解美霞,王燕,趙新,高越,劉雙,陳銳,蘭青闊,徐曉輝,曹際娟,王永*

1.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 天津 300381； 2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 河北 保定 071001;3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院, 河北 保定 071001;4.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 濟(jì)南 250100；5.大連民族大學(xué), 遼寧 大連 116600

基因編輯技術(shù)主要通過序列特異核酸酶特異切割DNA靶標(biāo)位點(diǎn)造成雙鏈斷裂，誘導(dǎo)DNA損傷修復(fù)機(jī)制對(duì)基因組的定向編輯?；蚓庉嫾夹g(shù)從出現(xiàn)以后就為全球的生物學(xué)家提供了一個(gè)新的研究思路。目前應(yīng)用廣泛的以Cas9蛋白以及向?qū)?RNA (gRNA)為核心組成的 CRISPR/Cas9 技術(shù)，應(yīng)用于編輯靶標(biāo)位點(diǎn)過程中，該方法簡便且編輯效率高，目前已被廣泛應(yīng)用于多種作物中[1-3]。應(yīng)用基因編輯技術(shù)不僅可以使農(nóng)作物表現(xiàn)出抗病蟲害的優(yōu)良性狀，同時(shí)還能使農(nóng)作物的產(chǎn)量大幅度提升[4-7]。目前這一技術(shù)在水稻中已有許多重大進(jìn)展：如通過基因編輯技術(shù)獲得產(chǎn)量的增加；通過基因編輯技術(shù)對(duì)水稻基因進(jìn)行替換和敲除從而獲得抗除草劑以及抗逆的優(yōu)質(zhì)水稻新品種[8-10]。

轉(zhuǎn)基因生物自出現(xiàn)以來就備受關(guān)注，到目前為止我國已有幾種作物被允許進(jìn)行轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的生產(chǎn)及加工。通過基因編輯技術(shù)編輯靶標(biāo)基因后，生物的全部遺傳物質(zhì)中只有少數(shù)基因發(fā)生了改變，尤其是一些少量或者單堿基插入缺失造成突變的基因編輯產(chǎn)物，這導(dǎo)致現(xiàn)有的一些轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)無法用于基因編輯產(chǎn)物的檢測(cè)。因此目前亟需新的檢測(cè)技術(shù)應(yīng)對(duì)越來越多的基因編輯生物，做好轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)工作，為農(nóng)業(yè)的生產(chǎn)與發(fā)展提供技術(shù)支撐。

焦磷酸測(cè)序(pyrosequencing)技術(shù)是通過 4 種酶(ATP硫酸化酶、DNA聚合酶、三磷酸腺苷雙磷酸酶以及熒光素酶)共同催化反應(yīng)體系的一種酶級(jí)聯(lián)化學(xué)反應(yīng)。該技術(shù)可用于對(duì)已知短序列的測(cè)序分析，不需要熒光標(biāo)記引物及電泳檢測(cè)。相比較其他測(cè)序方法，焦磷酸測(cè)序技術(shù)具有實(shí)時(shí)檢測(cè)、分析快速準(zhǔn)確等特性[11-12]。目前已成為單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)基因分型、突變檢測(cè)等的一種有效手段。由于基因編輯產(chǎn)物大多是通過突變、敲除或者插入幾個(gè)堿基，類似于物種的定向突變，因此利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品就成為了可能。

本研究利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè) CRISPR/Cas9 編輯技術(shù)誘導(dǎo)的水稻PL3基因中的靶向突變，以期建立一種基因編輯水稻檢測(cè)技術(shù)，期望本研究能夠在現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)體系中進(jìn)行提升及補(bǔ)充，從而更好更快的開展轉(zhuǎn)基因檢測(cè)工作，并為其他基因編輯產(chǎn)物的檢測(cè)提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試基因編輯型水稻與親本日本晴(野生型水稻)均由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院基因功能研究團(tuán)隊(duì)提供?；蚓庉嬓退纠?CRISPR/Cas9 技術(shù)在 LOC_Os01g56780 位點(diǎn)誘導(dǎo)插入堿基 A，導(dǎo)致PL3基因功能發(fā)生改變。

