高海明,趙彥艷

中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院臨床遺傳科, 沈陽 110004

出生缺陷是導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎、新生兒死亡和嬰兒死亡的重要原因[1]，我國每年新增的出生缺陷數(shù)約90～100萬例，給家庭和社會造成極大的負(fù)擔(dān)，嚴(yán)重影響人口素質(zhì)[2]。因此，如何有效預(yù)防出生缺陷、降低其發(fā)生率、增強(qiáng)國民身體素質(zhì)成為了公共衛(wèi)生領(lǐng)域的重大課題。21-三體綜合征、18-三體綜合征及13-三體綜合征是新生兒常見的先天性染色體異常及缺陷疾病，在孕早期進(jìn)行有效的胎兒染色體異常篩查對于改善孕婦分娩結(jié)局及保證嬰兒健康具有重要意義[3-4]。遺傳學(xué)診斷是指采用分子生物學(xué)技術(shù)對受檢者全部或部分基因組信息進(jìn)行檢測和分析，再結(jié)合臨床信息來明確患者的遺傳學(xué)病因，為臨床診斷和遺傳咨詢提供指導(dǎo)。常用的遺傳學(xué)診斷技術(shù)包括核型分析、一代測序、二代測序及三代測序等。1977年，以末端終止法為特征的第一代測序即Sanger測序被發(fā)明，其測序讀長可達(dá)1 000 bp，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，目前仍作為絕大多數(shù)遺傳學(xué)測序診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[5-6]。但由于Sanger測序依賴于PCR聚合酶和毛細(xì)管電泳，其測序成本高、分析速度慢，難以滿足越來越大的測序需求。隨著人類基因組計劃(human genome project，HGP)的完成，通量更高、更經(jīng)濟(jì)的測序技術(shù)——高通量測序(high throughput sequencing，HTS)的開發(fā)和商業(yè)化應(yīng)運而生。HTS又被稱為二代測序(next generation sequencing，NGS)，與Sanger測序最大的不同的之處在于,NGS可以同時對幾十至幾百萬條DNA短片段進(jìn)行獨立的大規(guī)模平行測序，配合下游的生物信息學(xué)分析來實現(xiàn)基因組測序[7]。此外，為了彌補NGS讀長較短的問題，第三代測序技術(shù)也初露鋒芒，憑借其長讀長的獨特優(yōu)勢在臨床應(yīng)用中占據(jù)一席之地。多種測序技術(shù)各有特點，互為補充，共同為遺傳學(xué)診斷提供了有力的檢測手段[8]?；诖耍疚膶Χ叭鷾y序技術(shù)的原理、分類及其在臨床遺傳學(xué)診斷的應(yīng)用進(jìn)展做一綜述，以期為臨床測序方案的選擇提供思路和指導(dǎo)。

1 二代及三代測序技術(shù)的原理和分類

1.1 NGS原理與分類

高通量測序原理為合成測序(sequencing by synthesis，SBS)，是Sanger測序的進(jìn)一步發(fā)展，主要步驟包括基因組打斷、建庫和測序。首先將待測DNA分子打斷為長約幾十到幾百bp的片段，將其分散至數(shù)百萬個反應(yīng)孔中或固定于芯片上，經(jīng)過PCR或等溫擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行DNA預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)，并通過檢測帶不同熒光標(biāo)記的核苷酸或反應(yīng)副產(chǎn)物來提供基因組信息[9]。

目前絕大部分NGS平臺均采用SBS，但不同平臺的核心技術(shù)有所區(qū)別，如Roche(焦磷酸測序)[10]、Illumina(橋式PCR)[11]、Ion PGM(半導(dǎo)體H+測序)[12]以及華大智造研發(fā)的首個國產(chǎn)測序平臺BIGSEQDNA(納米球測序)[13]。Roche 454焦磷酸測序是最早出現(xiàn)的二代測序系統(tǒng)，是通過檢測DNA合成反應(yīng)時釋放的焦磷酸(PPi)來讀取堿基信息。微乳液PCR(emulsion PCR，emPCR)可以將單個DNA片段與磁珠鏈接，磁珠被小油滴包被后進(jìn)行獨立的擴(kuò)增，使每個磁珠上均為同一DNA片段的數(shù)百萬個拷貝簇。每一輪堿基合成反應(yīng)時只加入1種dNTP，如果它剛好能與模板匹配，則會合成到引物3′端，釋放出與光反應(yīng)偶聯(lián)的PPi從而實現(xiàn)測序[10-11]。Roche 454焦磷酸測序讀長最長，但成本較高，目前其配套的測序儀已停產(chǎn)，退出了主流的二代測序市場。

