的培養(yǎng)基(見圖1A和圖1B)培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)每個(gè)帶蟲空泡內(nèi)蟲體的數(shù)量。計(jì)算方法為：隨機(jī)選取 10 個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)帶蟲空泡內(nèi)含1、2、4、8、16 個(gè)速殖子的帶蟲空泡的數(shù)量，進(jìn)而計(jì)算平均每個(gè)帶蟲空泡內(nèi)蟲體的數(shù)量。篩選對(duì)弓形蟲增殖有效的藥物，并檢測(cè)弓形蟲增殖對(duì)藥物濃度的依賴性。每孔重復(fù) 3 次，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.6藥物對(duì)弓形蟲入侵的影響 用含不同種類的藥物培養(yǎng)基懸浮RH-GFP速殖子(圖2A和圖2B)，37 ℃放置20 min；再將蟲體懸液加入已被鋪滿 HFF細(xì)胞的96 孔培養(yǎng)板中，每孔含有5×103個(gè)。37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng) 2 h，倒掉培養(yǎng)上清，加入PBS 洗2遍，去掉未粘附或未入侵的蟲體，繼續(xù)培養(yǎng)。24 h 后熒光顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)平均每個(gè)視野內(nèi)帶蟲空泡的數(shù)目。計(jì)數(shù)方法：每孔隨機(jī)挑取 10 個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)帶蟲空泡的數(shù)量，計(jì)算其平均數(shù)。選擇對(duì)弓形蟲入侵有效的藥物，并檢測(cè)弓形蟲入侵對(duì)藥物濃度的依賴性。每孔重復(fù) 3 次，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.7藥物對(duì)弓形蟲的半數(shù)抑制濃度(IC50)的檢測(cè) 將HFF細(xì)胞接種96孔培養(yǎng)板，當(dāng)細(xì)胞鋪滿孔底時(shí)，接種弓形蟲RH-GFP 速殖子200 個(gè)/孔，同時(shí)加入不同濃度和不同種類的藥物(見表3和4)，每天觀察蟲體的生長(zhǎng)情況和細(xì)胞狀態(tài)，及時(shí)更換新的含藥物的培養(yǎng)基。96 h 后用 27G針破碎細(xì)胞充分釋放蟲體，并用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)每孔蟲體的數(shù)目。每孔重復(fù) 3次，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。藥物對(duì)蟲體的抑制率(%) =(未加藥組蟲體總數(shù)-加藥組蟲體總數(shù))/未加藥組蟲體總數(shù)×100%。統(tǒng)計(jì)不同藥物的半數(shù)抑制濃度。

1.8藥物作用特點(diǎn)的初步研究 當(dāng)HFF細(xì)胞鋪滿96 孔培養(yǎng)板孔底時(shí)，加入含不同藥物的培養(yǎng)基，姜黃素終濃度為4 μg/mL、阿特拉津?yàn)?50 μg/mL、妥曲珠利為 50 μg/mL、泊那珠利為50 μg/mL、對(duì)照藥物蒿甲醚為50 μg/mL，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng) 2 h或24 h，用 PBS 洗掉孔內(nèi)藥物殘留；再分別接種RH-GFP速殖子 5×103個(gè)/孔，培養(yǎng) 2 h 后， PBS 洗去未粘附的蟲體后繼續(xù)培養(yǎng)。24 h 后在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)平均每個(gè)視野內(nèi)帶蟲空泡的數(shù)目及每個(gè)帶蟲空泡內(nèi)蟲體的數(shù)量。

將純化的RH-GFP速殖子懸浮于含有不同種類藥物培養(yǎng)基中，姜黃素終濃度為 2 μg/mL、阿特拉津?yàn)?50 μg/mL、妥曲珠利為50 μg/mL、泊那珠利為50 μg/mL、對(duì)照藥物蒿甲醚為50 μg/mL；作用 20 min 后，將蟲體懸液加入已被 HFF 細(xì)胞鋪滿的 96孔培養(yǎng)板中，每孔含有5×103個(gè)速殖子；37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng) 2 h， PBS洗掉未粘附或未入侵的蟲體，繼續(xù)培養(yǎng)。48 h 后熒光顯微鏡下觀察和計(jì)數(shù)蟲體的入侵和增殖情況。

1.9藥物體內(nèi)抗弓形蟲效果檢測(cè) 將30只5周齡的BALB/c小鼠分成6組，每組5只，其中1～5組通過腹腔注射的方式感染弓形蟲RH株速殖子100個(gè)/只小鼠，2 h后通過腹腔注射方式用不同劑量的姜黃素[0、50 mg/(kg·d)、100 mg/(kg·d)、150 mg/(kg·d)]進(jìn)行治療，磺胺嘧啶和乙胺嘧啶聯(lián)合口服用藥組(200 mg+20 mg) /(kg·d)為對(duì)照組，第6組不感染弓形蟲僅腹腔注射姜黃素[150 mg/(kg·d)]，檢測(cè)其對(duì)小鼠的毒性，連續(xù)用藥6 d。每天觀察小鼠發(fā)病情況并記錄小鼠的存活率。

