侯偉麗，馬蘭

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院老年病科，哈爾濱 150001)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種以記憶衰退和認(rèn)知功能下降為特征的神經(jīng)退行性疾病，其病理主要表現(xiàn)為淀粉樣斑塊沉積、神經(jīng)元變性、突觸損傷等。AD發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，可能有多種因素參與，如炎癥、氧化應(yīng)激、線粒體障礙、基因突變、環(huán)境等。研究發(fā)現(xiàn)microRNA功能異常與AD的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。

1 microRNA通過抑制靶mRNA調(diào)控基因表達(dá)

microRNA(miRNA)[1,2]是一種內(nèi)源性非編碼基因，在高等真核生物中起著轉(zhuǎn)錄后調(diào)控和基因信息表達(dá)的作用，主要作用模式是通過識(shí)別結(jié)合靶信使RNA(mRNA)的3′-untranslation region (UTR)上的互補(bǔ)核糖核苷酸序列抑制mRNA的表達(dá)， 參與調(diào)控。

每一個(gè)miRNA[3]都有可能同時(shí)對(duì)應(yīng)數(shù)百個(gè)基因編碼的mRNA，大多數(shù)miRNA表現(xiàn)出嚴(yán)格調(diào)控的表達(dá)模式，這種表達(dá)模式通常是組織特異性的，甚至是細(xì)胞特異性的，強(qiáng)調(diào)了miRNA在特定基因表達(dá)模式的時(shí)間、空間和發(fā)育階段中的重要性。miRNA作為介導(dǎo)基因表達(dá)的mRNA的負(fù)調(diào)控因子而發(fā)揮作用，因此，上調(diào)miRNA可能會(huì)下調(diào)它們的靶mRNA，并下調(diào)這些mRNA編碼的遺傳信息的表達(dá)。神經(jīng)系統(tǒng)中的miRNA形成一個(gè)復(fù)雜的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，不僅包含正常的生理調(diào)控信息，還包含豐富的與神經(jīng)退行性疾病(如AD)相關(guān)的神經(jīng)生物學(xué)信息。后文從miRNA調(diào)節(jié)Aβ蛋白生成、參與突觸損傷及AD病理改變影響miRNA正常表達(dá)3個(gè)方面闡述miRNA與AD的相互關(guān)系。

