柯振華

福建省產(chǎn)品質量檢驗研究院，國家加工食品質量監(jiān)督檢驗中心(福州)， 福州 350000

農(nóng)產(chǎn)品和食品安全是全球性問題，食源性疾病是食品安全的主要問題，由病原菌引起的食源性疾病一直是全世界關注的重點食品安全問題[1-5]。據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)估計，全世界每年有數(shù)以億計的食源性疾病患者，其中70%是由各種病原菌污染的食品和飲用水引起的。全世界每年約有200萬兒童死于腹瀉，其中66%以上是由病原菌所致。據(jù)我國衛(wèi)生部公布的數(shù)據(jù)顯示，我國平均每年發(fā)生一萬多例食物中毒事件，由各種病原菌引起的食物中毒比例占三成以上[6-11]。

餐飲服務食品(簡稱餐飲食品)指通過即時制作加工、商業(yè)銷售和服務性勞動，向消費者提供的食品。與預包裝食品相比，預包裝食品一般加工過程自動化水平高，經(jīng)過食品生產(chǎn)許可認證，相對而言食品安全風險因素易于控制，而餐飲食品的加工制作過程多以手工作業(yè)為主，生產(chǎn)管理規(guī)范性低，在加工、儲運以及保藏環(huán)節(jié)易受病原菌污染，存在較高的食品安全風險[12-16]。

餐飲食品及相關食品的安全管理主要涵蓋食品生產(chǎn)加工鏈條安全控制以及病原菌風險控制與快速檢測技術研究兩方面。針對食源性病原菌檢測，我國已經(jīng)制定了相關國家標準，但由于標準方法多是基于傳統(tǒng)的微生物學鑒定手段，檢測步驟包括病原菌分離、培養(yǎng)、鑒定等步驟，對于病原菌的檢測一般需要一周時間，無法滿足餐飲等食品的快速檢測需求，亦無法滿足食品安全事件中致病性病原菌的快速檢測需求，亟需開發(fā)更為快速靈敏的檢測技術。

一般認為活細菌才具有致病性風險，而采用分子生物學手段進行病原菌檢測鑒定，死菌與活菌DNA均能檢出，所以能夠有效區(qū)分死亡病原菌與活菌的檢測方法才能使鑒定結果更具有說服力。國內外已有較多文獻報道利用DNA染料如PMA與EMA等進行活細胞鑒別[17-20]，鑒別原理主要是利用染料鑒別細胞膜的完整性。DNA染料容易通過死亡細菌或膜損傷細菌的細胞膜，而活細菌因其具有完整細胞膜，可隔絕DNA染料。其中，疊氮丙啶(propidium monoazide, PMA)作為一種與核酸具有親和性的疊氮類核酸染料，應用較為廣泛。PMA結構中帶有疊氮基團，是一種對核酸具有高度親和力的光敏染料，自身是弱熒光的，但當其與核酸分子結合后熒光變強。PMA無法進入活細胞，因此只能選擇性的修飾細菌死亡后暴露出來的核酸分子。當PMA處理后的樣品暴露于強光下時，PMA所帶的光敏性疊氮基團轉化為高活性的氮賓自由基，并與結合位點附近的任意碳氫化合物反應形成穩(wěn)定的共價氮碳鍵，使得核酸分子被永久修飾，最終成功阻斷核酸分子的PCR擴增。同時，殘留在溶液中未與核酸分子進行交聯(lián)的PMA在強光照射的同時與水分子會發(fā)生反應生成無活性的羥胺，基本不影響活菌DNA的檢測。

熒光定量PCR(fluorescence quantitative PCR)通過熒光基團標記探針和熒光信號強度收集檢測，可實現(xiàn)PCR過程的實時監(jiān)測，并通過Ct值對目標DNA進行定性定量分析[21-25]。

綜合考慮病原菌檢出率以及病原菌所帶來的危害與影響，本研究選取痢疾志賀氏菌、陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌、副溶血性弧菌、大腸埃希氏菌O157∶H7與單核細胞增生李斯特氏菌等9種病原菌，開發(fā)多重實時熒光PCR檢測方法，以期尋找能在短時間內完成病原菌檢測的高靈敏度方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1標準菌株 本研究的研究對象為9種病原菌，分別是痢疾志賀氏菌(Shigelladysenteriae)、陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)、沙門氏菌(Salmonella)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)、副溶血性弧菌(Vibrioparahemolyticus)、大腸埃希氏菌O157∶H7(EscherichiacoliO157∶H7)、單核細胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)。

