外切纖維素酶的研究與應用進展

張清翠,石雅麗,劉安禮,胡建華,李永麗,孫亞超,何可欣,夏婷,鮑彥彬

內(nèi)蒙古工業(yè)大學化工學院食品與生物工程系，呼和浩特 010051

木質(zhì)纖維素是世界上含量最豐富的可再生生物質(zhì)資源，用纖維素生產(chǎn)酒精燃料和化學材料，有助于解決當下的能源危機和環(huán)境污染問題[1]。降解纖維素的常規(guī)方法主要有化學法和生物發(fā)酵法[2]?；瘜W法降解纖維素產(chǎn)生的副產(chǎn)物種類較多，使得目的產(chǎn)物的產(chǎn)率較低；而生物發(fā)酵法具有處理條件溫和、產(chǎn)物種類少且產(chǎn)率高等優(yōu)勢，因此，工業(yè)上首選生物發(fā)酵法降解纖維素，其中主要是利用纖維素酶降解纖維素[3]。

天然纖維素由數(shù)千至數(shù)萬個葡萄糖分子經(jīng)β-1,4-糖苷鍵連接而成[4]，而纖維素酶主要作用于反應底物的糖苷鍵，屬于糖苷水解酶家族。纖維素酶主要包含3大類：外切纖維素酶、內(nèi)切纖維素酶和β-葡萄糖苷酶[5]。其中，外切纖維素酶是降解纖維素的主要成分，可以將纖維素的晶體結(jié)構(gòu)打開，使其降解為無定型纖維素，釋放的主要產(chǎn)物為纖維二糖和纖維四糖，二者最終被β-葡萄糖苷酶水解成單糖和二糖[6]。外切纖維素酶因具有活性高、耐受性好、來源廣等特點而被廣泛應用[7]。基于此，本文主要闡述了外切纖維素酶的分類、來源以及生化特性，介紹了外切纖維素酶的篩選及其水解產(chǎn)物分析的相關新技術，并綜述了其在造紙業(yè)、食品加工業(yè)、能源再生等工業(yè)領域中的應用進展，以期推動外切纖維素酶的深入研究及工業(yè)化應用。

1 外切纖維素酶的分類

外切纖維素酶是一種于纖維素線狀分子尾部發(fā)揮功能的酶，能夠水解β-1,4糖苷鍵，其每次接觸纖維素線狀分子尾端就水解出1個纖維二糖分子，由此也被稱為纖維二糖水解酶(cellulose biohydrolase，CBH)[8]。

外切纖維素酶包括1,4-β-D-葡聚糖水解酶和1,4-β-D-葡聚糖纖維二糖水解酶，現(xiàn)在常用EC法、CAZy法和mycoCLAP法等來命名外切纖維素酶[9]。在國際命名EC法中，外切纖維素酶有2個編號：EC3.2.1.91和EC3.2.1.176。其中，編號為EC3.2.1.91的外切纖維素酶從纖維素鏈非還原末端起始催化，即CBHⅠ；編號為EC3.2.1.176的外切纖維素酶從纖維素鏈還原末端起始催化，即CHBⅡ[10]。CAZY數(shù)據(jù)庫(http：//www.cazy.org/)將現(xiàn)在已知的糖苷水解酶(glycoside hydrolase，GH)按照氨基酸序列的差別劃分成132個不同的序列家族，其中至少有17個家族被認為是含有纖維素酶的，但是在這17個家族中只有GH5﹑GH6﹑GH7﹑GH9和GH48這5個家族中含有外切纖維素酶[11]。GH家族與酶的國際系統(tǒng)分類編號的對應關系是：EC3.2.1.91/CBHⅠ對應GH5、GH6、GH9；EC3.2.1.176/CHBⅡ?qū)狦H7、GH9、GH48。此外，根據(jù)催化結(jié)構(gòu)域氨基酸序列的相似性，可將真菌來源的外切纖維素酶歸入GH6、GH7這2個家族；細菌來源的外切纖維素酶歸入GH5、GH6、GH9和GH48這4個家族(表1)[12-13]。而由mycoCLAP數(shù)據(jù)庫 (http://mycoclap.fungalgenomics.ca)給出的命名法可以看出酶的功能特性、糖苷水解酶家族歸類和來源微生物的各種種屬關系[4]，如名稱為CBH6A_COPCI的酶是指來自灰蓋鬼傘菌(Coprinopsiscinerea)、屬于GH6家族的纖維二糖水解酶。