1.1 microRNA調(diào)節(jié)Aβ蛋白的生成

Aβ淀粉樣斑塊沉積在神經(jīng)組織周圍是AD的病理特征之一，淀粉樣蛋白前體蛋白(amyloid protein precursor，APP)是Aβ的前體蛋白，BACE1 (β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme)是將APP裂解為Aβ的一種裂解酶，目前，大多數(shù)研究表明miRNA主要通過與BACE1的 mRNA 3′-UTR結(jié)合來調(diào)控BACE1[4]。Lei等[5]研究發(fā)現(xiàn)miR-29c在AD患者體內(nèi)明顯下調(diào)，并在轉(zhuǎn)染miR-29c的人類神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-29c與BACE1 mRNA的3′-UTR結(jié)合使BACE1表達(dá)增加，BACE1表達(dá)增加直接促成Aβ生成。Long等[6]發(fā)現(xiàn)，從AD患者分離的腦標(biāo)本中miR-339-5p水平顯著降低，BACE1mRNA的 3′-UTR有2個(gè)miR-339-5p結(jié)合位點(diǎn)，使用miR-339-5p模擬類似物可以顯著抑制人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞和人腦原代培養(yǎng)物中BACE1蛋白的表達(dá)。Wang等[7]發(fā)現(xiàn)miR-200a-3p通過3個(gè)自身非翻譯區(qū)調(diào)節(jié)BACE和蛋白激酶cAMP-活化催化β亞基(PRKACB)的蛋白易位，從而減少Aβ和P-tau蛋白的產(chǎn)生，并且在體外培養(yǎng)細(xì)胞中miR-200a-3p的保護(hù)功能被過度表達(dá)的BACE1或PRKACB逆轉(zhuǎn)，認(rèn)為miR-200a-3p可能通過BACE1或PRKACB參與AD病理過程。miRNA還可與mRNA 3′-UTR結(jié)合，調(diào)節(jié)APP的表達(dá)。Liu等[8]測(cè)量了APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠樣本、輕度認(rèn)知功能障礙(mild cognitive impairment，MCI)患者及AD患者腦脊液(cerebrospinal fluid，CSF)中的miR-193b，發(fā)現(xiàn)miR-193b過表達(dá)可抑制APP的mRNA和蛋白表達(dá),使用miR-193b的低聚核苷酸抑制劑可誘導(dǎo)APP上調(diào)，并且發(fā)現(xiàn)AD患者及MCI患者CSF中miR-193b均下降，在AD患者CSF中miR-193b和Aβ42呈負(fù)相關(guān)。另外，Lu等[9]發(fā)現(xiàn)在 APP/PS1小鼠中miR-138通過抑制ADAM10(一種解離素和金屬蛋白酶)的表達(dá)，促進(jìn)β淀粉樣蛋白(Aβ)生成，誘導(dǎo)突觸功能、學(xué)習(xí)記憶功能下降，而過表達(dá)的sirtuin 1(Sirt1)可改善miR-138對(duì)ADAM10的抑制。同時(shí)實(shí)驗(yàn)者發(fā)現(xiàn)在Aβ-oligomer-treated N2a細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中circRNAHDAC9 (circHDAC9)和miR-138兩者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，CircHDAC9充當(dāng)了miR-138的緩沖體，減少了miR-138的表達(dá)，并扭轉(zhuǎn)了sirtuin1和Aβ過表達(dá)的局面，并且發(fā)現(xiàn)AD患者和MCI患者血清中circHDAC9均降低。

1.2 microRNA參與突觸損傷

突觸損傷是AD的另一病理改變，研究表明突觸后蛋白SHANK3細(xì)胞骨架存在缺陷可導(dǎo)致突觸結(jié)構(gòu)和功能的破壞，可能至少部分是通過誘導(dǎo)核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)調(diào)控的促炎miR(如miR-34a)介導(dǎo)的。Zhao等[10]研究發(fā)現(xiàn)散發(fā)AD患者腦部上顳葉上皮層內(nèi)miR-34a顯著上調(diào)，突觸后元件富含脯氨酸的SH3和多錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域SHANK3蛋白顯著下調(diào)。生物信息學(xué)、microRNA芯片分析和SHANK3-mRNA-3′UTR熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)證實(shí)了miRNA-34a在調(diào)控人類神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞SHANK3表達(dá)中的重要性。另外突觸后支架蛋白SHANK3和TSPAN[11,12]蛋白水平下調(diào)可能共同導(dǎo)致神經(jīng)精神疾病的神經(jīng)退行。TSPAN蛋白[13,14]是四聚體蛋白(TSPAN)超家族，通常參與組織細(xì)胞間的相互作用、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、區(qū)隔以及復(fù)雜蛋白網(wǎng)絡(luò)的形成，稱為“四聚體蛋白網(wǎng)”，具有神經(jīng)活動(dòng)依賴性突觸形成和可塑性的功能，并參與神經(jīng)和視網(wǎng)膜變性。Jaber等[11]研究散發(fā)性AD海馬CA1 RNA池，提出了AD中miRNA-mRNA偶聯(lián)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的改變，發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-34a和miR-146a參與了SHANK3和TSPAN-12的下調(diào)。Zhao等[15]發(fā)現(xiàn)NF-κB敏感的miR-34a可能通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞TREM2蛋白表達(dá)的下調(diào)而誘導(dǎo)炎癥性神經(jīng)變性。四聚體蛋白(TSPAN)[16]還可以調(diào)節(jié)Aβ前體蛋白(APP)的降解。

