施少華，陳 珍，程龍飛，傅光華，傅秋玲，劉榮昌，萬春和，陳紅梅，黃 瑜

禽流感(Avian influenza，AI)是由禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)引起的一種嚴(yán)重危害家禽和人類健康的人獸共患病[1]。其病原AIV屬于正黏病毒科A型流感病毒屬。依據(jù)表面糖蛋白血凝素和神經(jīng)氨酸酶的抗原關(guān)系差異，AIV可分為16種HA亞型和9種NA亞型[1-3]。不同亞型毒株對宿主的致病力差異顯著，同一亞型病毒不同分離株的毒力也不盡相同。AIV還可通過基因突變、抗原漂移和重組極易產(chǎn)生威脅動物和人類健康的新型流感病毒。

自2013年上海和安徽暴發(fā)人感染H7N9亞型禽流感事件以來[2]，人群中已發(fā)生5波流行，共造成1 567人感染、605人死亡，其死亡率高達(dá)40%[3]。然而，在流行人H7N9亞型禽流感初期，家禽并不發(fā)病，主要原因是在病毒血凝素裂解位點(diǎn)處缺少連續(xù)的堿性氨基酸，對雞不致病或呈低致病性[4]。然而，經(jīng)過4波流行之后，H7N9亞型AIV第5波流行株的血凝素裂解位點(diǎn)插入了多個堿性氨基酸，造成對家禽的致病性增強(qiáng)[5-8]。對活禽市場監(jiān)測表明，目前雞仍是家禽中H7N9亞型禽流感病毒的主要分離宿主，水禽分離率較低[9]。對于鴨源H7N9亞型禽流感的致病機(jī)理仍不清楚。

為此，本研究以分離自活禽市場的鴨源H7N9亞型禽流感病毒感染SPF雞，評價其對雞的致病性，同時通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析鴨源H7N9亞型禽流感病毒對雞的致病機(jī)理，結(jié)果表明SPF雞感染鴨源H7N9亞型病毒后，其免疫相關(guān)基因表達(dá)明顯增強(qiáng)。在Toll-like信號通路中，TLR4在MD-2的協(xié)助下被激活，隨后依賴MYD88途徑激活下游的IRF5，繼而引起CCL4、IL-6的表達(dá)。同時，NLRP3炎癥體在H7N9亞型病毒感染過程中也發(fā)揮重要作用。

1 材料與方法

1.1毒株和實(shí)驗(yàn)動物 鴨源H7N9亞型禽流感病毒16221株 (H7N9-16221株)，由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物生物安全三級實(shí)驗(yàn)室(ABSL-3)分離自活禽市場，病毒滴度為8.5LogEID50/mL；試驗(yàn)用雞20只，2周齡，購自濟(jì)南斯帕法斯家禽有限公司，正常動物房飼養(yǎng)。

1.2動物致病性試驗(yàn) 參照世界動物衛(wèi)生組織OIE標(biāo)準(zhǔn)[10]，在ABSL-3生物安全型禽負(fù)壓隔離器中進(jìn)行靜脈致病指數(shù)(Intravenous pathoginicity index，IVPI)測定。當(dāng)IVPI值大于1.2時，即判定為高致病性AIV。

取3周齡SPF雞，隨機(jī)分成2組，即感染組和對照組，每組10只，在生物安全型禽負(fù)壓隔離器中每只感染組雞經(jīng)鼻腔接種106EID50H7N9-16221株，0.1 mL/只；對照組接種等體積滅菌PBS，0.1 mL/只，觀察3 d。收集感染后3 d內(nèi)死亡雞或第3 d撲殺雞的心、肝、脾、肺、腎、腦和胰，勻漿后測定每個樣品的病毒載量。

