繆青梅,趙楊,徐曉麗,徐俊鋒,汪小福,陳笑蕓*

1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營(yíng)養(yǎng)研究所， 杭州 310021； 2.浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 杭州 310058

近年來(lái)，隨著基因工程技術(shù)的飛速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因作物種植面積和轉(zhuǎn)基因作物品種都大幅增加。根據(jù)國(guó)際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織(International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications，ISAAA)發(fā)布的2018年全球生物技術(shù)/轉(zhuǎn)基因作物發(fā)展態(tài)勢(shì)報(bào)告，2018年全球共有26個(gè)國(guó)家或地區(qū)批準(zhǔn)了轉(zhuǎn)基因作物的種植，44個(gè)國(guó)家或地區(qū)批準(zhǔn)了轉(zhuǎn)基因作物作為加工原料進(jìn)口，轉(zhuǎn)基因作物的種植面積達(dá)1.917億hm2[1]。轉(zhuǎn)基因大豆作為最主要的轉(zhuǎn)基因作物，全球種植面積達(dá)9 590萬(wàn)hm2，占全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積的50%[2]。隨著轉(zhuǎn)基因產(chǎn)業(yè)的高速發(fā)展，全球已有60多個(gè)國(guó)家或地區(qū)相繼實(shí)施了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定量標(biāo)識(shí)閾值管理，其中，歐盟將轉(zhuǎn)基因成分標(biāo)識(shí)閾值設(shè)定為0.9%，日本設(shè)為5%，韓國(guó)設(shè)為3%[3-4]。我國(guó)自2001年起也先后頒布了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識(shí)管理辦法》，明確規(guī)定了我國(guó)對(duì)所有的轉(zhuǎn)基因食品實(shí)行零容忍定性標(biāo)識(shí)管理制度。因此，轉(zhuǎn)基因安全管理實(shí)施定量標(biāo)識(shí)和閾值管理是發(fā)展的必然趨勢(shì)[5]。而建立快速、精準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因定量檢測(cè)方法體系可以為實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)閾值管理制度、規(guī)范轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品銷售行為、保護(hù)消費(fèi)者的知情權(quán)、加強(qiáng)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理提供技術(shù)支持。

PCR技術(shù)具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)勢(shì)，是國(guó)際上轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測(cè)的主要方法。特別是實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，因具有更高的靈敏度、更強(qiáng)的特異性和準(zhǔn)確性、檢測(cè)過(guò)程耗時(shí)短且能實(shí)現(xiàn)高度自動(dòng)化等特點(diǎn)，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物的檢測(cè)[6]。目前針對(duì)大豆、水稻、玉米等作物的特定轉(zhuǎn)基因品系的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法已陸續(xù)研發(fā)成功[7-12]。

轉(zhuǎn)基因耐草甘膦大豆ZUTS-33是由浙江大學(xué)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化栽培大豆華春3號(hào)獲得的，ZUTS-33可產(chǎn)生G10-EPSPS蛋白，對(duì)草甘膦高抗，可以滿足大豆種植者對(duì)田間雜草的有效防治，具有較好的農(nóng)藝性狀和商業(yè)化潛力[13]。但到目前為止，尚未發(fā)布專門針對(duì)轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆ZUTS-33轉(zhuǎn)化體及其衍生品種的檢測(cè)方法。本研究以轉(zhuǎn)g10-epsps基因耐除草劑大豆ZUTS-33為研究對(duì)象，設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)g10-epsps基因耐除草劑大豆ZUTS-33的轉(zhuǎn)化體特異性檢測(cè)引物和TaqMan探針，利用優(yōu)化的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法評(píng)價(jià)該引物對(duì)和探針的特異性、準(zhǔn)確度、精確度和重復(fù)性，并確定此檢測(cè)方法的檢測(cè)極限(limit of detection，LOD)和定量極限(limit of quantity，LOQ)，以期建立轉(zhuǎn)g10-epsps基因耐除草劑大豆ZUTS-33品系的檢測(cè)鑒定方法，為農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試驗(yàn)材料 試驗(yàn)所用轉(zhuǎn)g10-epsps基因耐除草劑大豆ZUTS-33及其受體材料由浙江大學(xué)提供；其他轉(zhuǎn)基因大豆混合物(GTS40-3-2、MON89788、CV127、A5547-127、A2704-12、305423、356043、MON88302、73496、MON87769、MON87705、FG72、DAS68416-4、SHZD32-1)，轉(zhuǎn)基因玉米混合物(Bt11、Bt176、MON810、MON863、GA21、NK603、T25、TC1507、MON89034、MON88017、59122、MIR604、3272、MON87460、MIR162、DAS40278-9、雙抗12-5、IE09S034、C0030.3.5、C0010.3.7、4114、MON87427、5307)，轉(zhuǎn)基因棉花混合物(MON531、MON1445、MON15985、LLCOTTON25、MON88913、GHB614、COT102)，轉(zhuǎn)基因油菜混合物(MS1、MS8、RF1、RF2、RF3、T45、OXY235、Topas19/2、MON88302、73496)，轉(zhuǎn)基因水稻混合物(TT51-1、科豐6號(hào)、克螟稻、M12、科豐8號(hào)、科豐2號(hào)、G6H1、T1C-19)陽(yáng)性材料購(gòu)置于深圳卓越生物科技有限公司和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心；其他非轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、水稻、棉花等材料由本實(shí)驗(yàn)室自備。