1.3 AD病理改變影響microRNA正常表達(dá)

Sierksma的團(tuán)隊(duì)[17]檢測(cè)APPtg (APPswe/PS1L166P)小鼠和TAUtg (THY-Tau22)小鼠海馬區(qū)的miRNA變化，發(fā)現(xiàn)6種miRNA (miR-10a-5p,miR-142a-5p, miR-146a-5p,miR-155-5p,miR-211-5p,miR-455-5p)都上調(diào)，并且其中4個(gè)(miR-142a-5p、miR-146a-5p、miR-155-5p和miR-455-5p)在AD患者腦組織海馬區(qū)也發(fā)生改變，然而，在其野生型幼鼠(APPwt和TAUwt)中上調(diào)這些miRNA并不會(huì)引起與AD相關(guān)的認(rèn)知障礙，說明Aβ和tau蛋白會(huì)干擾神經(jīng)中某些miRNA的正常調(diào)控功能。大量研究[18,19]分析了AD患者大腦中miRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)海馬、額葉皮質(zhì)、小腦、腦脊液等腦組織中miRNA表達(dá)水平會(huì)隨著AD的進(jìn)展而改變。

2 體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)調(diào)節(jié)microRNA表達(dá)可以改善認(rèn)知損傷

Duan等[20]在AD小鼠模型中發(fā)現(xiàn)miR-25通過核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2)信號(hào)通路下調(diào)Krtippel樣轉(zhuǎn)錄因子(krtippel-like transcription factor，KLF2)，加重海馬神經(jīng)元損傷，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但同時(shí)miRNA也可以具有保護(hù)神經(jīng)組織的作用，如Yang等[21]對(duì)注射Aβ25-35的模擬AD大鼠進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)miR-196a下調(diào)，向AD大鼠注射miR-196a可以改善AD大鼠的認(rèn)知功能障礙，并且上調(diào)的miR-196a通過下調(diào)LRIG3激活PI3K/Akt通路，減輕海馬組織神經(jīng)元損傷，改善AD的認(rèn)知損傷。Kumar等[22]通過熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)證實(shí)了miR-455-3p與APP基因的3′UTR結(jié)合，繼而在轉(zhuǎn)染miR-455-3p的突變APP細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)突觸基因的mRNA和蛋白水平均升高，線粒體數(shù)量減少，但線粒體長(zhǎng)度增加，并觀察到miR-455-3p可降低線粒體分裂蛋白(DRP1和FIS1)的表達(dá)，增加融合蛋白(OPA1、Mfn1和Mfn2)的表達(dá)?；谶@些觀察，作者猜想miR-455-3p可以調(diào)控APP，并對(duì)突變的APP誘導(dǎo)的AD線粒體和突觸異常具有保護(hù)作用。

Zhao的研究組[15]在原代培養(yǎng)的應(yīng)激性人類神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(human neuroglial cell，HNG細(xì)胞)中發(fā)現(xiàn)TREM2下調(diào)，添加一種AM-34a可以將TREM2的下調(diào)挽救至穩(wěn)態(tài)水平，抗miRNA(adeno-associated viral vector, AM)在提高我們對(duì)炎癥性神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)和制定有效的基于AM的治療策略方面的潛力可能是巨大的。在散發(fā)性AD患者新皮質(zhì)和應(yīng)激性HNG細(xì)胞原代共培養(yǎng)中[23-25]，促炎miR-146a均顯著上調(diào)，在初步實(shí)驗(yàn)中，利用病毒載體傳遞(adeno-associated viral vector, AVV)系統(tǒng)進(jìn)行抗miR-146a(AM-146a)的治療策略，可以提高衰老5xFAD AD模型小鼠的認(rèn)知功能。