1.3高通量測序用SPF雞肺臟的采集 取2周齡SPF雞，隨機(jī)分成2組，即感染組和對照組，每組3只。以滴鼻的方式接種106EID50/0.1 mL H7N9-16221株，對照組SPF雞接種等體積的PBS。于感染后24 h撲殺所有實(shí)驗(yàn)雞，快速采集每只雞的肺臟，儲于液氮凍存后送至上海伯豪生物技術(shù)有限公司進(jìn)行高通量測序。

1.4RNA的抽提與純化 采用RNAiso Plus Total RNA extraction reagent(Takara)對樣品進(jìn)行總RNA的抽提，抽提所得總RNA經(jīng)Agilent Bioanalyzer 2100電泳質(zhì)檢合格后使用RNeasy micro kit和RNase-Free DNase Set進(jìn)行純化，經(jīng)NanoDrop ND2000分光光度計(jì)及Agilent Bioanalyzer 2100進(jìn)行質(zhì)檢備用。

1.5高通量測序 將純化后的mRNA片段化，隨后進(jìn)行第一條cDNA鏈的合成及第2條cDNA鏈的合成，末端補(bǔ)平后在3′末端加A，經(jīng)連接接頭、富集等步驟后完成測序樣本文庫的構(gòu)建，最后應(yīng)用Illumina X ten測序。

1.6 測序結(jié)果的分析

1.6.1差異表達(dá)基因的篩選 應(yīng)用edgeR[11]進(jìn)行樣本間差異基因分析，得出Pvalue后進(jìn)行多重假設(shè)檢驗(yàn)校正，通過控制FDR(false discovery rate)來決定Pvalue的閾值[12-13]，校正后的Pvalue即Qvalue。同時，我們根據(jù)FPKM(fragments per kilobase of exon model per million mapped reads)值計(jì)算差異表達(dá)倍數(shù)，即Fold-change。差異基因篩選條件如下：Qvalue<0.05且Fold-change≥2。

1.6.2差異表達(dá)基因的GO和KEGG分析 利用Gene Ontology(簡稱GO)數(shù)據(jù)庫，可將基因按照它們參與的生物過程(biological process)、細(xì)胞成分(cellular component)和分子功能(molecular function)等對相應(yīng)的差異基因數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。計(jì)算得到的Pvalue通過多重假設(shè)檢驗(yàn)校正之后，以Qvalue<0.05為閾值，滿足此條件的GO term定義為在差異表達(dá)基因中顯著富集的GO term。與GO富集相同的原理對差異基因進(jìn)行KEGG (Kyoto encyclopedia of genes and genomes) pathway富集分析。

1.7細(xì)胞因子的qPCR驗(yàn)證 為了驗(yàn)證病毒感染肺部基因差異表達(dá)的測序結(jié)果，選取差異表達(dá)的基因進(jìn)行熒光定量qPCR驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)以β-actin基因?yàn)楣芗一?表1)，目的基因的相對表達(dá)水平按2-△△CT公式計(jì)算[14]，△△CT=(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)感染組-(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)空白對照組。用SPSS 19.0軟件進(jìn)行生物統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，通過雙側(cè)t檢驗(yàn)方法進(jìn)行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 檢測細(xì)胞因子的qPCR引物Tab.1 Primers for qPCR to detect cytokines

2 結(jié) 果

2.1鴨源H7N9病毒對SPF雞的致病性 通過6周齡SPF雞測定鴨源H7N9病毒的IVPI，結(jié)果顯示H7N9-16221株的IVPI為2.8，高于高致病性閾值1.2。

以106EID50的H7N9-16221株病毒通過滴鼻方式攻擊3周齡SPF雞，于接種后第2 d開始發(fā)病，并于第3 d出現(xiàn)死亡，采集所有實(shí)驗(yàn)雞的組織臟器并進(jìn)行病毒滴定。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)雞感染H7N9-16221株在肺、肝等多個組織均有病毒分布，其中以肺臟病毒滴度最高，達(dá)5.02 Log10EID50(表2)。