1.2 試驗(yàn)儀器

Pyro Mark焦磷酸測(cè)序儀(Pyro Mark Q96 ID)、普通 PCR 儀(ABI Veriti 96)、凝膠成像儀(Azure C150)、電泳儀(EPS-3000-VII)、高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf Centrifuge 5810/5810 R)、恒溫水浴鍋(HH-600)、超微量分光光度計(jì)(Nanodrop 1000)。

1.3 試驗(yàn)試劑及配置

植物DNA提取試劑盒(TianGen公司)、DNA Marker(TaKaRa公司)、GelRed 染料、 2×GoTaq Green Master Mix(Promega公司)、乙二酸四乙酸二鈉(EDTA·Na2)；三羥甲基氨基甲烷(Tris)；冰乙酸； Binding Buffer(QIAGEN)； Annealing Buffer(QIAGEN)、Washing Buffer、Sepharose beads (Qiagen公司)。

1.4 DNA提取

將野生型水稻和編輯型水稻種子經(jīng)滅菌處理后種植并放入光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，待生長至3葉期時(shí)取植株幼嫩葉片組織。用液氮充分研磨葉片后取100 mg樣品粉末置于2 mL離心管中。使用植物 DNA 提取試劑盒提取水稻DNA，經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)定樣品DNA濃度后置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 焦磷酸測(cè)序引物設(shè)計(jì)及有效性檢測(cè)

使用 PSQ Assay Design 軟件設(shè)計(jì)焦磷酸測(cè)序PCR 擴(kuò)增引物(PL3-Pyro-F、PL3-Pyro-R、測(cè)序引物 PL3-Pyro-Seq)，引物由金唯智生物科技有限公司合成(表1)。

表1 焦磷酸測(cè)序引物Table 1 Pyrosequencing primer

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系參照 Pyro Mark Q96 ID焦磷酸測(cè)序儀使用說明書進(jìn)行設(shè)計(jì)。將野生型和基因編輯型水稻 DNA作為模板， PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系(50 μL)：2×PCR Master Mix 25 μL，PL3-Pyro-F 1 μL，PL3-Pyro-R 1 μL，DNA (25 ng·μL-1)2 μL， ddH2O 21 μL。PCR反應(yīng)程序設(shè)置為：94℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，50次循環(huán)；72 ℃ 7 min，4 ℃保存。待PCR反應(yīng)程序結(jié)束后使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增的 PCR 產(chǎn)物質(zhì)量，應(yīng)出現(xiàn)條帶清晰且單一的目的條帶，在該試驗(yàn)過程中同時(shí)加入一個(gè)空白樣品作為對(duì)照。將擴(kuò)增完成的PCR產(chǎn)物放入4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6 焦磷酸測(cè)序基因分型定性檢測(cè)

為保證本次試驗(yàn)的準(zhǔn)確性， Sepharose beads 在使用前要充分混勻，所有試驗(yàn)試劑需提前 15 min放至室溫。具體操作步驟如下：①在96孔酶標(biāo)板中加入47 μL Binding buffer 和3 μL Sepharose beads混勻后分別將電泳結(jié)束，剩余產(chǎn)物全部加入相應(yīng)酶標(biāo)板中，1 300 r·min-1混勻15 min；②將38.8 μL Annealing buffer 和1.2 μL測(cè)序引物加入測(cè)序反應(yīng)板中，混合均勻備用；③酶標(biāo)板中產(chǎn)物進(jìn)行單鏈分離且釋放到測(cè)序板中，反應(yīng)結(jié)束后將測(cè)序板置于金屬浴(80°C)反應(yīng)2 min，冷卻后放入Pyro Mark Q96 ID焦磷酸測(cè)序儀中進(jìn)行試驗(yàn)；④選擇 SQA系統(tǒng)模式，將酶、底物混合物和4種dNTP(A、T、C、G )依次加入試劑艙，根據(jù)分析序列(5′-[A]CAATCCGTTGGCTTCAATTC-TCTTT-3′)和系統(tǒng)自動(dòng)生成的噴入堿基順序(5′-GACATCG-3′)設(shè)置反應(yīng)程序進(jìn)行焦磷酸測(cè)序反應(yīng)。