2 結(jié) 果

2.1藥物對(duì)HFF細(xì)胞的毒性作用 姜黃素對(duì)HFF細(xì)胞最大安全濃度是4 μg/mL，妥曲珠利、泊那珠利、阿特拉津、環(huán)磷酰胺、吡喹酮和草甘膦分別為80 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL，對(duì)照藥物蒿甲醚對(duì)細(xì)胞無明顯毒性作用，在濃度為1000 μg/mL 時(shí)，細(xì)胞仍然生長(zhǎng)良好(見表1、表2)。

表1 姜黃素對(duì)HFF細(xì)胞毒性Tab.1 Cytotoxicity of curcumin to HFF cells

表2 不同藥物對(duì)HFF細(xì)胞毒性Tab.2 Cytotoxicity of differernt drugs to HFF cells

2.2藥物對(duì)弓形蟲增殖的影響 與對(duì)照組相比，姜黃素、妥曲珠利、泊那珠利分別在4 μg/mL、60 μg/mL、60 μg/mL時(shí)均對(duì)弓形蟲增殖有很好的抑制作用(P<0.05)。草甘膦、吡喹酮、三氮脒和環(huán)磷酰胺無效(見圖1A)。弓形蟲增殖對(duì)藥物濃度依賴性的結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的增加，弓形蟲的增殖也逐漸被抑制(圖1B)。

注：A圖為弓形蟲增殖試驗(yàn)，①代表與DMSO組(對(duì)照組)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；B圖為藥物對(duì)弓形蟲增殖的劑量效應(yīng)曲線。圖1 藥物對(duì)弓形蟲增殖的影響Fig.1 Effects of drugs on the proliferation of T. gondii

2.3藥物對(duì)弓形蟲入侵的影響 入侵試驗(yàn)結(jié)果見圖2A，只有姜黃素(4 μg/mL)能夠顯著抑制弓形蟲的入侵，鈣離子螯合劑BAPTA-AM為對(duì)照；隨著姜黃素濃度的增加，弓形蟲的入侵量逐漸減少(圖2B)。

A圖為弓形蟲入侵試驗(yàn)，①代表與DMSO組(對(duì)照組)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；B圖為藥物對(duì)弓形蟲入侵的劑量效應(yīng)曲線。圖2 藥物對(duì)弓形蟲入侵的影響Fig.2 Effects of drugs on the invision of T. gondii

2.4不同藥物對(duì)弓形蟲生長(zhǎng)的抑制作用 流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，姜黃素在體外對(duì)弓形蟲的生長(zhǎng)有很好的抑制作用，濃度為1 μg/mL時(shí)，對(duì)弓形蟲的抑制率達(dá)(67.48±3.2)% (見表3)；妥曲珠利和泊那珠利在50 μg/mL時(shí)對(duì)弓形蟲生長(zhǎng)的抑制率分別是(88.6±1.5)%和(64.8±2.5)%；阿特拉津在100 μg/mL 時(shí)對(duì)弓形蟲生長(zhǎng)的抑制率僅為 (68.9±0.4)%；蒿甲醚對(duì)弓形蟲也有很好的抑制作用，1 μg/mL 時(shí)對(duì)弓形蟲的抑制率達(dá)(51.0±2.0)%(見表4)。姜黃素、妥曲珠利、泊那珠利、阿特拉津和蒿甲醚對(duì)弓形蟲的半數(shù)抑制濃度分別是(0.7±0.2)μg/mL、(14.2±2.8)μg/mL、(16.7±4.0)μg/mL、(59.4±4.1)μg/mL、(0.86±0.2)μg/mL。

表3 不同濃度姜黃素對(duì)弓形蟲生長(zhǎng)的抑制率Tab.3 Inhibition rate of different concentrations of drugs on T. gondii growth

表4 不同濃度的妥曲珠利、泊那珠利、阿特拉津和蒿甲醚對(duì)弓形蟲生長(zhǎng)的抑制率Tab.4 Inhibition rate of T. gondii after exposure to different concentrations of toltrazuril, ponazuril, atrazine and artemether on T.gondii growth

2.5藥物作用特點(diǎn) 與含有姜黃素的培養(yǎng)基共孵育20 min的弓形蟲再接種HFF細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，蟲體的增殖受到抑制(見圖3)，與含有阿特拉津、妥曲珠利、泊那珠利或?qū)φ账幬镙锛酌训呐囵B(yǎng)基共孵育的弓形蟲增殖均未受到明顯影響，推測(cè)姜黃素是直接作用于弓形蟲。分別與含有姜黃素、阿特拉津、妥曲珠利、泊那珠利和蒿甲醚的培養(yǎng)基共孵育2 h或24 h后的HFF細(xì)胞，再接種弓形蟲時(shí)，對(duì)蟲體的入侵和增殖均沒有明顯的影響。推測(cè)藥物均不是間接通過細(xì)胞作用于蟲體。