表1 CAZy數(shù)據(jù)庫中含有外切纖維素酶的GH家族的統(tǒng)計信息[4]Table 1 The statistical information of GH family included exocellulase in CAZy database[4]

2 外切纖維素酶的來源以及生化特性

2.1 外切纖維素酶的來源

纖維素酶主要來源于真菌和細菌(好氧或厭氧)以及部分動植物。其中，木霉、青霉和黑曲霉是外切纖維素酶的主要來源[2]。真菌所產(chǎn)的外切纖維素酶簡稱CBH[9]；細菌所產(chǎn)的外切纖維素酶簡稱Cex[14]。

2.1.1真菌 目前，被普遍用于外切纖維素酶生產(chǎn)的菌株主要是絲狀真菌，包括木霉屬(Trichoderma)[15]、青霉屬(Pencillium)和曲霉屬(Aspergillus)[16]等。全球前沿的酶制劑生產(chǎn)集團，諾維信(Novozymes)和杰能科(Genencor)等，都使用里氏木霉作為外切纖維素酶的生產(chǎn)菌株[17]。里氏木霉表達分泌外切纖維素酶的能力較強，其在生物質(zhì)降解中的應用較廣。綠色木霉作為另一種能夠產(chǎn)外切纖維素酶的真菌，可以將作物中的纖維素轉(zhuǎn)化為糖，這樣不僅可以對廢棄物再次利用，還可以避免污染環(huán)境，有助于緩解當下所面臨的節(jié)能減排問題[18]。青霉屬中能夠分泌降解木質(zhì)纖維素的酶的種類很多[19]，其中以草酸青霉為代表，其他青霉(如微紫青霉和蠅狀青霉等)的產(chǎn)酶效率也很高[20]。青霉的生長速度較快，且在酶解糖化的最適溫度(50 ℃)下可保持較好的活力穩(wěn)定性，同時，青霉所產(chǎn)外切纖維素酶的酶系較木霉更全，這些性狀讓青霉在纖維素酒精的生產(chǎn)中具有特定的優(yōu)勢[19]。與里氏木霉相比，灰白青霉所產(chǎn)的外切纖維素酶含量不高，酶活力也不具有顯著優(yōu)勢，但是非常穩(wěn)定，在50 ℃、pH 4.5條件下培育3 h活力幾乎不變[21]。因此，從長時間水解山楊木的反應過程來看，灰白青霉產(chǎn)生的外切纖維素酶的催化效能高于里氏木霉[21]。

2.1.2其他來源 放線菌和細菌可分泌表達水解效率很高的外切纖維素酶。如嗜熱放線菌釋放的外切纖維素酶在穩(wěn)定作用時比活力可達7.9[22]；鏈霉菌所產(chǎn)的2種外切纖維素酶中，M23的活力和里氏木霉所產(chǎn)的酶的活力非常相似，而M7a的活力是里氏木霉的7倍之多[6]?？莶菅挎邨U菌(Bacillussubtilis)、阿氏腸桿菌(Enterobacterasburiae)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)等細菌也能夠產(chǎn)生活性好、耐熱、穩(wěn)定性好、產(chǎn)量高的外切纖維素酶[23]。