1.1.2主要儀器 ABI 7500實時熒光定量PCR儀(美國Life Tech公司)；臺式離心機(Eppendorf公司)；IKA MS3 basic渦旋混合器、SterilGARDⅢ Advance生物安全柜(美國Baker公司)；HVE50高壓滅菌鍋(日本Hirayama公司)；移液器(Eppendorf 公司)；Milli-Q超純水儀(MILLIPORE公司)；SILVER拍擊式均質器(西班牙IUL公司)；pH計(METTLER-TOLEDO 公司)；生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學儀器有限公司)；生物顯微鏡CX31(奧林巴斯有限公司)；DNA濃縮儀(美國Thermofisher公司)。

1.1.3試劑 試驗用培養(yǎng)基與試劑如腦心浸出液肉湯等購自北京陸橋技術股份有限公司；PCR預混液購自上海生工生物工程股份有限公司；DNA提取試劑盒購自QIAGEN公司；DMSO購自Sigma公司；PMA (疊氮溴化丙錠)購自Biotium公司。

PMA工作液：將PMA溶解于200 μL 20%的DMSO溶液，得到5 μg·μL-1儲備液，于-20 ℃避光保存。使用時，將PMA儲備液稀釋10倍；DNA提取液配方(1 L，pH 8.0)：1 mol·L-1Tris-HCl 25.0 mL,5 mol·L-1NaCl 5.0 mL,0.5 mol·L-1EDTA 25.0 mL,20% SDS 25.0 mL，ddH2O定容到1.0 L。

試驗所用引物、探針均委托上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1通用型預增菌培養(yǎng)基的研制 本研究的研究對象為9種致病菌，為了節(jié)約預增菌時間以及減少操作步驟帶來的污染風險，研究根據(jù)病原菌的不同菌株特性與生長條件摸索通用型預增菌培養(yǎng)基配方。為了提高目標菌的篩選能力，分別加入不同類型的常用培養(yǎng)基添加劑進行試驗，以篩選出目標菌區(qū)分度較好、可同時用于多種目標菌株的預增菌用培養(yǎng)基。

將9種病原菌根據(jù)檢出率以及影響范圍分為兩組，第一組為沙門氏菌、蠟樣芽胞桿菌、大腸埃希氏菌O157:H7、單核細胞增生李斯特氏菌。對第一組菌初步摸索了6種不同的預增菌培養(yǎng)基配方(表1)，采用沙門氏菌、蠟樣芽胞桿菌等標準菌株加入的方式，在6種不同組合培養(yǎng)基中培養(yǎng)病原菌，12 h后通過選擇性平板定量，繪制柱狀圖。

表1 第一組病原菌6種不同組合培養(yǎng)基配方Table 1 Six different combinations of medium formulations for group 1 pathogenic bacteria (g·L-1)

第二組為痢疾志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌。對第二組菌初步摸索了6種不同的預增菌培養(yǎng)基配方(表2)，通過金黃色葡萄球菌、陰溝腸桿菌等標準菌株加入的方式，在6種不同組合培養(yǎng)基中培養(yǎng)病原菌，12 h后通過選擇性平板定量，繪制柱狀圖。

表2 第二組6種不同組合培養(yǎng)基配方Table 2 Six different combinations of medium formulations for group 2 pathogenic bacteria (g·L-1)

1.2.2PMA處理濃度以及曝光時間的確定 研究以金黃色葡萄球菌為試驗菌株，設置不同濃度梯度的PMA濃度以及不同的曝光時間，探究病原菌處理的最佳PMA濃度與曝光時間。

1.2.3細菌培養(yǎng)、熱滅活菌的制備以及PMA處理 用接種環(huán)分別挑取標準菌株瓷珠，分別在營養(yǎng)瓊脂平板表面劃線，于37 ℃培養(yǎng)24 h。從培養(yǎng)平板上挑取單菌落接種于通用型預增菌培養(yǎng)基，37 ℃震蕩培養(yǎng)12 h。用移液器小心吸取500 μL菌液沸水浴15 min后，37 ℃溫育30 min，之后用35.0 μg·mL-1PMA(優(yōu)化后濃度)處理，混合均勻后，于暗處孵育20 min，將離心管置于500 W鹵鎢燈下20 cm處曝光25 min(優(yōu)化后曝光時間)，期間混勻數(shù)次，使樣品溶液曝光均勻。

1.2.4菌液DNA提取 在DNA制備方法的選擇上，綜合考慮檢驗效率與提取時間，采用高溫裂解方法提取菌液DNA：完成預增菌后，用移液器移取1.0 mL菌液加入1.5 mL無菌離心管中，12 000 r·min-1離心5 min。吸棄上清，加入300 μL DNA提取裂解液，振蕩混勻后沸水浴5 min。冷卻至室溫，12 500 r·min-1離心5 min，小心移取上清液至無菌離心管中，即為本實驗所用目標菌DNA模板。