2.6姜黃素對(duì)小鼠急性弓形蟲病的治療效果 BALB/c小鼠感染弓形蟲RH株后第6 d，姜黃素治療組和未治療組小鼠均出現(xiàn)活動(dòng)度減弱、弓背、嗜睡、被毛粗亂等現(xiàn)象，第7～9 d 內(nèi)，全部死亡，小鼠的平均存活時(shí)間是7.8 d；磺胺嘧啶和乙胺嘧啶聯(lián)合用藥組和用藥不感染組小鼠在用藥后30 d 內(nèi)均未出現(xiàn)任何臨床癥狀(圖4)。結(jié)果表明，姜黃素對(duì)小鼠急性弓形蟲病無效。

(姜黃素濃度a: 0 μg/mL，b: 2 μg/mL)圖3 與姜黃素預(yù)孵育后弓形蟲的增殖Fig.3 Replication of T. gondii after pre-treatment with curcumin

圖4 小鼠的生存曲線Fig.4 Survival curves in mice

3 討 論

姜黃素是從姜黃的根莖中提取的一種黃色的天然多酚化合物，具有抗炎、抗氧化和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的作用，且毒副作用小[12]。本研究也發(fā)現(xiàn)小鼠對(duì)姜黃素有很好的耐受。但在體外，低濃度姜黃素(5 μg/mL)即對(duì)HFF細(xì)胞產(chǎn)生明顯的毒性作用，Shahiduzzaman 等[13]也報(bào)道50 μmol/L (約18.4 μg/mL) 姜黃素可對(duì)HCT-8細(xì)胞產(chǎn)生明顯的毒性作用，推測(cè)可能是姜黃素誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生了大量的活性氧引起。

目前已有研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素對(duì)瘧原蟲、溶組織阿米巴、隱孢子蟲和新孢子蟲等均有一定的抑制作用[11-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素體外對(duì)弓形蟲入侵和增殖2個(gè)階段均有明顯的抑制作用，且均是直接作用于弓形蟲，不是通過作用于宿主細(xì)胞間接作用于蟲體。但體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)姜黃素對(duì)小鼠急性弓形蟲病無效。推測(cè)有2方面的原因，一是該藥在體內(nèi)吸收比較差，代謝快[17-18]，二是與試驗(yàn)采用了強(qiáng)毒力RH株100個(gè)速殖子感染小鼠，毒力強(qiáng)劑量大有關(guān)。對(duì)于前者，為提高姜黃素生物利用率，本研究試圖通過納米技術(shù)對(duì)藥物進(jìn)行改造，但由于藥物自身的特點(diǎn)及實(shí)驗(yàn)條件等方面的原因，最終改造失敗。對(duì)于后者，后續(xù)可嘗試采用低毒力的蟲株(成囊株)來測(cè)試藥物治療效果。蒿甲醚在體外對(duì)弓形蟲的增殖也有很好的抑制作用，與Ke等[19]的報(bào)道一致。

已有文獻(xiàn)報(bào)道，某些除草劑(氟啶酮、草甘膦)具有一定抗弓形蟲效果[5-6]。阿特拉津是一種三嗪胺類除草劑，其分子結(jié)構(gòu)和一些抗弓形蟲藥物的結(jié)構(gòu)相似，本研究發(fā)現(xiàn)其在150 μg/mL時(shí)對(duì)弓形蟲有一定的抑制作用；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該藥主要影響了弓形蟲的增殖，對(duì)蟲體的入侵沒有影響，該藥物的體內(nèi)作用效果有待進(jìn)一步研究。妥曲珠利和泊那珠利也具有三嗪環(huán)分子結(jié)構(gòu)，本研究發(fā)現(xiàn)，妥曲珠利濃度高于50 mg/L，泊那珠利高于60 μg/mL 時(shí)，即可對(duì)弓形蟲產(chǎn)生明顯的抑制作用，藥物濃度低于之前的研究報(bào)道，但不同研究報(bào)道也存在很大差異[20]，該藥物作用于弓形蟲的增殖階段，對(duì)其入侵階段均無影響。三嗪環(huán)的分子結(jié)構(gòu)可為進(jìn)一步篩選有效的抗弓形蟲藥物提供重要的參考。

弓形蟲的宿主范圍廣，感染普遍，危害大，本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素、蒿甲醚，阿特拉津、妥曲珠利和泊那珠利對(duì)弓形蟲的增殖均有一定的抑制作用，為進(jìn)一步研究有效的抗弓形蟲藥物提供重要的參考。

利益沖突：無