一些以木材為食物來源的昆蟲也可以分泌纖維素酶(主要是外切纖維素酶)來水解纖維素物質(zhì)。如白蟻可通過分泌多種外切纖維素酶來促進消化木質(zhì)纖維素[5]。但不同飲食和生境中的白蟻所分泌的外切纖維素酶種類有差別。在巴基斯坦小白蟻(Microtermespakistanicus)后腸中，GH9家族的外切纖維素酶是表達最多的(占90%)，β-葡萄糖苷酶表達較少(占10%)[5]；暗黃白蟻(Macrotermesgilvus)的后腸文庫顯示，GH7家族的外切纖維素酶是表達最豐富的(占64%)，其次是GH5家族的外切纖維素酶(占27%)，其他家族的外切纖維素酶僅占9%[24]。除白蟻外，白色斑天牛能夠分泌一種被命名為AmCel-5B的外切纖維素酶，該酶在50 ℃、pH 4時酶活力最高，其還能夠表現(xiàn)出β-葡聚糖酶的活性[1]。然而，由于外切纖維素酶無法識別低聚糖，造成了天牛只能消化一些剛性長纖維[1]。

植物很少產(chǎn)生纖維素酶，但是有些植物能通過分泌外切纖維素酶來促進自身生長。如玉米幼苗就可以分泌外切纖維素酶來水解細胞壁中的β-D-葡聚糖，以促進自身更好地生長發(fā)育[25]。

2.2 外切纖維素酶的生化特性

由于外切纖維素酶的來源不同，其生化特性也不同。以表2中的外切纖維素酶為例，大部分外切纖維素酶的最適pH在5.0～7.0之間，最適溫度在50 ℃左右；其他經(jīng)過菌種克隆改良或者來自極端環(huán)境的作物或菌株能夠產(chǎn)生耐酸、耐堿及耐熱的外切纖維素酶。如從長期堆放富含纖維素物

表2 不同來源的外切纖維素酶的性質(zhì)Table 2 Properties of exocellulases from different sources

質(zhì)的垃圾堆肥中篩選到一株嗜熱嗜酸的土曲霉(Aspergillusterreus)M11，其所產(chǎn)的外切纖維素酶于100 ℃溫育30 min仍保持30%左右的酶活力，在50 ℃、pH 2.0條件下溫育1 h后酶活力不變，說明此酶具有較強的耐熱性、耐酸性[27]。自化纖廠的土樣中篩選獲得一株短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)AC-4，其所產(chǎn)的外切纖維素酶在50 ℃、pH 9.5條件下溫育30 min酶活力最高，說明其具有較強的耐堿性[36]。對極端嗜熱厭氧木質(zhì)纖維素降解菌解糖熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptorsaccharolyticus)來源的單催化域外切纖維素酶進行雙催化域重構(gòu)，獲得了具有降解天然木質(zhì)纖維素的雙催化域、耐熱的外切纖維素酶[34]。

研究發(fā)現(xiàn)，Mg2+、Ca2+、Cu2+和Zn2+能夠降低外切纖維素酶活性，且酶活性與離子濃度成負反饋變化[38]；重金屬離子Cu2+、Pb2+和Hg2+對外切纖維素酶活性具有不可逆的抑制作用[39]；各種價態(tài)的陰離子和Li+、K+、Na+幾乎不能對外切纖維素酶活性造成影響[42-43]；Fe2+和表面活性劑可提高外切纖維素酶活性[40]。值得注意的是，Ca2+、Zn2+和Mn2+對某些來自動物體內(nèi)的外切纖維素酶具有激活作用[39]。

3 外切纖維素酶的篩選、水解產(chǎn)物分析的相關技術

木質(zhì)素是目前世界上可利用資源中數(shù)量較大的一種物質(zhì)，其在外切纖維素酶等的作用下進行生物質(zhì)轉(zhuǎn)化變成可利用資源，可以極大地減少資源浪費和環(huán)境污染[41]。然而，目前纖維素類生物質(zhì)的降解利用率偏低，高效地獲得酶活性較高的外切纖維素酶并分析其水解產(chǎn)物的構(gòu)成是目前的首要任務。因此，技術的革新對于提高產(chǎn)外切纖維素酶菌株的篩選效率、加快水解產(chǎn)物成分的分析具有重要意義。

