小麥矮稈突變體jm22d響應(yīng)赤霉素處理的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

方漢順,謝永盾,曾偉偉,郭會(huì)君,熊宏春,趙林姝,古佳玉,徐延浩,劉錄祥*

1.長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，主要糧食作物產(chǎn)業(yè)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 荊州 434025；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，國(guó)家農(nóng)作物基因資源與基因改良重大科學(xué)工程，國(guó)家農(nóng)作物航天誘變技術(shù)改良中心，北京 100081

小麥?zhǔn)俏覈?guó)第三大糧食作物，逐步提高產(chǎn)能并改良品質(zhì)是保障國(guó)家糧食安全的重要基礎(chǔ)。株高是影響小麥產(chǎn)量和品質(zhì)的重要性狀，20世紀(jì)60年代，矮稈基因的利用顯著提高了小麥的產(chǎn)量，引發(fā)了“綠色革命”[1]。目前小麥中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的矮稈基因共有25個(gè)，其中用于生產(chǎn)應(yīng)用的主要有Rht-1、Rht-2和Rht8，可利用的矮稈遺傳基礎(chǔ)狹窄[2]。因此，發(fā)掘新的矮稈基因資源并解析降稈機(jī)理對(duì)豐富小麥矮稈基因遺傳多樣性具有重要作用。

植物的生長(zhǎng)發(fā)育受到多種植物激素的影響，包括生長(zhǎng)素(auxin，IAA)、赤霉素(gibberellin，GA)、脫落酸(abscisic acid，ABA)、細(xì)胞分裂素(cytokinin，CTK)、油菜素內(nèi)酯(brassinosteroids，BRs)、茉莉素(jasmonate，JA)、乙烯(ethylene)、水楊酸(salicylic acid，SA)和獨(dú)腳金內(nèi)酯(strigolactones，SL)等，它們既相互獨(dú)立又能協(xié)同作用調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育及其對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力[3]。研究表明，植物激素的合成代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑異常均會(huì)引起植株矮化[4]。擬南芥、水稻和玉米中編碼KS和GA3ox的基因發(fā)生突變，會(huì)導(dǎo)致內(nèi)源赤霉素合成缺陷，引起植株產(chǎn)生矮化表型[5-8]。生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的3個(gè)關(guān)鍵因子是TIR1/AFB、ARF和Aux/IAA，在擬南芥中超表達(dá)AtARF19基因會(huì)引起植株嚴(yán)重矮化[9]，水稻的OsIAA25基因功能喪失導(dǎo)致突變體株高明顯降低[10]。P450單加氧酶是BR合成中重要的催化酶，其功能的缺失能夠?qū)е滤就蛔凅wdwarf2矮化，外施BR可以恢復(fù)正常表型[11]。

突變體創(chuàng)制在新品種培育、基因資源挖掘和分子機(jī)制研究中發(fā)揮了十分重要的作用。利用γ射線輻射、激光處理、低能重離子注入、航天誘變等誘變技術(shù)，可以提高突變發(fā)生的頻率，獲得自然變異難以獲得的突變性狀，為育種工作提供豐富的材料，縮短育種周期[12-16]。根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和國(guó)際原子能機(jī)構(gòu)聯(lián)合處(FAO/IAEA)突變品種數(shù)據(jù)庫(http://mvd.iaea.org/)最新統(tǒng)計(jì)，利用誘變技術(shù)已經(jīng)成功培育出3 320個(gè)突變品種，其中小麥突變品種263個(gè)，由中國(guó)育成的小麥突變品種為164個(gè)，占總量的64%，這些品種具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和抗逆等優(yōu)良性狀。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是利用高通量測(cè)序技術(shù)將細(xì)胞或組織中的mRNA進(jìn)行測(cè)序分析的技術(shù)，目前在植物的突變體、脅迫、抗病等研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[17-18]。Xiong等[19]通過RNA-seq對(duì)小麥耐鹽突變體的研究表明，氧化還原過程對(duì)突變體的耐鹽性具有重大影響。欒海業(yè)等[20]發(fā)現(xiàn)葉綠體形成和發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)受到抑制，導(dǎo)致光合作用下降可能是大麥突變體al形成白化穎殼的原因。本研究以小麥品種濟(jì)麥22(WT)及矮稈突變體jm22d為材料，鑒定二者的表型差異，利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)比較分析，篩選差異表達(dá)基因，通過功能注釋和通路富集分析，以期為解析突變體致矮機(jī)理提供更多線索。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為濟(jì)麥22(野生型，WT)及其矮稈突變體jm22d。jm22d由濟(jì)麥22經(jīng)過γ射線輻照誘變獲得，經(jīng)過多年田間表型鑒定，突變體矮化性狀穩(wěn)定。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1株高相關(guān)性狀調(diào)查 自拔節(jié)期起，每?jī)商祀S機(jī)選取田間長(zhǎng)勢(shì)均勻的WT和jm22d植株各20株，監(jiān)測(cè)株高的動(dòng)態(tài)變化；在成熟期，分別考察WT和jm22d的株高、節(jié)間數(shù)和節(jié)間長(zhǎng)度，每個(gè)材料隨機(jī)選取100株。