目前，Illumina占據(jù)了二代測序市場的絕大部分份額，其核心技術(shù)為橋式PCR和可逆終止子技術(shù)，即將基因組打斷、變性為單鏈，通過與芯片表面的引物堿基互補被固定于芯片上，形成“橋”，經(jīng)過PCR反應(yīng)使每個分子獲得了1 000倍擴(kuò)增，成為單克隆DNA簇。測序反應(yīng)時加入帶有4種熒光標(biāo)記的dNTP“可逆終止子”[14]，通過切割其3′羥基末端的特殊基團(tuán)使聚合反應(yīng)反復(fù)起始和終止，并記錄熒光信號以得到序列信息。與照相機(jī)成像檢測相比，帶有熒光標(biāo)記的堿基可以直接成像從而提高檢測速度[11]。Ion Torrent半導(dǎo)體測序技術(shù)的出現(xiàn)拓展了測序市場，其配套測序儀Ion PGM是目前市場上最便宜的測序儀，可將核苷酸序列直接轉(zhuǎn)換為半導(dǎo)體芯片上的數(shù)字信息。DNA合成反應(yīng)中會釋放出H+導(dǎo)致溶液pH變化，該平臺利用離子傳感器將溶液pH的變化記錄為堿基信息，在該過程中不使用熒光或化學(xué)發(fā)光，不需要相機(jī)、光源或掃描儀，因此大大加快了測序過程，使Ion Torrent成為二代測序市場上的新流行[12]。

華大智造作為后起之秀，開啟了國產(chǎn)測序儀的高通量時代。其測序平臺BGISEQ的獨特之處在于文庫構(gòu)建過程，在建庫時基因組DNA被打斷、變性、環(huán)化為單鏈環(huán)狀，利用DNA分子滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(rolling circle amplification，RCA)用以制備DNA納米球(DNA nanoballs，DNBs)，并使用聯(lián)合探針錨定聚合技術(shù)(combinatorial probe-anchor synthesis，cPAS)使測序引物錨定分子和熒光探針在DNA納米球上進(jìn)行聚合反應(yīng)，利用高分辨成像系統(tǒng)對光信號進(jìn)行采集從而獲得序列信息[13,15]。華大已推出了多種不同通量的測序儀供用戶選擇，并且配套有相應(yīng)的自動化樣本制備系統(tǒng)，對于臨床檢測來說具有極大的優(yōu)勢[16]。上述不同NGS平臺的比較見表1。

表1 不同NGS平臺對比Table 1 Comparison of characteristics of different NGS platforms

1.2 三代測序的原理與分類

與二代測序技術(shù)相比，三代測序不需要經(jīng)過PCR擴(kuò)增，并且可以實現(xiàn)超長讀長測序。目前市場上可供選擇的三代測序技術(shù)主要有兩大平臺：PacBio公司開發(fā)的單分子實時測序(single molecule real-time，SMRT)技術(shù)[17]和納米孔單分子測序技術(shù)(Oxford nanopore technologies，ONT)[18]。SMRT技術(shù)可以實時記錄被熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸的強(qiáng)度變化，這種熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸不會影響DNA聚合酶的活性，并且在熒光被切除之后，合成的DNA鏈和天然的DNA鏈完全一致[19]。較之二代測序，SMRT測序速度很快，每秒約10個dNTPs，但是通量低，1個SMRT芯片池上有150 000測序單元，但是只有35～70 000個發(fā)生有效測序；另外SMRT的連續(xù)堿基序列(continuous long read，CLR)錯誤率高達(dá)11%～15%，但是不同于NGS偏向性的錯誤，SMRT測序錯誤是隨機(jī)的，可以通過足夠的測序次數(shù)來糾正，15次測序CLR準(zhǔn)確率超過99%[17]。ONT是采用電泳技術(shù)驅(qū)動單個分子逐一通過納米孔，根據(jù)A、G、C、T這4種堿基的帶電性質(zhì)不同，通過電信號的差異就能檢測出通過的堿基類別，從而實現(xiàn)測序[20-21]。ONT單堿基錯誤率高，為隨機(jī)錯誤，但可通過提高測序深度進(jìn)而提高堿基準(zhǔn)確率。相比于二代測序，長讀長是三代測序的關(guān)鍵優(yōu)勢，而通量低、錯誤率高、單堿基成本高是三代測序的缺陷[22]。對于臨床檢測可以采用二代測序高通量和準(zhǔn)確度高的短讀長片段對三代測序的長讀長片段進(jìn)行修正[23]，目前三代測序特別適合于全基因組denovo測序、甲基化研究、點突變檢測、特殊基因區(qū)域檢測等[24-27]。