表2 鴨源H7N9-16221株病毒在SPF雞組織臟器的復(fù)制Tab.2 Replication of duck-origin H7N9-16221 virus in SPF chickens

2.2高通量測序數(shù)據(jù)質(zhì)量檢測 將純化后的mRNA片段化以構(gòu)建測序樣本文庫，應(yīng)用Illumina X ten對所構(gòu)建的測序樣本文庫的進(jìn)行測定，通過對測序獲得的原始堿基和原始序列進(jìn)行質(zhì)量過濾，從感染組3只雞肺臟樣品中分別獲得8.67、7.93、7.68 G堿基數(shù)，對照組3只雞肺臟樣品中分別獲得7.84、6.83、8.29 G堿基數(shù)，堿基質(zhì)量大于20(Q20)的比例均>95%，GEO數(shù)據(jù)庫登錄號為GSE151661。感染組3只雞肺臟樣品中獲得raw reads分別為57、52、51 M條，經(jīng)篩選后獲得clean reads分別為55、50、48 M條；對照組3只雞肺臟樣品中獲得raw reads分別為52、55、45 M條，經(jīng)篩選后獲得clean reads 49、52、43 M條。

2.3轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá) 基因篩選與對照組相比，感染組得到差異表達(dá)基因740個，其中上調(diào)基因有602個，下調(diào)基因有138個。對差異表達(dá)基因進(jìn)行可視化分析，其中-Log10(FDR)>1差異表達(dá)基因(圖1)。

圖1 差異基因Heatmap圖Fig.1 Heatmap of differentially expressed genes

比對參考基因組數(shù)據(jù)庫，與對照組相比，所獲得的感染組前10位上調(diào)基因分別為：IRG1、RSAD2、CCL19、STAT1、OLFML1、CMTR1、C1S、MDA5、OASL和MPEG1；前10位下調(diào)基因分別為：PRSS35、otokeratin、FBN2、COL10A1、NYAP2、DBN1、NELL1、CPXM1、CAPSL和SCARA3(表3)。

表3 感染后24 h Top10差異表達(dá)基因Tab.3 Top10 differentially expressed genes at 24 h after infection

2.4轉(zhuǎn)錄組GO數(shù)據(jù)庫注釋及顯著性富集分析 對差異基因進(jìn)行GO功能注釋，病毒感染后有204個顯著富集的GO條目，其中有186個GO條目涉及生物學(xué)過程，有7個GO條目涉及細(xì)胞成分，有10個GO 條目涉及分子功能。在涉及生物學(xué)過程的差異基因GO條目絕大部分與免疫應(yīng)答有關(guān)，如免疫反應(yīng)、免疫系統(tǒng)過程，天然免疫反應(yīng)、免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)等；在涉及分子功能的差異基因GO條目與炎癥反應(yīng)有關(guān)，如趨化因子活性、趨化因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合等(表4、圖2)。

圖2 Top30 GO富集Fig.2 Top30 GO enrichment

表4 感染后24 h Top10差異表達(dá)GO富集Tab.4 Top10 differental expression enrichment of GO at 24 h after infection

2.5轉(zhuǎn)錄組KEGG數(shù)據(jù)庫注釋及顯著性富集分析 將差異表達(dá)基因在KEGG數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對注釋及富集分析，有7個通路得以顯著富集，如 Toll-like信號通路、NOD-like信號通路和凋亡等，與對照組相比Toll-like 受體信號通路有11個基因的表達(dá)上調(diào)，分別是IL-6、TLR4、PIK3、IRF7、MD-2、IRF5、MYD88、CD86、STAT1、TLR2和CCL4。NOD-like受體信號通路有7個基因的表達(dá)上調(diào)，分別是IRF7、CTSB、P2RX7、CYBB、PSTPIP1、HSP90AA1和NAMPT。凋亡信號通路有10個基因的表達(dá)上調(diào)，分別是PIK3、CTSB、CTSC、TNFSF6、PRF1、PMAIP1、GADD45G、CASP7、APAF1和CTSS，1個基因下調(diào)，為CAPN2(表5)。

