羊棲菜多糖對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化及其相關(guān)基因表達(dá)的影響※

●楊旭東 石 杰 楊驕霞 王桂云 宋高臣 張 杰▲

脂肪細(xì)胞是人體中重要的能量?jī)?chǔ)存庫(kù)，現(xiàn)代研究表明，脂肪細(xì)胞的數(shù)目增加、過(guò)度分化及代謝紊亂，與糖尿病、冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化、腫瘤等疾病密切相關(guān)[1]。因此，如何控制脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)和分化已成為治療相關(guān)疾病的作用研究靶點(diǎn)。羊棲菜是一種食用海藻，隸屬于褐藻門、馬尾藻科、馬尾藻屬。羊棲菜多糖（Sargassum fusiforme polysaccha-ride，SFPS）從海藻羊棲菜中提取，研究發(fā)現(xiàn)其具有降血脂、抗氧化、抗疲勞、抗衰老、增強(qiáng)免疫力等生物活性[2-4]，本課題組前期的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，SFPS 具有降低糖尿病大鼠血脂、改善胰島素抵抗等作用[5-6]，但SFPS 對(duì)脂肪細(xì)胞的增殖分化的影響及其機(jī)制未見(jiàn)報(bào)道。本研究觀察SFPS對(duì)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞是否具有抑制增殖分化的作用，并研究其對(duì)相關(guān)基因表達(dá)的影響。

1 材料

1.1 材料與試劑前脂肪細(xì)胞3T3-L1 購(gòu)自美國(guó)ATCC公司（批號(hào)：62996847）；DMEM高糖培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司（批號(hào)：1782825）；Trizol 購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司（批號(hào)：15596-026）；MTT 購(gòu)自索萊寶有限公司（批號(hào)：303H0524）；胰蛋白酶購(gòu)自上海生工（批號(hào)：825J041）；PPARγ 抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司（批號(hào)：ab24509）；FAS 抗體購(gòu)自美國(guó)CST 公司（批號(hào)：31080T）；β-actin 抗體購(gòu)自美國(guó)CST 公司（批號(hào)：4970T）；HRP 標(biāo)記IgG 二抗購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司（批號(hào)：ab45966）；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器和設(shè)備RCO-3000T-5V CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國(guó)G.S.公司）；7500 ABI 熒光定量PCR（美國(guó)Bio-Rad公司）；UV-5200PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；Elx808酶標(biāo)儀（美國(guó)Biotek 公司）；DYJ-909 倒置顯微鏡（上海點(diǎn)應(yīng)光學(xué)儀器有限公司）；Universal HoodII凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 SFPS 的制備經(jīng)200 目粉碎的干燥羊棲菜，先用水煮醇沉法提取[7-8]，經(jīng)3次水煮，3倍體積的95%乙醇沉淀，得到羊棲菜粗多糖（深褐色），然后用Sevag法去除羊棲菜粗多糖中的蛋白成分得到初步純化的多糖，通過(guò)SephadexG200凝膠柱用雙蒸水洗脫分離純化SFPS。用苯酚-硫酸比色法測(cè)定多糖含量，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)得羊棲菜粗多糖中多糖含量為55.13%。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)根據(jù)參考文獻(xiàn)[9]，3T3-L1 細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基（10%新生牛血清、100mg/L鏈霉素、100IU/L青霉素），5%CO2培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)。

2.3 MTT 檢測(cè)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞相對(duì)增殖率3T3-L1 前脂肪細(xì)胞中選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的，以1×104/mL 的細(xì)胞濃度，接種于96 孔板，培養(yǎng)12h 后，將細(xì)胞分為對(duì)照組（Control Group）、SFPS 100 mg/L 組（SFPS 100 mg/L Group）、SFPS 200 mg/L 組（SFPS 200 mg/L Group）和SFPS 400 mg/L 組（SFPS 400mg/L Group），每個(gè)劑量設(shè)6 個(gè)平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h 后，每孔加入20μL MTT（5g/L）（調(diào)零組除外），4h后，棄去上清，加入150μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩15min，結(jié)晶物完全溶解。酶標(biāo)儀于570nm處比色，測(cè)定各孔光密度（OD）值。根據(jù)OD 計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率（Relative Growth Rate，RGR），按下列公式計(jì)算RGR。RGR＝實(shí)驗(yàn)組OD值／對(duì)照組OD值×100%。