2 二代及三代測序技術(shù)在遺傳學(xué)診斷中的應(yīng)用

以高通量測序技術(shù)、三代測序技術(shù)為代表的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)在遺傳學(xué)領(lǐng)域的推廣應(yīng)用，正在逐漸改變醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)的現(xiàn)狀，無創(chuàng)產(chǎn)前篩查(non-invasive prenatal testing，NIPT)、染色體拷貝數(shù)變異檢測、單基因病的篩查和診斷都是其應(yīng)用領(lǐng)域。研究人員或臨床醫(yī)師可以根據(jù)不同的檢測需求選擇適合的測序方案，以提高疾病診斷率，為遺傳病家庭帶去福音，實現(xiàn)社會資源的最大化利用。

2.1 NGS在NIPT的應(yīng)用

2.1.1胎兒染色體非整倍體異常 早在1997年，就有科學(xué)家證實婦女在懷孕期間其外周血循環(huán)有胎兒游離DNA(cell-free fetal DNA，cffDNA)的存在[28]；2008年Quake團(tuán)隊報道了cffDNA-NIPT技術(shù)(cffNIPT)，該方法基于高通量測序平臺對孕婦外周血中的cffDNA進(jìn)行低深度全基因組測序，并結(jié)合生物信息學(xué)分析方法，完成了胎兒13/18/21號染色體非整倍體檢測[29]，自此基于cffDNA的NIPT開始在臨床中應(yīng)用。目前，NIPT作為孕期常規(guī)篩查手段用于上述常染色體及性染色體非整倍體的篩查[30]。國內(nèi)主流的三大NIPT平臺為：達(dá)安DA8600(基于Ion Proton測序平臺)、貝瑞和康NextSeq CN500(與Illumina合作生產(chǎn))以及華大基因的BGlSEQ500。大規(guī)模人群研究證實NIPT對于13/18/21號染色體拷貝數(shù)異常的檢測特異性均大于99.9%；檢測敏感性方面T21最高，可達(dá)到99.5%，T18為93.1%，T13敏感性略低，為92.7%[31]。多項研究均證明NIPT對于T13/18/21檢出的準(zhǔn)確率均高于傳統(tǒng)血清學(xué)篩查[32]，是一種更適合于高危人群的產(chǎn)前篩查的選擇；而對于大眾群體來說，NIPT的檢測成本與實際效果還需要從政府、社會和個人角度等進(jìn)一步明確[33-34]。

2.1.2胎兒染色體微缺失和微重復(fù) 染色體亞結(jié)構(gòu)異常(微缺失和微重復(fù))會導(dǎo)致胎兒的身體或智力發(fā)育嚴(yán)重異常，在大約6%的B超結(jié)果異常和1.7%的高齡或唐氏綜合征篩查陽性的孕婦中存在染色體微缺失和微重復(fù)，且其發(fā)生率與孕婦年齡無明顯相關(guān)性[30]。因此，對所有年齡段孕婦均應(yīng)在產(chǎn)前行胎兒染色體微缺失和微重復(fù)檢測。近年來,NIPT也被用于染色體微缺失微重復(fù)疾病的篩查[30]。張春花等[35]對國內(nèi)三大NIPT平臺染色體微缺失、微重復(fù)檢測效果進(jìn)行評估，從數(shù)據(jù)量、陽性預(yù)測值、假陽性率方面比較后發(fā)現(xiàn)，BGISEQ500有效數(shù)據(jù)量和陽性篩查率明顯高于DA8600和NextSeq CN500，三大平臺的陽性預(yù)測值沒有顯著差異。隨著高通量測序的發(fā)展和優(yōu)化，單樣本的檢測成本在不斷下降，對人類基因組變異與疾病間關(guān)系的進(jìn)一步明確和深入，最終以NIPT取代血清學(xué)篩查是產(chǎn)前篩查發(fā)展的必然趨勢，并且NIPT在微缺失/微重復(fù)綜合征篩查方面的應(yīng)用將會更加廣泛。