表5 感染后24 h KEGG差異富集通路Tab.5 KEGG differential enrichment pathway at 24 h after infection

2.6差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證 為了驗(yàn)證從轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中獲得差異基因結(jié)果的可靠性，我們對IL-6、STAT1、OASL、MDA5、MPPEG1、OLFML1、COL10A1等基因進(jìn)行qRT-PCR檢測，比較分析qRT-PCR檢測與高通量測序數(shù)據(jù)，二者基本一致，表明轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的可靠性(圖3)。

圖3 定量RT-PCR與高通量測序結(jié)果的比較Fig.3 Comparison of quantitative RT-PCR and high throughout sequencing

3 討 論

2013年3月，位于我國華東地區(qū)的上海市和安徽省兩地相繼報道了H7N9亞型禽流感病毒感染人病例，引起全世界高度關(guān)注和恐慌。在2013年3月至2016年9月，共發(fā)生4波流行，造成798人感染，病死率達(dá)40.6%[3]。其元兇H7N9亞型禽流感病毒是鴨源H7N3亞型、雞源H10N9亞型和禽源H9N2亞型的三元重配病毒[18-19]，其血凝素裂解位點(diǎn)處缺少連續(xù)的堿性氨基酸，對雞不致病或呈低致病性[20]，因此家禽僅為人H7N9病毒的基因供體，感染后不表現(xiàn)臨床癥狀或癥狀比較溫和。然而，在第5次流行高峰期間，首次在人感染H7N9病例中

分離到具有強(qiáng)毒裂解位點(diǎn)的毒株(TW1)[3, 21-22]，提示對雞呈高致病性。目前鴨感染H7N9亞型禽流感病例較少。因此有必要對鴨源H7N9亞型禽流感病毒進(jìn)行研究。本研究以鴨源H7N9亞型禽流感病毒感染SPF雞，其IVPI為2.8，為強(qiáng)毒株，通過對病毒感染的組織分布進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，病毒主要以肺部感染為主。因此，本研究選擇肺臟作為鴨源H7N9亞型禽流感病毒感染SPF雞轉(zhuǎn)錄組分析的研究對象。

在轉(zhuǎn)錄組的高通量測序技術(shù)中，RNA-seq具有通量高、可重復(fù)性好、檢測范圍寬、定量準(zhǔn)確等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、病毒、寄生蟲等病原感染動物的轉(zhuǎn)錄組研究。轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中測序獲得的Clean Read數(shù)量和質(zhì)量及mapped到參考基因組的比對率對后續(xù)數(shù)據(jù)分析有重要的影響，本研究利用RNA-seq高通量測序技術(shù)對H7N9亞型AIV感染SPF雞的肺臟轉(zhuǎn)錄組研究發(fā)現(xiàn)，從感染組和對照組雞肺臟樣品中均可獲得大于6 G堿基數(shù)，堿基質(zhì)量大于20(Q20)的比例均>95%。每個樣品大于50 M條的raw reads，經(jīng)篩選后獲得clean reads 40 M條，結(jié)果符合預(yù)期質(zhì)量要求，表明本研究所獲得的測序數(shù)據(jù)可用于后續(xù)分析。