將提取好的菌液DNA做好標記后置于冰箱中保存，利用7500實時熒光定量PCR系統(tǒng)進行檢測。

1.2.5引物與探針的設計與合成 根據(jù)目標病原菌基因組保守序列設計特異性引物與探針，具體序列見表3。

表3 引物和探針序列Table 3 Sequences of primers and probes

1.2.6實時熒光PCR反應體系與反應參數(shù) 實時熒光PCR反應體系(30 μL)：PCR預混液15 μL，上、下游引物各1 μL，探針0.5 μL，模板DNA溶液2.5 μL，ddH2O補足體積至30 μL。實時熒光PCR反應參數(shù)：94 ℃ 5 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。

1.2.7多重實時熒光PCR反應體系的建立和優(yōu)化 多重實時熒光PCR反應是在單重實時熒光PCR的基礎上，對探針的發(fā)光和淬滅基團進行驗證和選擇，對反應體系進行確認和優(yōu)化，以實現(xiàn)通過一次擴增反應同時檢測多個靶標DNA，提高檢驗效率。

多重實時熒光PCR反應成功的關鍵在于引物、探針的特異性以及所標記熒光基團的抗干擾性，既需要避免探針間發(fā)光基團與淬滅基團間的相互干擾，又要避免非特異性擴增，同時還要兼顧退火溫度等條件，使多個目標基因片段有相近的擴增效率。

1.2.8PMA-qPCR檢測目標病原菌的靈敏度 將107CFU·mL-1的蠟樣芽胞桿菌等病原菌菌懸液逐級稀釋10倍，制備濃度分別為107、106、105、104、103、102、10 CFU·mL-1梯度的菌液，經(jīng)PMA處理，進行qPCR分析檢測。

2 結果與分析

2.1 通用型預增菌培養(yǎng)基研制

在第一組病原菌預增菌培養(yǎng)基的研制上，我們選用腦心浸液肉湯(BHI)與蛋白胨為基礎培養(yǎng)基，腦心浸液肉湯與蛋白胨提供氮源、維生素和生長因子；在添加組分的選擇上，葡萄糖可為多種細菌提供能源，磷酸氫二鈉為緩沖劑；氯化鈉維持均衡的滲透壓也作為選擇劑，其濃度對菌株生長的影響較大，低濃度丙酮酸鈉對多株菌的生長影響不大。第一組菌的6種不同組合培養(yǎng)基配方增菌效果見圖1，可以看出，組合4培養(yǎng)基針對第一組病原菌預增菌效果較好，確定第一組病原菌的預增菌培養(yǎng)基配方為(1 L)：腦心浸粉17.5 g，葡萄糖3.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉5.0 g，磷酸氫二鈉3.0 g，氯化鋰2.0 g，丙酮酸鈉2.0 g，甘氨酸3.0 g，甘露醇2.0 g。

圖1 第一組6種不同組合培養(yǎng)基配方的增菌效果Fig.1 Effect of six different combinations of medium formulations for group 1

將標準菌株稀釋到100 CFU·mL-1后，加入上述通用型預增菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h后，稀釋涂布平板進行計數(shù)。其中，沙門氏菌菌落數(shù)達到1.0×108CFU·mL-1，單核細胞增生李斯特氏菌菌落數(shù)達到2.6×107CFU·mL-1,蠟樣芽胞桿菌菌落數(shù)達到3.1×107CFU·mL-1,大腸桿菌O157∶H7菌落數(shù)達到8.9×107CFU·mL-1，上述4種病原菌增殖后菌落數(shù)目均達到熒光PCR檢測要求(103CFU·mL-1)。

在第二組病原菌預增菌培養(yǎng)基研制上，我們選用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，提供氮源、維生素和生長因子，在添加組分的選擇上，乳糖可為多種細菌提供能源，氯化鈉用以維持均衡的滲透壓，磷酸二氫鉀為緩沖劑，疊氮鈉為選擇性抑菌劑。通過比較研究，6種不同組合培養(yǎng)基配方增菌效果見圖2，可以看出組合3的培養(yǎng)基對第三組病原菌的預增菌效果較好，最終確定第三組5種病原菌的通用型預增菌培養(yǎng)基配方為(1 L)：牛肉膏蛋白胨15.0 g，乳糖5.0 g，磷酸二氫鉀3.5 g，甘露醇3.0 g，氯化鈉5.0 g，丙酮酸鈉3.0 g，甘氨酸：5.0 g，疊氮鈉：0.06 g。