2.1.3胎兒單基因病 單基因病無創(chuàng)產(chǎn)前篩查也是NIPT的重要研究方向，已有亨廷頓舞蹈病、地中海貧血、囊性纖維化、肝豆?fàn)詈俗冃?、杜氏肌營養(yǎng)不良的NIPT報道[36-39]。Wang等[40]針對α/β地中海貧血的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測開發(fā)了一套針對HBA1、HBA2和HBB基因的SNP探針，收集地中海貧血家系的gDNA及胎兒游離DNA并對目標(biāo)區(qū)域靶向測序，使用隱馬爾科夫模型(hidden Markov model，HMM)和Viterbi算法構(gòu)建親本單體型來分析胎兒基因型，從而完成地中海貧血家系的產(chǎn)前診斷?；诙鷾y序平臺的單基因病NIPT需要依賴生物信息學(xué)的算法，如相對突變劑量(relative mutation dosage，RMD)和相對單倍劑量(relative haplotype dosage，RHDO)，來構(gòu)建親本、先證者以及胎兒單倍型來對連鎖位點進(jìn)行檢測[41-42]，其準(zhǔn)確性還需要更多人群的大規(guī)模驗證，對于臨床應(yīng)用的實際效用尚需謹(jǐn)慎討論。另外，采用10×genomics測序進(jìn)行長讀長測序也是單基因病NIPT研究的重要手段。Jang等[39]采用10×genomics靶向linked-reads測序技術(shù)，將單個長片段的DNA分子分配至不同的油滴中，并通過GEM建庫技術(shù)，將長片段DNA切割成適合測序的大小，并且來源于相同油滴(同一條長片段DNA)的DNA片段會帶上相同的DNA序列標(biāo)記(barcode)，經(jīng)測序拼接后理論上可以得到原先的長片段DNA序列。研究人員收集了5名DMD突變攜帶者孕婦的血漿DNA并進(jìn)行靶向linked-reads測序分析，最終成功判斷胎兒基因型以及目標(biāo)區(qū)域的染色體重組情況。該方法能夠提示DMD基因大片段缺失、重復(fù)，可以直接對胎兒游離DNA進(jìn)行單倍體分析而無需對先證者gDNA測序，但其建庫費用十分昂貴，檢測周期更長(3周)，而且單基因病NIPT的臨床適用性研究較少，該方法最終是否可以在臨床上推廣應(yīng)用還需進(jìn)一步探討。

2.2 NGS在染色體病診斷中的應(yīng)用

我國每年約有10萬染色體異常患兒出生，每1 000個活產(chǎn)嬰中就有5～10個發(fā)生染色體異常[43]。在基因測序出現(xiàn)之前，臨床上針對遺傳病主要是在細(xì)胞水平對染色體行G顯帶核型分析，該方法可以直觀地觀察染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)變異，是檢測染色體異常的金標(biāo)準(zhǔn)[44-45]。然而，核型分析細(xì)胞培養(yǎng)耗時長、效率低，而且僅能分辨5～10 Mb以上大小的結(jié)構(gòu)變異，對染色體的微缺失、微重復(fù)的分辨不足，且不能精確定位變異染色體位置和大小。低深度全基因組測序(copy number variation sequencing，CNV-seq)的出現(xiàn)彌補了核型分析分辨率不足的缺陷[46]，是高通量測序在染色體拷貝數(shù)變異檢測中的重要應(yīng)用。CNV-seq通過低深度全基因組測序及下游生物信息學(xué)分析對染色體拷貝數(shù)異常檢測，分辨率可達(dá)100 kb。Zhang等[47]對160名妊娠高風(fēng)險或遺傳病高風(fēng)險人群進(jìn)行CNV-seq分析，結(jié)果顯示近一半(44.6%)的高危妊娠孕婦檢出染色體異常，不良孕產(chǎn)史和遺傳病家族史個體中檢出染色體異常的比例更高，分別為67.6%和55%。鑒于CNV-Seq對于染色體微缺失、微重復(fù)檢測的高度特異性和一致性，其已逐漸成為了診斷染色體病的首選方法[48]。目前臨床上已將CNV-seq用于染色體病的產(chǎn)前診斷、攜帶者篩查以及植入前遺傳學(xué)診斷[35]。