1.1.2主要試劑 TaqMan Fast Advanced Master Mix預(yù)混液購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；植物基因組DNA提取試劑盒(DP305)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.3主要儀器 CFX96熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-rad公司；NanoDrop 2000C核酸蛋白測(cè)定儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.2 DNA 提取與純化

使用植物基因組DNA提取試劑盒提取并純化所有材料的基因組DNA，具體步驟按照試劑盒使用說(shuō)明書操作。獲得的基因組DNA用NanoDrop 2000C核酸蛋白測(cè)定儀進(jìn)行核酸質(zhì)量分析。為符合進(jìn)一步檢測(cè)的要求，所有材料基因組DNA OD260/OD280在1.7～2.0之間，濃度在30～70 ng·μL-1之間，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法建立

1.3.1引物和探針設(shè)計(jì) 根據(jù)轉(zhuǎn)g10-epsps基因耐除草劑大豆ZUTS-33左右邊界側(cè)翼序列信息[13]，通過(guò)Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)化體特異性引物和探針。轉(zhuǎn)化體特異性探針5′端修飾基團(tuán)為6-羧基熒光素(6-carboxy-fluorescein，F(xiàn)AM)，3′端為黑洞淬滅基團(tuán)(BHQ1),內(nèi)源基因?yàn)榫幋a大豆凝集素的基因Lectin基因，引物探針引用歐盟CRLVL08/05VR[14]中的序列，具體信息見(jiàn)表1。引物和探針均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物和探針Table 1 Primers and probes used in this study

1.3.2引物探針適用性測(cè)試 以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的轉(zhuǎn)基因大豆ZUTS-33基因組DNA為模板，采用通用的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系和程序進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：2×TaqMan Fast Advanced Master Mix 12.5 μL，10 μmol·L-1上、下游引物各1.0 μL，10 μmol·L-1探針0.5 μL，25 mg·L-1DNA 2.0 μL，補(bǔ)水至25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸 1 min(在此階段收集熒光信號(hào))，共40個(gè)循環(huán)。根據(jù)熒光曲線的線性、相對(duì)Ct值等因素，確定引物和探針組合。

1.3.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法反應(yīng)體系優(yōu)化 為獲得最優(yōu)的引物和探針?lè)磻?yīng)濃度，將探針的濃度設(shè)置為0.10、0.20、0.25、0.30、0.40、0.50 μmol·L-16個(gè)探針濃度梯度，對(duì)應(yīng)的引物濃度為探針濃度的2倍，采用通用的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)熒光曲線的線性、相對(duì)Ct值等因素，確定體系中引物和探針的最優(yōu)濃度。

1.4 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)方法確認(rèn)

1.4.1檢測(cè)方法特異性 選用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的轉(zhuǎn)基因大豆ZUTS-33、62種不同的主要商業(yè)化轉(zhuǎn)化體、轉(zhuǎn)基因大豆ZUTS-33陰性對(duì)照(即受體)、其他非轉(zhuǎn)基因大豆作為測(cè)試對(duì)象，對(duì)1.3中建立的耐除草劑大豆ZUTS-33實(shí)時(shí)熒光PCR方法進(jìn)行特異性測(cè)試，以驗(yàn)證候選引物和探針組合是否僅在陽(yáng)性樣品中獲得預(yù)期的擴(kuò)增。