圖2 第二組6種不同組合培養(yǎng)基配方的增菌效果Fig.2 Effect of six different combinations of medium formulations for group 2

將5株菌株稀釋到100 CFU·mL-1后，加入上數(shù)據(jù)預增菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h后，稀釋涂布平板進行計數(shù)。其中，痢疾志賀氏菌菌落數(shù)達到1.5×107CFU·mL-1，金黃色葡萄球菌菌落數(shù)達到7.3×107CFU·mL-1，副溶血性弧菌菌落數(shù)達到3.6×107CFU·mL-1，陰溝腸桿菌菌落數(shù)達到7.3×106CFU·mL-1,產(chǎn)氣腸桿菌菌落數(shù)達到5.8×107CFU·mL-1，上述5種病原菌增殖后的菌落數(shù)目均達到熒光PCR檢測要求(103CFU·mL-1)。

2.2 最佳PMA濃度的優(yōu)化與PMA處理死菌的效果

通過配置一系列濃度梯度的PMA(0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 μg·mL-1)進行前處理，綜合評價不同PMA濃度對于死菌與活菌檢測的影響(圖3)，對于死菌擴增而言，隨著PMA濃度的增大，死菌DNA qPCR擴增曲線的Ct值明顯升高，當PMA濃度超過35.0 μg·mL-1時，反應體系的Ct值幾乎不再發(fā)生變化。當PMA 濃度超過40.0 μg·mL-1時，與空白對照(不加PMA)相比，活菌DNA qPCR擴增曲線的Ct值增加，可能原因是高濃度PMA 影響了活菌DNA的qPCR擴增，綜上，本研究選用35.0 μg·mL-1PMA作為最佳處理濃度。

圖3 不同濃度梯度的PMA對于DNA擴增的影響Fig.3 Effects of PMA with different concentration gradients on DNA amplification

2.3 最佳曝光時間的優(yōu)化

如圖4所示，在0～25 min時間范圍內，隨著光照時間的增加，qPCR擴增曲線的Ct值迅速升高，光照時間超過25 min后，反應體系的Ct值不再發(fā)生明顯變化，本研究選取25 min作為最佳曝光時間。

圖4 不同曝光時間對于DNA擴增的影響Fig.4 Effects of different exposure times on DNA amplification

2.4 PMA-qPCR檢測不同比例目標病原菌的線性曲線

配制10～107CFU·mL-1濃度的金黃色葡萄球菌病原菌菌懸液，在PMA濃度為35.0 μg·mL-1的條件下處理25 min，利用qPCR進行目標病原菌檢測。檢驗結果顯示(圖5)，隨著目標病原菌含量的增加，擴增曲線Ct值明顯降低，在10～107CFU·mL-1病原菌菌液濃度范圍內，Ct值與菌液濃度呈現(xiàn)良好的線性關系，線性回歸方程為:y=-3.400 8x+41.537,R2= 0.976 8，方程中y代表DNA qPCR擴增的Ct值，x代表金黃色葡萄球菌菌液濃度的對數(shù)值。

圖5 不同濃度梯度病原菌qPCR檢測結果的線性曲線Fig.5 Linear curve of qPCR detection results of different concentration gradient pathogens

2.5 病原菌單重實時熒光PCR試驗結果與方法特異性

在非目標菌存在的情況下，針對目標菌檢驗的引物和探針只能在目標菌DNA中出現(xiàn)擴增曲線，而其他非目標菌中均未見擴增曲線(圖6)。

圖6 9種病原菌的單重實時熒光PCR擴增圖Fig.6 Single real-time PCR assaies of nine pathogenic bacterias

試驗結果顯示，本研究設計的引物與探針對目標病原菌的PCR擴增效果良好，特異性好，對于非目標菌株DNA如大腸埃希氏菌DNA未見擴增曲線，抗干擾能力較強。

2.6 多重實時熒光PCR試驗結果

本研究分別嘗試了不同引物、探針在多重實時熒光PCR反應的擴增效率，通過試驗比較，發(fā)現(xiàn)三重反應的效率最佳，通過優(yōu)化組合開展多種病原菌的實時熒光PCR反應，篩選出最佳的熒光報告基團與淬滅基團。

優(yōu)化后的多重實時熒光PCR反應體系為(50 μL)： PCR預混液25 μL，上、下游引物各1.5 μL，探針1.0 μL, DNA 3.0 μL, ddH2O補足體積至50 μL。實時熒光PCR儀器設定的反應程序為：94 ℃ 10 min；94 ℃ 15 s，59 ℃ 1 min，45個循環(huán)。