1.7 焦磷酸測(cè)序基因分型定量檢測(cè)

將基因編輯型和野生型水稻 DNA 模板(25 ng·μL-1)按表2的比例均勻混合成 8 個(gè)濃度梯度(S1～S8)，S1～S6 用于繪制不同分型的標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)焦磷酸測(cè)序定量分析的能力；通過 S7～S8 進(jìn)行半定量檢測(cè)分析(盲樣)。參照 1.4 和 1.5 的方法步驟進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增和焦磷酸測(cè)序檢測(cè)試驗(yàn)。

表2 S1～S8焦磷酸測(cè)序模板體積比例Table 2 Volume ratio of S1～S8 pyrosequencing template (ng·μL-1)

2 結(jié)果與分析

2.1 PL3基因編輯水稻焦磷酸測(cè)序引物有效性檢測(cè)

本研究設(shè)計(jì)的擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)期長度為129 bp，通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所擴(kuò)增的 PCR 目的片段大小與預(yù)期片段長度相一致。焦磷酸測(cè)序引物 PCR 擴(kuò)增完成后(圖1)均出現(xiàn)清晰單一的特異性條帶，且對(duì)照(CK)未出現(xiàn)任何條帶。結(jié)果表明本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的焦磷酸測(cè)序引物有效性好,能夠滿足此次焦磷酸測(cè)序試驗(yàn)要求。

2.2 焦磷酸測(cè)序基因分型定性檢測(cè)結(jié)果

通過 Sequence to Analyze、Dispensation order和Pyro Mark 程序獲得基因編輯型和野生型的焦磷酸測(cè)序結(jié)果(圖2A)：G堿基(第一位)是試驗(yàn)反應(yīng)程序中設(shè)置的陰性對(duì)照，其高度為零，作為此次試驗(yàn)反應(yīng)程序的陰性質(zhì)控位點(diǎn)； A 堿基(第二位)為檢測(cè)靶標(biāo)位點(diǎn)，根據(jù)圖2中峰值高度可分為3種類型，分別為 -/- (野生型水稻)、A/A (編輯型水稻)、 A/- (雜合類型)； A 堿基與 C 堿基(第三位)和 T 堿基(第五位)高度相同，而 A 堿基(第四位)和 C 堿基(第六位)高度是其2倍，這些為陽性質(zhì)控位點(diǎn)。

以野生型水稻和編輯型水稻的 DNA 為模板對(duì)目的區(qū)域進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增和焦磷酸測(cè)序反應(yīng)檢測(cè)，使用系統(tǒng)中的 SNP 模式分析其測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)可自動(dòng)出現(xiàn)分型為“-/-”和“A/A”。同時(shí)在測(cè)序結(jié)果圖中看到所檢測(cè)的靶標(biāo)位點(diǎn)序列，在野生型樣品中沒有 A 堿基(第二位)，而在編輯型水稻樣品中檢測(cè)到該堿基(圖2B～C)，表明該技術(shù)可以有效區(qū)分野生型水稻與PL3基因編輯型水稻樣品。

注：M—DL 2000 marker；CK—空白對(duì)照；1，2—基因編輯型水稻 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；3，4—野生型水稻 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物圖1 焦磷酸測(cè)序引物 PCR 產(chǎn)物擴(kuò)增電泳圖Fig.1 Electrophoretic map of PCR products amplified by pyrosequencing primers

A：焦磷酸測(cè)序結(jié)果示意圖；B：基因編輯型水稻焦磷酸測(cè)序結(jié)果；C：野生型水稻焦磷酸測(cè)序結(jié)果圖2 PL3基因編輯型水稻和野生型水稻焦磷酸測(cè)序結(jié)果Fig.2 PL3 gene edited and wild type rice DNA template pyrosequencing results