2.3 NGS及三代測序在單基因病診斷中的應(yīng)用

NGS按照其對基因組的檢測范圍可分為靶向測序(target gene sequecing，TGS)、全外顯子測序(whole exome sequencing，WES)、全基因組測序(whole genome sequencing，WGS)。TGS是通過選取部分與待檢疾病密切相關(guān)的基因進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域富集測序，單次檢測價格更為低廉，易被患者所接受，在內(nèi)分泌疾病、神經(jīng)肌肉病等系統(tǒng)性疾病中應(yīng)用較多。WES是利用序列捕獲技術(shù)將全外顯子區(qū)域DNA捕捉并富集后進(jìn)行高通量測序的基因分析方法，其對遺傳性疾病的臨床分子診斷率約為25%～50%[49-51]。由于外顯子組序列約占人類全部基因組序列的1%，但其包含了大約95%的致病突變[52]，因此目前對于大部分單基因遺傳病來說，WES是最具性價比的NGS手段，而且WES具有可回溯性，隨著疾病與基因之間的關(guān)聯(lián)認(rèn)知逐漸深入，WES數(shù)據(jù)的重分析對于指導(dǎo)臨床診斷具有極大的價值。WGS是對人類所有基因組信息(包括蛋白質(zhì)編碼區(qū)以及大量非編碼區(qū))進(jìn)行測序，具有測序面廣、檢測基因變異類型全等優(yōu)點，但過高的價格限制了其在臨檢中的應(yīng)用，目前主要用于科研用途。這3種方式各有利弊，在臨床中應(yīng)根據(jù)每種測序技術(shù)的特點和局限性以及臨床目的來選擇最適合的測序策略。

按照單基因病的致病機(jī)制，可將基因組序列變異類型分為單核苷酸變異(single nucleotide variant，SNV)、結(jié)構(gòu)變異(structural variants，SV)、拷貝數(shù)變異(copy number variations，CNV)、插入/缺失(insertion-deletion，InDel)以及動態(tài)突變、甲基化異常等。NGS尤其適合于SNV及InDel的檢測，但受限于其技術(shù)特點，NGS對于高GC含量或堿基高度重復(fù)區(qū)域的檢測并不準(zhǔn)確，因此對于特殊致病機(jī)制的單基因病，例如動態(tài)突變的檢測，可以采用三代測序以彌補NGS的缺陷。對于發(fā)生于基因組外顯子區(qū)或明確靶區(qū)域的SNV或InDel，可以選擇WES或TGS；發(fā)生于全基因組的SNV、InDel可以選擇WGS[53]；對于復(fù)雜的染色體平衡異位或SV、CNV，NGS并非最佳檢測手段，應(yīng)首選染色體微陣列分析(chromosomal microarray analysis，CMA)、核型分析或CNV-Seq以明確發(fā)生變異的染色體，再根據(jù)細(xì)胞遺傳學(xué)結(jié)果和臨床需要考慮采用WGS或三代測序進(jìn)行斷點分析。

2.3.1SNV、Indel的檢測 對于臨床診斷較為明確、致病基因有限或突變機(jī)制復(fù)雜的單基因病，應(yīng)用TGS能夠保證足夠的測序深度，不僅能夠反映SNV、Indel，還能一定程度上檢出CNV等復(fù)雜致病變異[54]，使臨床檢測具有更高的針對性；對于臨床癥狀不典型、難以確診的遺傳病，WES較TGS有更大的覆蓋范圍，能從全外顯子組的水平對基因功能區(qū)進(jìn)行評估，有利于快速地診斷。先天性甲狀腺功能減低癥(congenital hypothyroidism，CH)是一種常見的新生兒內(nèi)分泌疾病，其中甲狀腺發(fā)育異常是造成CH的最主要原因，孔靜等[55]針對甲狀腺發(fā)育異常相關(guān)致病基因的熱點突變的外顯子及外顯子-內(nèi)含子交界區(qū)域設(shè)計靶向panel，對89例CH患兒進(jìn)行檢測，最終有19例患者檢出潛在致病突變，17例為TSH基因突變，其中有4個為新發(fā)突變。WES尤其適合單基因病的SNV、Indel的臨床檢測，其可回溯性對于提高臨床診斷率具有重要作用。此外，有研究者對比了WES和WGS在SNV和Indel的檢測中的表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)兩者都檢出了編碼區(qū)域中超過96.0%的高質(zhì)量SNV和78.0%的高質(zhì)量Indel，但是在SNV檢測方面WGS比WES更為強(qiáng)大，其假陽性率分別為17%(WGS)和78%(WES)，而且從覆蓋深度(coverage depth，CD)、基因型質(zhì)量值(genotype quality，GQ)和低覆蓋區(qū)域比例(minor-read ratio，MRR)等參數(shù)的總體分布來看，WGS能夠提供更為優(yōu)質(zhì)均一的測序質(zhì)量[56]。