研究將痢疾志賀氏菌、陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌、蠟樣芽胞桿菌、大腸桿菌O157∶H7、副溶血性弧菌這9種病原菌分為3組分別開展多重實時熒光PCR試驗，熒光信號未見干擾(圖7)。

2.7 病原菌檢測低限

將菌液濃度分別為1.3×107CFU·mL-1的沙門氏菌、3.6×107CFU·mL-1的金黃色葡萄球菌、1.5×107CFU·mL-1的蠟樣芽胞桿菌、2.7×107CFU·mL-1的副溶血性弧菌、5.1×107CFU·mL-1的大腸埃希氏菌O157:H7、2.9×107CFU·mL-1的單核細胞增生李斯特氏菌、3.0×107CFU·mL-1痢疾志賀氏菌、6.3×107CFU·mL-1陰溝腸桿菌、2.9×107CFU·mL-1產(chǎn)氣腸桿菌分別進行10倍系列稀釋，探索方法檢測低限。

如圖8所示，通過重復試驗與平行試驗確認，9種病原菌的方法檢測低限均可達到103CFU·mL-1。

2.8 方法間比對試驗

本研究在開發(fā)餐飲食品等食品快速檢測PMA-qPCR方法的同時，在標準菌株加入試驗以及樣品測試試驗時，同時應用國家標準GB 4789系列標準作為參照方法開展方法比對工作，檢驗結果表明，本研究方法檢驗結果與國家標準方法檢驗結果相吻合。

3 討論

本研究完成了痢疾志賀氏菌(Sh.dysenteriae)、陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)、沙門氏菌(Salmonella)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)、副溶血性弧菌(Vibrioparahemolyticus)、大腸埃希氏菌O157:H7 (EscherichiacoliO157∶H7)、單核細胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)等9種病原菌的快速檢測方法開發(fā)工作?？紤]到PCR方法抗干擾能力強，在多種病原菌混合溶液中可有效檢測出目標菌，為了提升檢測效率與縮短檢測時間，本研究首先優(yōu)化了培養(yǎng)基配方，開發(fā)了適用于多種病原菌預增菌用通用型培養(yǎng)基。采用高溫裂解法提取樣本中病原菌DNA，采用PMA染料選擇性滅活死菌DNA，鑒別活菌，采用多重實時熒光PCR方法檢測目標病原菌特異性基因片段。

引物和探針的設計與合成質量直接關系，PCR反應的靈敏度與特異性是實時熒光PCR反應靈敏度與檢測效率的關鍵。本研究在引物與探針的設計與合成方面，分別以9種目標病原菌的保守基因序列為靶基因序列，設計了引物與探針序列，為了完成多重檢測，在不同的探針上標記了不同的熒光標記基團。qPCR檢驗結果顯示，本文所設計的引物探針僅針對目標菌DNA有擴增曲線，特異性好,靈敏度較高,抗干擾能力強。進一步通過優(yōu)化引物探針濃度與退火溫度等反應體系條件，充分保證了qPCR方法重復性與穩(wěn)定性。

a—沙門氏菌; b—金黃色葡萄球菌; c—副溶血性弧菌；d—蠟樣芽胞桿菌; e—大腸桿菌O157∶H7; f—單核細胞增生李斯特氏菌；g—痢疾志賀氏菌; h—陰溝腸桿菌; i—產(chǎn)氣腸桿菌圖7 多重實時熒光PCR擴增圖Fig.7 Multiplex real-time PCR assay

每張圖中曲線由上至下濃度依次為107、106、105、104、103、102、10 CFU·mL-1。圖8 不同濃度梯度病原菌的方法檢測低限Fig.8 qPCR detection limits of pathogenic bacterias with different concentration

在檢驗周期方面，現(xiàn)行國家標準對于病原菌的檢驗一般需要4～7 d時間，確證時間則更長，無法滿足餐飲食品檢驗時效性需求，餐飲食品急需開發(fā)快速高通量的病原菌篩查檢測方法。應用本研究方法可在16 h內完成餐飲食品中9種病原菌的檢測，測定低限可低至103CFU·mL-1，可滿足食品特別是餐飲食品的快速檢測需求，適用于大規(guī)模樣品的高通量篩查檢測，具有較為廣泛的應用前景與現(xiàn)實意義。本研究研發(fā)的預增菌培養(yǎng)基以及多重實時熒光PCR快速檢測方法可進一步完善與優(yōu)化，開發(fā)出商業(yè)化通用型檢測試劑盒，具有較高的商業(yè)價值與應用前景。