1.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 根據(jù)EURL[15]對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線的各項(xiàng)參數(shù)的詳細(xì)規(guī)定，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)R2≥0.98，擴(kuò)增效率E[Efficiency=10(-1/slope)-1]的范圍為90%～110%，斜率(slope)范圍為-3.1～-3.6。提取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%的ZUTS-33大豆樣品的DNA，將基因組DNA(25 ng·μL-1)按6倍濃度梯度依次進(jìn)行稀釋，配制成了5個(gè)含量的標(biāo)準(zhǔn)樣品，依次為22 422、3 737、623、104、17 copies·μL-1。采用1.3中建立的最優(yōu)體系和通用反應(yīng)程序進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，每個(gè)PCR反應(yīng)設(shè)置3個(gè)平行，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)DNA溶液PCR反應(yīng)的Ct值及初始模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)繪制ZUTS-33的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的各項(xiàng)參數(shù)(R2、效率E、斜率)確認(rèn)方法是否符合要求。

1.4.3準(zhǔn)確度、精確度和重復(fù)性評(píng)價(jià) 將研磨好的轉(zhuǎn)g10-epsps基因耐除草劑大豆ZUTS-33品系大豆和其受體材料(非轉(zhuǎn)基因大豆)按照質(zhì)量百分比進(jìn)行混合，配制了3個(gè)不同轉(zhuǎn)基因百分含量的樣品，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5.0%、1.0%和0.5%。采用1.3中建立的最優(yōu)體系和通用反應(yīng)程序進(jìn)行內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin和轉(zhuǎn)g10-epsps基因耐除草劑大豆ZUTS-33轉(zhuǎn)化體特異性實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。每次設(shè)3個(gè)平行，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，計(jì)算多次測(cè)試的偏差(Bias)和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)，評(píng)價(jià)測(cè)試方法的準(zhǔn)確度和精確度。

1.4.4檢測(cè)極限和定量極限確定 根據(jù)《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法制定指南》(農(nóng)業(yè)部2259號(hào)公告-5-2015)的規(guī)定，轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法的檢測(cè)極限(limit of detection，LOD)應(yīng)不高于目標(biāo)濃度的1/20，定量極限(limit of quantity，LOQ)應(yīng)不高于目標(biāo)濃度的1/10。根據(jù)《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識(shí)管理辦法》，我國(guó)目前對(duì)轉(zhuǎn)基因食品實(shí)行強(qiáng)制標(biāo)識(shí)管理制度，只要食品中檢出轉(zhuǎn)基因成分就需進(jìn)行標(biāo)識(shí)，并未設(shè)定閾值[15]。本研究設(shè)定的目標(biāo)濃度參考?xì)W盟閾值0.9%，因此，檢測(cè)極限LOD≤0.045%(相當(dāng)于50 ng DNA模板中含有約20拷貝的ZUTS-33轉(zhuǎn)化體特異性序列)，定量極限LOQ≥0.09%(相當(dāng)于50 ng DNA模板中含有約40拷貝的ZUTS-33轉(zhuǎn)化體特異性序列)。

本研究設(shè)置了反應(yīng)體系中含有20拷貝和10拷貝2種ZUTS-33轉(zhuǎn)化體特異性序列對(duì)方法LOD進(jìn)行測(cè)試，設(shè)置了40拷貝和20拷貝2種ZUTS-33轉(zhuǎn)化體特異性序列對(duì)方法LOQ進(jìn)行測(cè)試，以確定方法的LOD和LOQ。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物探針適用性測(cè)試

為了獲得擴(kuò)增效果最好的引物和探針，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的轉(zhuǎn)基因大豆ZUTS-33基因組DNA為模板進(jìn)行適用性測(cè)試。測(cè)試結(jié)果(圖1)表明，4組引物探針組合擴(kuò)增Ct值無(wú)明顯差異，但組合A擴(kuò)增曲線上升幅度最大，線型最好，即引物探針組合ZUTS-33-LB-qF/qR/P(以下文中定名為ZUTS-33-qF/qR/P)的擴(kuò)增效果最好。因此，選擇ZUTS-33-qF/qR/P作為候選的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物進(jìn)行進(jìn)一步測(cè)試。