2.4 3T3-L1 細(xì)胞內(nèi)總脂質(zhì)及細(xì)胞分化抑制率的測(cè)定3T3-L1 前脂肪細(xì)胞以1×104/mL 的細(xì)胞濃度，接種于96 孔板，將細(xì)胞分為對(duì)照組（Control Group）、SFPS 100 mg/L 組（SFPS 100 mg/L Group）、SFPS 200 mg/L 組（SFPS 200 mg/L Group）和SFPS 400 mg/L 組（SFPS 400 mg/L Group），每個(gè)劑量設(shè)6 個(gè)平行孔。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合后48h（開始誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)分化第0天），含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中加入胰島素（10μg/mL）、IBMX（0.5mmol/L）、地塞米松（1mmol/mL）誘導(dǎo)分化培養(yǎng)2d。棄上清，然后用加入胰島素（10mg/L）的DMEM 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2d。更換DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)9d，細(xì)胞分化基本完成，細(xì)胞胞漿中充滿脂滴，形狀接近圓形。另未分化細(xì)胞組（Undifferentiated cell group，UD Group）培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基（10%FBS），5%CO2培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)，隔天換液，繼續(xù)培養(yǎng)9d。在分化第9d，細(xì)胞用多聚甲醛（4%）固定30min，加入油紅O∶去離子水=3∶2的染料，染色60min，PBS 清洗2 次，顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)有紅染的脂滴，細(xì)胞分化成熟。加入異丁醇250μL，反復(fù)吹打振蕩5min，溶解油紅O 染料，吸取150μL 染料溶解液，酶標(biāo)儀于510nm，測(cè)定各組OD 值，半定量脂肪細(xì)胞中總脂質(zhì)含量并計(jì)算細(xì)胞分化抑制率。細(xì)胞分化抑制率（%）=（OD 對(duì)照組-OD 藥物組）/OD 對(duì)照組×100%。

2.5 SFPS 對(duì)3T3-L1 細(xì)胞TG 的影響在分化第9d，收集分化成熟的細(xì)胞后，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，離心取上清，按照TG 測(cè)定試劑盒說(shuō)明操作，測(cè)定TG含量。于500nm 處測(cè)定吸光度值，吸光度值與TG 濃度呈正比，TG單位為mmol/L。

2.6 SFPS對(duì)3T3-L1細(xì)胞中PPARγ、FAS蛋白表達(dá)的影響按照上述方法誘導(dǎo)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞分化，在誘導(dǎo)分化開始，加入不同濃度的SFPS，每個(gè)劑量設(shè)6 個(gè)平行孔。在分化第9d，收集分化成熟的細(xì)胞，測(cè)定PPARγ、FAS 蛋白表達(dá)量。裂解細(xì)胞提取蛋白：加入100μL細(xì)胞裂解液，冰上裂解細(xì)胞10min，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞提取總蛋白，BCA 法定量。電泳：每組取40μg 蛋白，加樣于10%SDS-PAGE 中電泳分離。轉(zhuǎn)膜封閉：電泳結(jié)束后，濕式轉(zhuǎn)膜法280mA 70min 轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF 膜，5%脫脂奶封閉液，室溫封閉2h。特定蛋白測(cè)定：分別加入對(duì)應(yīng)的一抗，4℃孵育12h；TBST 洗膜10min×3 次，加入相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗，孵育2h 后，棄去二抗；TBST 洗膜10min×3 次，加入顯影劑ECL200mL，定影。用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行灰度值分析。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 18.0 軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（）表示，組間差異比較采用ANOVA檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 SFPS 對(duì)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞相對(duì)增殖率的影響不同濃度的SFPS 處理3T3-L1 前脂肪細(xì)胞24h、48h后，與對(duì)照組比較，各劑量組的細(xì)胞相對(duì)增殖率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)；而在72h 后，與對(duì)照組比較，400 mg/L 組的細(xì)胞相對(duì)增殖率顯著下降(P＜0.05)。表明SFPS 在100～400 mg/L 的劑量范圍內(nèi)，培養(yǎng)72h，對(duì)3T3-L1的增殖有抑制，但抑制作用不顯著。見(jiàn)表1。

3.2 SFPS對(duì)3T3-L1細(xì)胞總脂質(zhì)及分化抑制率的影響與對(duì)照組比較，不同濃度SFPS作用后，分化成熟的脂肪細(xì)胞中總脂質(zhì)含量顯著降低（P＜0.01），SFPS 400 mg/L組降低最明顯，說(shuō)明SFPS在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中能夠減少細(xì)胞中總脂質(zhì)含量。并通過(guò)測(cè)定的OD值，計(jì)算出脂肪細(xì)胞分化抑制率，SFPS 100 mg/L 組、SFPS 200 mg/L組和SFPS 400 mg/L組的細(xì)胞分化抑制率分別為14.51%、21.82%、44.11%。說(shuō)明不同濃度SFPS 均可抑制脂肪細(xì)胞的分化（P＜0.01），SFPS 400 mg/L組抑制效果最顯著（P＜0.01）。見(jiàn)圖1。

表1 SFPS對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞相對(duì)增殖率的影響（，n=6）