3.1 產(chǎn)外切纖維素酶菌株的篩選

微生物既能產(chǎn)生外切纖維素酶又能高效的降解作物秸稈[41]，所以分離、篩選能夠高產(chǎn)外切纖維素酶的菌株是目前獲得外切纖維素酶的最有效的方法。隨著技術的發(fā)展，分子生物學手段、分析化學技術逐漸被應用于產(chǎn)酶菌株的篩選中。常規(guī)方法為：對菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，誘導其產(chǎn)生外切纖維素酶，再結(jié)合羧甲基纖維素酶活和濾紙酶活的測定篩選纖維素降解優(yōu)勢菌株。當下可通過細菌16S rDNA和真菌18S rDNA同源序列比對確定菌株種屬，有助于快速確定其產(chǎn)酶條件，進而篩選優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)外切纖維素酶的菌株[42]。此外，還可運用納米級液相-電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜(nano LC-ESI-MS/MS analysis)技術，對菌株發(fā)酵所產(chǎn)的外切纖維素酶蛋白進行分析，快速確定產(chǎn)酶菌株[31]。

還有一種被稱為HTS的新系統(tǒng)可以有效的分析各種新型酶，這種設備首次利用自動的高通量系統(tǒng)直接篩出了具有催化功能的外切纖維素酶[22]。具體操作為：在37 ℃條件下對微生物進行持續(xù)攪拌，通過11～14 h以上的光密度監(jiān)測，得出96孔板中細胞的生長情況，再用VICTOR3型微板閱讀器測定了4-甲基-基板閱讀纖維二糖釋放的熒光。這個新的HTS系統(tǒng)每天能夠?qū)Τ^104個克隆進行驗證。其從甘薯田土壤微生物和瘤胃液制備的29 006個中間組分的克隆中得到了4個產(chǎn)外切纖維素酶的克隆物(CelEx-SF301，CelEx-SF309，CelEx-BR12，CelEx-BR15)[22]。

3.2 外切纖維素酶的水解產(chǎn)物分析

對酶的水解產(chǎn)物成分進行有效地分析，對于促進資源的二次利用具有重要意義。研究表明，可利用薄層色譜(thin layer chromatography，TLC)技術對反應混合物的水解產(chǎn)物進行分析檢測[43]。Sanchez等[43]在分析類芽孢桿菌(Paenibacillussp.)BP-23所產(chǎn)的外切纖維素酶Cel48C的水解產(chǎn)物時，將氯仿、乙酸、水(6∶7∶1，體積分數(shù))混合物作為長鏈多糖和纖維糊精的洗脫劑，產(chǎn)物分離后，通過新制備的乙醇/濃硫酸混合物(95∶5，體積分數(shù))噴涂硅膠板進行糖檢測可以得到葡萄糖、纖維二糖、果糖的含量，進而得到不同產(chǎn)物的水解產(chǎn)率。

4 外切纖維素酶的工業(yè)應用

外切纖維素酶已經(jīng)被生物技術領域廣泛使用，越來越多的工業(yè)應用材料以生物原料為基礎，且已經(jīng)進入大規(guī)模生產(chǎn)階段[22]。

4.1 造紙業(yè)

外切纖維素酶可以在較寬的pH范圍內(nèi)發(fā)揮作用，并且具有良好的熱穩(wěn)定性，適合進行生物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。研究表明，外切纖維素酶適用于造紙工業(yè)的高溫偏堿環(huán)境，其在紙漿纖維的精練過程中具有較高的效率，可以降低紙漿粘度，同時提高紙漿的利用率(65%～80%)[44]。加入外切纖維素酶的紙張的光滑度較一般的紙張好[45]。利用外切纖維素酶進行紙張脫墨是另一個新興的用途[46]。廢紙回收利用中最重要的一個過程就是脫墨工藝，外切纖維素酶制成的脫墨劑能夠使油墨和纖維素的結(jié)合力降低, 使油墨乳化分散與纖維脫離，其與傳統(tǒng)的紙張脫墨相比具有高效、污染少、成本低、性能好等優(yōu)點[47]。