2.3 焦磷酸測(cè)序基因分型定量檢測(cè)結(jié)果

通過 SNP 和等位基因頻率量化(allele frequencies quantification，AQ)兩種模式可對(duì)焦磷酸測(cè)序檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行有效檢測(cè)，并得到等位基因頻率和基因分型。本研究將2種水稻 DNA 按濃度梯度進(jìn)行相應(yīng)稀釋并混勻分析構(gòu)建了PL3基因編輯水稻的分型標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)焦磷酸測(cè)序的定量分析能力進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)基因編輯型水稻模板濃度逐漸上升時(shí)，[A]堿基的峰高度會(huì)逐漸下降(圖 3A )；同時(shí)選擇系統(tǒng)的 AQ 模式對(duì)該測(cè)序結(jié)果進(jìn)行定量分析發(fā)現(xiàn)，在S1～S6 樣品中該位點(diǎn)的 AQ 值會(huì)逐漸下降，平均值分別為97%、80%、48%、25%、16%、0；在S7～S8樣品中 AQ 值分別為66%、38%。發(fā)現(xiàn) AQ 值與編輯型水稻的 DNA 含量呈線性關(guān)系：斜率為 1.007(圖3B )。表明該方法可對(duì)PL3基因編輯型水稻進(jìn)行有效的定量檢測(cè)。

圖3 野生型和基因編輯型水稻不同濃度梯度測(cè)序結(jié)果(A)和標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(B)Fig.3 Sequencing results (A) and standard curve (B) of wild type and gene editing rice with different concentration gradients

3 討論

基因編輯技術(shù)是一種新興且較為精確的可對(duì)生物體基因組特定目的基因修飾的基因工程技術(shù)。 CRISPR/Cas9 技術(shù)是目前進(jìn)展最迅速的基因編輯技術(shù)，可對(duì)特定的 DNA 進(jìn)行靶向切割，導(dǎo)致目的基因發(fā)生定點(diǎn)突變。 CRISPR/Cas9 技術(shù)已在水稻、小麥、玉米三大作物上實(shí)現(xiàn)了高效精確的單堿基定點(diǎn)突變[13-15]。目前檢測(cè)基因編輯位點(diǎn)主要使用 Sanger法測(cè)序，但該方法耗時(shí)且不適于進(jìn)行大規(guī)模檢測(cè)，其他關(guān)于植物基因組編輯的檢測(cè)方法主要有 PCR/RE 法、錯(cuò)配切割法、TaqMan 法等，但這些方法操作復(fù)雜、要求高且適用性有限，不能廣泛應(yīng)用[16]。

焦磷酸測(cè)序是一種酶聯(lián)級(jí)聯(lián)測(cè)序技術(shù)，能夠?qū)σ阎绦蛄械臏y(cè)序分析進(jìn)行檢測(cè)。該方法操作簡單，可鑒定多種植物的病原微生物和成分。劉洪義等[17]通過焦磷酸測(cè)序法進(jìn)行短序列測(cè)序分析，用來鑒定馬鈴薯感染的PVY株系。金瑩等[12]利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)能夠有效檢測(cè)大豆過敏原成分。

在本研究中使用焦磷酸測(cè)序技術(shù)的兩種分析模式進(jìn)行基因定性和定量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該研究方法具有極高的準(zhǔn)確性，操作簡便，效率高，同時(shí)可檢測(cè)大量樣品。本研究在基因分型定性試驗(yàn)中對(duì)焦磷酸測(cè)序結(jié)果進(jìn)行定性分析，發(fā)現(xiàn)陰性質(zhì)控位點(diǎn)未出現(xiàn)峰，且陽性質(zhì)控位點(diǎn)與系統(tǒng)生成峰高度保持一致；在基因分型定量試驗(yàn)中對(duì)該檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn) AQ 值會(huì)隨編輯型模板含量的增加而升高。該方法可用來有效區(qū)分PL3基因編輯型水稻和野生型水稻。基于焦磷酸測(cè)序技術(shù)的基因編輯方法有望用于基因編輯產(chǎn)品檢測(cè)監(jiān)管。