圖1 實(shí)時(shí)熒光PCR引物的適用性測(cè)試Fig.1 Suitability test of real-time PCR primers

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系優(yōu)化

為了獲得最優(yōu)的反應(yīng)體系，本研究對(duì)反應(yīng)體系中引物和探針設(shè)置了不同的濃度進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果表明(圖2)，隨著引物和探針濃度的增加，擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，Ct值逐漸減小，0.20 μmol·L-1及以上濃度的Ct值無(wú)明顯差異。當(dāng)反應(yīng)體系中探針濃度為0.10 μmol·L-1時(shí)，Ct值約為33，當(dāng)反應(yīng)體系中探針濃度為0.20 μmol·L-1及以上時(shí)，Ct值約為32。考慮內(nèi)源基因擴(kuò)增反應(yīng)體系，最終確定檢測(cè)的引物濃度為0.40 μmol·L-1，探針濃度為0.20 μmol·L-1。反應(yīng)體系確定為：2×Mix 12.5 μL，10 μmol·L-1上、下游引物各1.0 μL，10 μmol·L-1探針0.5 μL，25 mg·L-1DNA 2.0 μL，補(bǔ)水至25 μL。

圖2 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系優(yōu)化Fig.2 Optimization of the real-time PCR systems

2.3 特異性測(cè)試

為了驗(yàn)證適應(yīng)性試驗(yàn)篩選出的候選引物和探針組合是否僅在陽(yáng)性材料中獲得預(yù)期的擴(kuò)增，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的轉(zhuǎn)基因大豆ZUTS-33、62種不同的主要商業(yè)化轉(zhuǎn)化體、轉(zhuǎn)基因大豆ZUTS-33陰性對(duì)照(即受體)、其他非轉(zhuǎn)基因大豆作為測(cè)試對(duì)象，進(jìn)行了特異性試驗(yàn)。測(cè)試結(jié)果(圖3)顯示，僅耐除草劑大豆ZUTS-33獲得了典型的擴(kuò)增曲線，其余轉(zhuǎn)化體及ZUTS-33陰性對(duì)照、其他非轉(zhuǎn)基因大豆均未出現(xiàn)擴(kuò)增，表明建立的實(shí)時(shí)熒光PCR方法具有高度的特異性。

圖3 ZUTS-33轉(zhuǎn)化體檢測(cè)方法特異性測(cè)試Fig.3 Specificity test of the detection method on the ZUTS-33 transformant

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%的轉(zhuǎn)基因大豆ZUTS-33基因組DNA進(jìn)行梯度稀釋，以獲得的5個(gè)濃度的基因組DNA為模板，利用優(yōu)化后的反應(yīng)體系和通用反應(yīng)程序進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因大豆ZUTS-33品系特異性序列的標(biāo)準(zhǔn)曲線。3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中ZUTS-33檢測(cè)反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸系數(shù)R2、效率E、斜率、截距等所有指標(biāo)全部滿足了轉(zhuǎn)基因定量檢測(cè)的要求[17](圖4)。表明ZUTS-33檢測(cè)體系的Ct值與模板拷貝數(shù)間均具有良好的線性關(guān)系。

圖4 ZUTS-33檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curves of the ZUTS-33 detection method

2.5 準(zhǔn)確度、精確度和重復(fù)性測(cè)試

為了驗(yàn)證建立的檢測(cè)方法是否具有良好的準(zhǔn)確度、精確度和重復(fù)性，利用預(yù)期轉(zhuǎn)基因質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.0%、1.0%、0.5%的轉(zhuǎn)基因大豆ZUTS-33材料基因組DNA對(duì)內(nèi)源基因Lectin和轉(zhuǎn)化體特異性序列進(jìn)行擴(kuò)增，計(jì)算多次測(cè)試的偏差(Bias)和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)以評(píng)估檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度、精確度和重復(fù)性。3次重復(fù)測(cè)試結(jié)果(表2)顯示3個(gè)濃度的偏差(Bias)均小于25%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation, RSD)均小于25%，說(shuō)明ZUTS-33檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度與精確度均符合檢測(cè)的要求，重復(fù)性較好。

表2 ZUTS-33檢測(cè)方法準(zhǔn)確度和精確度測(cè)試Table 2 Accuracy and precision test of ZUTS-33 detection method

2.6 檢測(cè)極限和定量極限測(cè)試

2.6.1LOD測(cè)試 為了確定本研究建立的檢測(cè)方法的LOD，分別設(shè)置反應(yīng)體系中含20拷貝和10拷貝2種轉(zhuǎn)化體特異性序列對(duì)方法LOD進(jìn)行60個(gè)平行測(cè)試。測(cè)試結(jié)果(圖5)顯示，反應(yīng)體系中2種目標(biāo)濃度60個(gè)平行反應(yīng)均有擴(kuò)增信號(hào)。為有更好的適應(yīng)性，本方法LOD設(shè)定為20拷貝。