本研究從感染組得到差異表達(dá)基因740個，其中上調(diào)基因有602個，下調(diào)基因有138個，表明流感病毒感染后機(jī)體細(xì)胞發(fā)生劇烈的細(xì)胞反應(yīng)，提示我們分離的鴨源H7N9亞型禽流感病毒有可能像其它高致病性禽流感病毒一樣產(chǎn)生過激的細(xì)胞反應(yīng)，引起“細(xì)胞因子風(fēng)暴”[23-25]。為了確定差異表達(dá)基因涉及的信號通路，我們通過GO和KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行富集分析。對差異基因進(jìn)行GO功能注釋，病毒感染后有204個顯著富集的GO條目，其中富集差異最為顯著的10個GO均涉及生物過程，差異基因GO條目絕大部分與免疫應(yīng)答，如I型干擾素生物合成過程、IFN-β反應(yīng)、Th1免疫反應(yīng)等。KEGG分析發(fā)現(xiàn)，SPF雞感染H7N9亞型禽流感病毒后出現(xiàn)免疫相關(guān)的信號通路富集。

天然免疫系統(tǒng)是機(jī)體的第一道防線，是宿主抵御病原體侵害的一個高度保守的細(xì)胞信號機(jī)制[26]。宿主細(xì)胞通過一種可識別病原相關(guān)的分子模式(PAMP)的模式識別受體(PRR)來檢測感染性病毒的存在，從而啟動誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子和干擾素信號的級聯(lián)反應(yīng)，最終發(fā)揮抗病毒作用[26-27]。目前已鑒定出3類病毒感染的PRR：RIG-I樣受體(RLR)，Toll樣受體(TLR)和NOD-樣受體(NLR)[28]。在流感致病過程中，TLR可導(dǎo)致I型IFN和促炎細(xì)胞因子(IL-6、IL-12)、趨化因子(CCL4)和共刺激因子(CD86)的表達(dá)，從而限制病毒復(fù)制和傳播，誘導(dǎo)組織發(fā)生炎癥反應(yīng)，激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生先天性和獲得性免疫反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，TLR4信號通路的相關(guān)因子顯著富集。從信號通路可推斷，病毒感染后，在MD-2的協(xié)助下，TLR4被激活，隨后依賴MYD88途徑激活下游的IRF5，繼而引起CCL4、IL-6的表達(dá)。

NOD樣受體(NLR)是固有免疫系統(tǒng)中的一種模式識別受體。當(dāng)識別危險信號后, NLR家族成員與PYHIN(pyrin and HIN domain)家族成員組成的胞漿多蛋白復(fù)合物(炎癥小體)，被多種病原相關(guān)分子模式或損傷相關(guān)分子模式激活后引起級聯(lián)反應(yīng)。目前已發(fā)現(xiàn)多種炎癥小體，如NLRP1、NLRP3、NLRC4和AIM2炎癥小體。其中，NLRP3炎癥小體在流感病毒感染中扮演著重要的角色。在沒有內(nèi)外源刺激因素作用的情況下，NLRP3的LRR結(jié)構(gòu)域通過與泛素連接酶相關(guān)蛋白SGT-1和熱休克蛋白HSP90結(jié)合，處于自我抑制狀態(tài)[29]。NLRP3被激活后，其PYD區(qū)域與ASC的PYD區(qū)域結(jié)構(gòu)相結(jié)合，招募Caspase-1前體，裝配成NLRP3炎癥小體，介導(dǎo)Caspase-1的活化、促炎癥因子IL-1β、IL-18和IL-22的成熟與分泌[30]。本研究中，CTSB、PSTPIP1、HSP90AA1的基因表達(dá)均顯著上調(diào)，同樣也說明了H7N9亞型病毒也可通過NLRP3炎癥體發(fā)揮作用[31]。

綜上，通過試驗(yàn)結(jié)果可推測，鴨源H7N9病毒感染SPF雞后，誘導(dǎo)強(qiáng)烈的天然免疫，病毒感染后，在MD-2的協(xié)助下，TLR4信號通路被激活，隨后依賴MYD88途徑激活下游的IRF5，繼而引起CCL4、IL-6的表達(dá)；同時，NLP3炎癥體在抗病毒過程中發(fā)揮著重要作用。但其機(jī)制仍需要進(jìn)一步開展實(shí)驗(yàn)研究加以證明。

利益沖突：無