3 通過外泌體可以提高microRNA的檢測(cè)率

研究發(fā)現(xiàn)外泌體可以保留神經(jīng)細(xì)胞分泌的形態(tài)學(xué)，其中包括分泌的miRNA，故通過外泌體可以提高miRNA的檢測(cè)率，為進(jìn)一步研究提供便利。外泌體[26,27]是一種從所有細(xì)胞中脫落的內(nèi)胚體衍生的小泡，含有原細(xì)胞的各種分子成分，包括脂類、蛋白質(zhì)和核酸，這些成分隨細(xì)胞的健康狀況和病理狀態(tài)而變化。神經(jīng)細(xì)胞[26]能夠在生理和病理?xiàng)l件下分泌外泌體，其中核酸和蛋白質(zhì)的變化能夠作為某種狀態(tài)的功能表征，外泌體可以保留神經(jīng)細(xì)胞分泌的形態(tài)學(xué)這一特征使得外泌體介導(dǎo)的miRNA成為AD的一個(gè)重要的生物標(biāo)志物。神經(jīng)系統(tǒng)源性外泌體(neuronal derived-exosomes，NDEs)[28]可通過免疫吸附方法分離并使用ELISA從血漿中測(cè)得。這種對(duì)外泌體亞群的創(chuàng)新性分離[29]引起人們對(duì)使用NDEs作為AD等神經(jīng)退行性疾病的生物標(biāo)志物的興趣，從血漿樣本中富集NDEs的能力使得分析與AD發(fā)病機(jī)制相關(guān)的多種神經(jīng)遞質(zhì)蛋白成為可能。

Goetzl等[30]2016年通過連續(xù)沉淀和免疫化學(xué)吸附方法，發(fā)現(xiàn)人血漿中富集的星形膠質(zhì)細(xì)胞衍生外泌體(astrocytes derived-exosomes，ADEs)含有比血漿NDEs高得多的星形膠質(zhì)細(xì)胞生物標(biāo)志物——谷氨酰胺合成酶和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)，并發(fā)現(xiàn)AD患者ADEs中BACE-1和sAPPβ水平顯著高于對(duì)照組；2018年發(fā)現(xiàn)AD患者A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞來源的ADEs中C4b和Bb濃度的升高[31]，結(jié)果支持A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞來源的經(jīng)典和替代炎性補(bǔ)體途徑參與C3b和C5b-C9 TCC的產(chǎn)生，表明A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞可能產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，并通過ADEs將其傳遞給其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)細(xì)胞，導(dǎo)致了神經(jīng)元和突觸的損害。Fernandes等[32]證明，轉(zhuǎn)染瑞典突變體APP695 (SHSwe)的SH-SY5Y細(xì)胞顯著表達(dá)炎癥標(biāo)志物以及APP和Aβ1-40，APP和Aβ1-40引起的炎癥介質(zhì)會(huì)觸發(fā)時(shí)間依賴性的小膠質(zhì)細(xì)胞活化表型,最終導(dǎo)致miR-21外泌體穿梭。這項(xiàng)工作有助于更深入地了解不同類型細(xì)胞的外泌體都可能作為AD神經(jīng)炎癥介質(zhì)的載體，同時(shí)也揭示外泌體是神經(jīng)炎癥的參與者和影響者之一。

4 結(jié) 語

microRNA在AD的調(diào)控機(jī)制研究更細(xì)化、更深入，調(diào)控通路愈加明朗，外泌體作為miRNA載體為血液檢測(cè)miRNA提供更精確結(jié)果，為血液檢測(cè)AD生物標(biāo)志物提供平臺(tái)。隨著對(duì)外泌體介導(dǎo)的神經(jīng)通路理解的加深，利用外泌體將某些治療性核酸轉(zhuǎn)運(yùn)到受體細(xì)胞可能成為AD的一種潛在治療途徑。因microRNA有嚴(yán)格調(diào)控表達(dá)模式，未來可以探索在AD不同病程階段(如無癥狀期、輕度認(rèn)知功能障礙期及癡呆期)、大腦不同部位miRNA表達(dá)濃度的改變以及相應(yīng)的調(diào)節(jié)通路是什么，只是這將是龐大、復(fù)雜、連續(xù)且困難的工作，科學(xué)探索任重道遠(yuǎn)，期待新的發(fā)現(xiàn)。