4.2 食品加工業(yè)

隨著生活品質(zhì)的不斷提高，人們對食物在健康、營養(yǎng)價值和風味等方面的要求越來越高。而外切纖維素酶在食品工業(yè)中的應用恰好滿足了人們的要求。外切纖維素酶應用于果實和蔬菜加工過程中，既可以避免果蔬香味和維生素的流失，還可以使植物組織軟化蓬松，提高口感、促進消化[48]。在酒、醋、醬油的釀造過程中加入外切纖維素酶，不但可以增加產(chǎn)率、降低成本、減少污染，還能提高口感、增加風味[49-50]。在油料作物[51]和豆腐[52]的加工過程中加入外切纖維素酶可以極大地提高出油率和營養(yǎng)價值，節(jié)約資源。在利用外切纖維素酶浸取苦丁茶的工藝中，提高酶濃度，苦丁茶中氨基酸、水溶性糖、水浸出物的含量升高，纖維素含量下降，其浸出率更好[53]。

4.3 制藥業(yè)

目前，中藥的需求量日益增長，且在制藥行業(yè)占有重要的地位。中藥的制作過程中最重要的就是從植物中提取有效成分[54]，但是由于植物組織中含有大量的細胞壁，難以被水解，使得其提取效率較低。而在提取過程中加入外切纖維素酶可以充分降解植物細胞壁，使其內(nèi)部成分釋放出來用于制作中藥，從而提高中藥的產(chǎn)量和品質(zhì)，且具有較高的安全性[55]。

4.4 紡織業(yè)

紡織品的加工和處理廣泛使用外切纖維素酶，其可以在不影響產(chǎn)品質(zhì)量的條件下高效去除纖維素絲毛，增加產(chǎn)品的柔軟度、彈性和懸垂感[56]。如在牛仔服的制作中加入外切纖維素酶進行石磨水洗，從而去除表面的纖維以及纖維表面的靛藍等染料，此方法較傳統(tǒng)的石磨水洗處理能夠縮小成本、降低對人體的危害、減少污染,同時保持更好的質(zhì)感[50]。純棉質(zhì)衣服由于其吸汗、透氣的特性受到人們的喜愛，但是純棉質(zhì)衣服表面含有大量絨毛使其過于粗糙，既影響美觀又對皮膚有損，而在制作過程中加入來自里氏木霉的酸性纖維素酶，利用生物拋光技術降解表面的絨毛，提升純棉質(zhì)衣服的外表光滑度和光澤，賦予其新的色彩亮度[13,57]。

4.5 飼料工業(yè)

外切纖維素酶的加入可以改善植物性飼料的養(yǎng)分，促進動物內(nèi)源酶的分泌，從而提高養(yǎng)分消化率、促進動物生長發(fā)育，進而提升飼養(yǎng)效率、降低飼養(yǎng)成本[46]。如利用外切纖維素酶降低釀醋產(chǎn)生的有機廢物醋糟的粗纖維含量，將其轉(zhuǎn)變?yōu)榉墙Y(jié)晶纖維，從而開發(fā)成動物飼料，提高其營養(yǎng)價值[58]。研究顯示，利用加入纖維素復合酶的飼料喂養(yǎng)的羊崽體重日均增加了4.22%[57]；喂養(yǎng)的肉雞體重增加了2.78%，飼料消耗量下降了16.15%[57]；喂養(yǎng)的魚類日增重提高，餌料系數(shù)下降，攝取的基本營養(yǎng)成分增加，而體成分沒有變化[59]。

4.6 新型材料合成

外切纖維素酶還普遍應用在新型材料的生產(chǎn)中。如利用外切纖維素酶處理馬尾松纖維以制作納米纖維材料[60]；利用外切纖維素酶處理棉花以制備棉花纖維素納米纖維薄膜[61]。其中，納米纖維薄膜可用作軟包裝復合材料的強度層和阻隔層，還將在綠色高性能包裝材料領域得到使用[62]。