圖5 ZUTS-33 LOD測(cè)試擴(kuò)增曲線Fig.5 ZUTS-33 LOD tested the amplification curve

2.6.2LOQ測(cè)試 為了確定本研究建立的檢測(cè)方法的LOQ，分別設(shè)置反應(yīng)體系中含40拷貝和20拷貝2種轉(zhuǎn)化體特異性序列對(duì)方法LOQ進(jìn)行15個(gè)平行測(cè)試。LOQ測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表3。當(dāng)反應(yīng)體系中含有20拷貝ZUTS-33轉(zhuǎn)化體特異性序列(相當(dāng)于ZUTS-33含量為0.045%)時(shí)，15次測(cè)試結(jié)果的偏差為2.0%，小于25%；RSD為18.3%，小于25%。當(dāng)DNA模板中含有40拷貝ZUTS-33轉(zhuǎn)化體特異性序列(相當(dāng)于ZUTS-33含量為0.09%)時(shí)，15次測(cè)試結(jié)果的偏差為7.8%，小于25%；RSD為10.6%，小于25%。因此，由實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的驗(yàn)證估測(cè)本檢測(cè)方法的LOQ不高于20拷貝，為了有更好的適應(yīng)性，本方法LOQ設(shè)定為40拷貝。

表3 ZUTS-33檢測(cè)方法LOQ測(cè)試Table 3 ZUTS-33 detection method LOQ test

3 討論

目前中國(guó)已經(jīng)批準(zhǔn)了12種轉(zhuǎn)基因大豆品系(A2704-12、DP356043、DP305423、GTS40-3-2、A5547-127、MON87705、MON89788、MON87751、DAS44406-6、DAS-81419-2、305323× GTS40-3-2、SYHT0H2)作為加工原料進(jìn)口。為了規(guī)范轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的生產(chǎn)和銷售，正確引導(dǎo)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的消費(fèi)，保護(hù)消費(fèi)者的知情權(quán)，建立準(zhǔn)確、快速、高效的轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)技術(shù)十分重要[18-19]。2019年上海交通大學(xué)的轉(zhuǎn)基因大豆SHZD32-01獲得了農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書[農(nóng)基安證字(2019)第293號(hào)]，目前浙江大學(xué)自主研發(fā)的轉(zhuǎn)基因大豆品系ZUTS-33也進(jìn)入生產(chǎn)性試驗(yàn)。但到目前為止尚未發(fā)布針對(duì)該轉(zhuǎn)化體的檢測(cè)方法。

轉(zhuǎn)基因成分實(shí)行閾值標(biāo)識(shí)管理需要相應(yīng)的精準(zhǔn)定量檢測(cè)技術(shù)支持，目前，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法被國(guó)內(nèi)外用作對(duì)轉(zhuǎn)基因成分定量檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。本研究基于實(shí)時(shí)熒光PCR法，首先在轉(zhuǎn)基因大豆ZUTS-33外源基因插入位點(diǎn)旁側(cè)序列設(shè)計(jì)引物和探針并對(duì)引物和探針的適用性進(jìn)行確認(rèn)，然后對(duì)獲得的候選引物和探針進(jìn)行條件優(yōu)化，最后對(duì)建立的方法從特異性、準(zhǔn)確度和精確度等方面進(jìn)行確認(rèn)。研究結(jié)果表明建立的轉(zhuǎn)基因大豆ZUTS-33轉(zhuǎn)化體特異性實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法具有良好的特異性、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性，方法的LOD為20拷貝，LOQ為40拷貝。

本研究建立的轉(zhuǎn)g10-epsps基因耐除草劑大豆ZUTS-33定量檢測(cè)方法可為耐除草劑大豆ZUTS-33大豆及其衍生產(chǎn)品的精準(zhǔn)檢測(cè)、標(biāo)準(zhǔn)制定、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和試劑盒等衍生產(chǎn)品的開發(fā)提供技術(shù)支持。然而，實(shí)時(shí)熒光定量PCR作為一種相對(duì)定量方法也有其局限性，在定量過(guò)程中需要依賴標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)達(dá)到對(duì)未知樣品的相對(duì)定量。數(shù)字PCR作為一種核酸絕對(duì)定量技術(shù)，它最大的特點(diǎn)是無(wú)需借助標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)實(shí)現(xiàn)定量目的，可以有效地解決實(shí)時(shí)熒光定量PCR法的局限性。本研究開發(fā)的引物和探針具有良好的適用性和特異性，為開發(fā)數(shù)字PCR定量檢測(cè)方法提供了研究基礎(chǔ)。