表1 SFPS對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞相對(duì)增殖率的影響（，n=6）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05

3.3 SFPS 對(duì)3T3-L1 細(xì)胞中TG 含量的影響與對(duì)照組比較，不同濃度SFPS作用后，分化成熟的脂肪細(xì)胞中TG含量顯著降低（P＜0.01），SFPS 400 mg/L組TG含量降低最明顯，說(shuō)明SFPS 在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中能夠減少細(xì)胞中TG含量。見(jiàn)圖2。

3.4 SFPS對(duì)3T3-L1細(xì)胞中PPARγ、FAS蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組比較，SFPS 各劑量組PPARγ、FAS蛋白表達(dá)量均顯著降低（P＜0.01），且PPARγ、FAS 蛋白表達(dá)量隨著SFPS 濃度的增高而逐漸降低。說(shuō)明SFPS 在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中，能夠通過(guò)影響細(xì)胞中PPARγ、FAS 蛋白表達(dá)量來(lái)抑制3T3-L1 細(xì)胞分化。見(jiàn)圖3。

圖1 SFPS對(duì)3T3-L1細(xì)胞中脂質(zhì)含量的影響

圖2 SFPS對(duì)3T3-L1細(xì)胞甘油三酯含量的影響

圖3 SFPS對(duì)3T3-L1細(xì)胞中PPAR-γ、FAS蛋白表達(dá)的影響

4 討論

SFPS 是從褐藻門食用海藻羊棲菜中提取的多糖成分，主要包括褐藻淀粉、褐藻糖膠和褐藻酸。SFPS已被證實(shí)在脂代謝中具有降血脂、抑制脂質(zhì)沉積和保護(hù)脂肪變的肝細(xì)胞等作用[10-11]，本課題組前期的實(shí)驗(yàn)研究也進(jìn)一步驗(yàn)證了其在脂代謝中的作用。肥胖、脂肪細(xì)胞的過(guò)度增殖分化及代謝紊亂與多種疾病相關(guān)[12]，因此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究SFPS對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化是否具有抑制作用，并初步探討其作用機(jī)制。

前脂肪細(xì)胞要經(jīng)過(guò)融合前增殖、接觸抑制、克隆擴(kuò)增、擴(kuò)增停止四個(gè)階段分化為成熟的脂肪細(xì)胞[13]，此過(guò)程中需要多種轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，促進(jìn)脂滴形成。PPARγ屬于核內(nèi)受體轉(zhuǎn)錄因子超家族，是眾多脂肪分化因子中最關(guān)鍵的，可直接調(diào)控脂肪細(xì)胞分化，參與脂的代謝[14-15]，PPARγ與生理性或藥理性配體結(jié)合后，改變構(gòu)象，結(jié)合相關(guān)DNA上的PPARγ反應(yīng)元件，從而調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。PPARγ是脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中必須的轉(zhuǎn)錄因子，可進(jìn)一步調(diào)控脂代謝的相關(guān)酶的表達(dá)。為了研究SFPS 對(duì)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞分化的影響，誘導(dǎo)分化開始，加入不同濃度的SFPS。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在分化第9d，不同濃度的SFPS各組細(xì)胞中PPAR-γ蛋白的表達(dá)量顯著減少。

FAS 是脂肪酸合成的關(guān)鍵酶[16]，以乙酰輔酶A 為原料催化生成長(zhǎng)鏈脂肪酸，并進(jìn)一步形成甘油三酯儲(chǔ)存于細(xì)胞中。實(shí)驗(yàn)研究表明，脂肪組織中FAS 的mRNA 表達(dá)量與肥胖是正相關(guān)的，抑制FAS的量可以減少脂滴的生成[17-18]。PPARγ是前脂肪細(xì)胞分化關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，而FAS 出現(xiàn)在分化的中期、后期，屬于PPARγ 下游靶基因之一，調(diào)節(jié)脂類的合成、儲(chǔ)存。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在分化第9d，不同濃度的SFPS各組細(xì)胞中FAS 蛋白的表達(dá)量顯著減少，表明SFPS 可通過(guò)降低FAS蛋白的表達(dá)，抑制3T3-L1中脂質(zhì)的生成。

本研究結(jié)果顯示：①SFPS 抑制3T3-L1 前脂肪細(xì)胞分化，減少脂肪細(xì)胞中總脂質(zhì)及TG的含量，濃度越大，抑制作用越明顯。②SFPS 可以明顯下調(diào)3T3-L1細(xì)胞PPARγ蛋白的表達(dá)，降低FAS蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，SFPS 抑制3T3-L1 前脂肪細(xì)胞分化的分子機(jī)制可能與調(diào)控PPARγ和FAS蛋白的表達(dá)有關(guān)。