4.7 能源再生和環(huán)境保護

隨著不可再生能源(石油、天然氣和煤炭)的不斷消耗，世界上的能源儲量正面臨著枯竭，因而急需尋找新能源。將生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為液體燃料是目前被廣泛認同的方法，而應用最多的就是開發(fā)和利用外切纖維素酶等將各種生物質(zhì)資源轉(zhuǎn)化成可再生能源。

在能源再生方面，將纖維素在外切纖維素酶和其他酶的輔助下轉(zhuǎn)化成乙醇和生物柴油等已廣泛應用[53]。人們除了利用已有的纖維素原料生產(chǎn)乙醇燃料，還對廢棄物進行了二度利用，將制漿造紙工業(yè)產(chǎn)生的固體廢棄物(如紙漿污泥)在外切纖維素酶的作用下轉(zhuǎn)化成乙醇燃料，這不僅拓寬了乙醇燃料的生產(chǎn)途徑，還減少了紙漿污泥對環(huán)境的污染[63]。而將生物乙醇添加到汽油中可以提高燃油品質(zhì)，從而減少廢氣和碳排放[64]。利用外切纖維素酶發(fā)酵木薯渣可以產(chǎn)氫，使氫能源的應用更加普遍，該生產(chǎn)已經(jīng)實現(xiàn)了反應器水平上的放大化發(fā)酵產(chǎn)氫[65]。這為不少農(nóng)產(chǎn)品加工企業(yè)解決了加工后廢棄物的重復利用問題和環(huán)境污染問題，極大地降低了企業(yè)生產(chǎn)成本，避免了對糧食作物的大量損耗。在油井壓裂上，向低溫井中經(jīng)常加入外切纖維素酶做破膠劑，比化學破膠劑液化更可靠、安全，現(xiàn)已在油田應用，起到顯著的增產(chǎn)效果[66]。

在環(huán)境保護方面，外切纖維素酶可將纖維廢渣降解轉(zhuǎn)化成葡萄糖等物質(zhì)，增加資源利用率。將外切纖維酶加入到城市生活垃圾的處理中，將垃圾快速、高效地降解為綠色無污染的有機肥，極大改善了城市生活垃圾難以處理的問題[67]。外切纖維素酶還可以用來降解天然植物，如利用外切纖維素酶可以提高水稻秸稈的降解效率，在減少農(nóng)作物材料浪費的同時，環(huán)境也得到了很大的改善[68]。

5 展望

隨著分子生物學技術的快速發(fā)展以及對外切纖維素酶的深入研究，外切纖維素酶的使用范圍越來越廣，尤其是在生物質(zhì)能源方面，有效地降解纖維素并獲得可利用的產(chǎn)物，既可以防止環(huán)境污染，又可以利用纖維素原料為社會帶來巨大價值和收益[69]。因此，外切纖維素酶是一種具有巨大應用潛力的纖維素酶。

由于微生物原始來源的外切纖維素酶的催化效果有限，在大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中成本高，限制了外切纖維素酶在工業(yè)化生產(chǎn)中的發(fā)展速度，通過對外切纖維素酶的生產(chǎn)菌株進行遺傳改良提高其表達水平，以及對外切纖維素酶進行定點突變來提高其催化活性，是目前研究的熱點[69-70]。本課題組針對內(nèi)蒙古地區(qū)豐富的玉米秸稈和沙柳等纖維素廢棄原料，著力研究高效的外切纖維素酶，可以將秸稈中的纖維素基質(zhì)轉(zhuǎn)化為乙醇和有機酸等生物材料(數(shù)據(jù)未發(fā)表)，這樣既解決了當?shù)氐沫h(huán)境污染問題和廢棄農(nóng)作物堆放問題，也為內(nèi)蒙古地區(qū)的生物質(zhì)資源化利用的發(fā)展做出貢獻。