2.3.2CNV的檢測 WES和WGS可以從基因組全局水平提示基因組大片段CNV，該優(yōu)勢可以提高致病位點檢出率。Pfundt等[57]對2 603例遺傳性疾病患者的WES 數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，最終確定了123個致病性CNV，大小從727 bp到15.3 Mb不等，總體診斷率提高了約2%。隨著對基因與疾病認(rèn)識的不斷深入，相關(guān)數(shù)據(jù)庫也在更新和完善，未明確診斷的患者的WES數(shù)據(jù)重分析對于提高臨床診斷率也不容忽視。Ewans等[58]對來自37個家系共54名遺傳病患者的WES進(jìn)行了重新分析以鑒定其遺傳病因，包括對患者表型的準(zhǔn)確分析、內(nèi)部變異數(shù)據(jù)庫檢索以及新疾病基因的鑒定，最終明確了4個家系的遺傳學(xué)病因，整體診斷率由最初的30%提高到41%。另外從成本效益角度分析，WES與傳統(tǒng)診斷手段相比可以大大節(jié)省遺傳病的診斷成本。研究人員建議對于遺傳病患者應(yīng)盡早進(jìn)行基因組測序，以便為后續(xù)疾病診斷、治療乃至生育指導(dǎo)提供依據(jù)。

2.3.3SV的檢測 結(jié)構(gòu)變異(structural variants，SV)的鑒定對于疾病的遺傳學(xué)診斷也尤為重要，約有5%～20%的遺傳病由SV致病[59-62]，核型分析和染色體微陣列雖然價格低廉，但不能檢出準(zhǔn)確的斷點信息以及小片段SV。理論上WGS能提供全部基因組信息，Currall等[63]開發(fā)了一種針對大片段SV(>5 000～10 000 bp)的特殊WGS建庫技術(shù)——large inserts文庫(large inserts libraries，liWGS)來最大程度地提高覆蓋率。染色體平衡異常(balanced chromosomal abnormalities，BCA)常用核型分析和CMA來檢測，有研究表明有多達(dá)40%的BCA可以被CMA作為非平衡異常而檢出，因此對于復(fù)雜結(jié)構(gòu)變異或平衡異常，可以通過傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)手段檢測后再采用liWGS進(jìn)一步分析斷點信息，提高SV檢出率。Redin等[64]對273名預(yù)先經(jīng)過CMA確認(rèn)的BCA患者采用liWGS測序，最終有90.8%患者明確了其平衡異常的斷點，但有9%的斷點無法檢出。

隨著測序技術(shù)和分析能力的提高，三代測序通過長讀長檢測可以直接反映基因組結(jié)構(gòu)變異，成為了SV鑒別的重要手段。Stancu等[65]使用MinION納米孔測序儀和NanoSV算法分析了2名具有復(fù)雜表型的先天性異?；颊呋蚪M，其中對于2號患者檢出了29個新發(fā)SV，提示了1、5和9號染色體的復(fù)雜重排，與46,XY,t(1;9;5)(complex)dn相吻合，該研究證明，可以利用納米孔測序來確定染色質(zhì)斷點的親本起源，其在新發(fā)染色質(zhì)重排檢測方面優(yōu)于NGS。

2.3.4動態(tài)突變的檢測 隨著基因檢測技術(shù)的發(fā)展，三代測序技術(shù)的應(yīng)用逐步提升，目前有研究將其用于全基因組短串聯(lián)重復(fù)變異檢測。脆性X綜合征(fragile X syndrome，F(xiàn)XS)是遺傳性智力障礙和自閉癥的最常見原因之一，是由FMR1基因(CGG)n區(qū)域重復(fù)次數(shù)過多(大于200次)而致。該區(qū)域為大量GC堿基重復(fù)，短讀長的NGS對位于此類區(qū)域的讀取表現(xiàn)不佳，為了解決該問題，Loomis等[59]采用SMRT技術(shù)對FXS患者FMR1基因(CGG)n區(qū)域進(jìn)行檢測，并且最終完成了長達(dá)2 kb的(CGG)n重復(fù)片段鑒定，其檢出的重復(fù)數(shù)高達(dá)750次。不同突變類型的檢測方式及測序平臺選擇見表2。

表2 不同變異類型的檢測方式及測序平臺選擇Table 2 Detection methods and sequencing platform selections of different variations

3 展望

自NGS發(fā)明以來，相應(yīng)的測序平臺不斷推陳出新，技術(shù)平臺的優(yōu)化和成本的急速降低促成了其在臨床檢測應(yīng)用的不斷擴(kuò)大。NGS技術(shù)極大地推動了精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，全面地改變了遺傳學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展面貌，也使遺傳學(xué)分子診斷迎來了一個新的技術(shù)時代。然而，不斷增加的測序需求量也對NGS平臺的硬件及軟件提出了更高的要求，對人類基因組測序的能力已大大超過遺傳變異的解讀能力，冗余的測序數(shù)據(jù)對數(shù)據(jù)管理、分析及變異解讀、數(shù)據(jù)庫的建立及更新提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[66]。NGS產(chǎn)生的大量原始序列數(shù)據(jù)依賴于生物信息學(xué)的分析，因此，生物信息技術(shù)對于NGS起著至關(guān)重要的作用。主要生物信息分析步驟均包括原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制、數(shù)據(jù)對比、對比后處理、變異識別、注釋、過濾及解讀，不同的NGS平臺所產(chǎn)生的測序數(shù)據(jù)類型有一定的差異，如Illumina和華大BGISEQ平臺產(chǎn)生的測序數(shù)據(jù)主要包含序列信息和相應(yīng)的堿基質(zhì)量值，而Ion Torrent平臺產(chǎn)生的測序數(shù)據(jù)除了以上信息外，還包含測序堿基信號值(flow signal)[12]。目前，應(yīng)用于臨床基因檢測的生物信息學(xué)分析流程都是實驗室內(nèi)部自建或第三方服務(wù)商提供，不同的測序平臺和測序范圍的數(shù)據(jù)分析流程及所使用的軟件有所差別，為了保證檢測的準(zhǔn)確性和可靠性，各個實驗室在建立生物信息分析流程時，需要設(shè)置必要的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)包括reads質(zhì)量、GC含量、比對率、reads比對質(zhì)量以及測序深度，還要明確檢測范圍、準(zhǔn)確度、分析敏感性、特異性等來確認(rèn)生物信息分析的性能，以保證達(dá)到預(yù)期的檢測目的[67-68]。

NGS在不同領(lǐng)域的應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)、倫理問題及檢測后的遺傳咨詢規(guī)范等也需要進(jìn)一步探討和完善[69]，2017年唐北沙等[53]制定了符合我國現(xiàn)實情況的人類孟德爾遺傳性疾病基因組序列變異解析規(guī)范，從臨床資料采集、二代測序選擇、質(zhì)控管理、生物信息分析、變異解讀原則及倫理學(xué)等方面對于遺傳病的變異解讀進(jìn)行了詳細(xì)的闡述。NGS的高速發(fā)展伴隨著機(jī)遇和挑戰(zhàn)，隨著其技術(shù)的不斷升級優(yōu)化和臨床經(jīng)驗的不斷積累，通過不同領(lǐng)域?qū)＜夜餐瑓f(xié)作以建立更加精準(zhǔn)的“基因-疾病”解讀指南是未來遺傳學(xué)檢測的發(fā)展方向，NGS終將會成為遺傳學(xué)領(lǐng)域主要且常規(guī)的檢測手段。

三代測序是人類遺傳學(xué)領(lǐng)域的重要里程碑，其特別適合于復(fù)雜的基因組組裝、串聯(lián)重復(fù)以及復(fù)雜的結(jié)構(gòu)重排、單倍型構(gòu)建等，但高昂的價格限制了其在常規(guī)臨檢的應(yīng)用，目前僅用于科研用途。三代測序技術(shù)在讀取的準(zhǔn)確性、相應(yīng)的分析算法以及檢測成本方面需要進(jìn)一步優(yōu)化和提升，在未來可以與NGS互為補充，為臨床遺傳學(xué)服務(wù)[70]。