1.2.2莖稈細(xì)胞學(xué)觀察 在植株的抽穗期，截取穗下第一節(jié)間中部1 cm的部位，各設(shè)置3個(gè)重復(fù)，放入FAA固定液(福爾馬林:乙酸:70%乙醇=1∶1∶18)中固定48 h；依次通過體積分?jǐn)?shù)為70%、85%、95%、100%的乙醇溶液進(jìn)行脫水后，放入體積比為2∶3和3∶2的二甲苯乙醇混合液各1 h；將浸入純二甲苯溶液1 h后的材料放入石蠟與二甲苯比例為1∶1的混合液中14 h，再浸入純石蠟中包埋，烘箱溫度設(shè)置為60 ℃，每隔8 h更換一次石蠟，更換兩次；使用輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)將石蠟切成16 μm厚的蠟帶，42℃烤片機(jī)進(jìn)行展片；用二甲苯溶解石蠟，再將切片依次浸入濃度為100%、95%、85%和70%的酒精各5 min復(fù)水，之后將切片染色4 h；用OLYMPUS顯微鏡觀察，DP2-BSW成相并拍攝照片，隨機(jī)選取同一視野里的400個(gè)細(xì)胞測(cè)量長(zhǎng)度。

1.2.3赤霉素含量測(cè)定 準(zhǔn)確稱量抽穗期新鮮植物葉片和莖稈樣品各1 g，于液氮中研磨至粉碎；向粉末中加入10 mL異丙醇/鹽酸提取緩沖液，同時(shí)加入8 μL 1 μg·mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液4 ℃震蕩30 min；加入20 mL二氯甲烷，4 ℃震蕩30 min；4 ℃，13 000 r·min-1離心5 min，取下層有機(jī)相；避光，以氮?dú)獯蹈捎袡C(jī)相，以400 μL甲醇(0.1%甲酸)溶解；過0.22 μm濾膜，進(jìn)HPLC-MS/MS檢測(cè)。以甲醇(0.1%甲酸)為溶劑分別配制梯度為0.1、0.2、0.5、2.0、5.0、20.0、50.0、200.0 ng·mL-1的GA1、GA3、GA4、GA7標(biāo)準(zhǔn)溶液，并加入終濃度為20 ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液，每個(gè)濃度做3個(gè)重復(fù)。

1.2.4外源赤霉素處理 選取飽滿完整的jm22d和WT種子，用10%的次氯酸鈉溶液浸泡20 min，沖洗種子至無刺激性氣味，使用蒸餾水在室溫條件下浸種24 h，種子萌動(dòng)露白后移至4℃冰箱放置2 d。將種子整齊擺放于發(fā)芽架上，置于恒溫光照培養(yǎng)箱中，溫度設(shè)置為21 ℃，光照時(shí)間為12 h，使用霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)3 d，待發(fā)芽整齊一致后，對(duì)照組繼續(xù)使用霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組換為含20 μmol·L-1赤霉素的霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.5葉綠素含量測(cè)定 配制丙酮:乙醇=2∶1的提取液，向試管中加入10 mL提取液，將葉片剪碎成寬度小于1 mm的細(xì)絲或者小塊，稱取0.1 g剪碎的葉片置于有提取液的試管中，密封室溫黑暗條件下浸提；當(dāng)用肉眼觀察到葉組織完全變白時(shí)，定容至15 mL，黑暗條件保存?zhèn)溆?；每個(gè)樣品設(shè)置4個(gè)重復(fù)，以提取液為參考，測(cè)定在645 nm和663 nm處的吸光度，利用Arnon法計(jì)算葉綠素含量[21]，公式如下：CT=Ca+Cb，Ca=(12.7A663-2.59A645)×(V/M)，Cb=(22.9A645-4.67A663)×(V/M)，其中CT為總?cè)~綠素含量，Ca為葉綠素a的含量，Cb為葉綠素b含量，V為提取液體積，M為樣品重量。

1.2.6RNA提取和cDNA文庫的構(gòu)建、測(cè)序 分別在赤霉素處理0(D0)、1(D1)和3 d(D3)時(shí)進(jìn)行取樣，各組別的材料選取7株長(zhǎng)勢(shì)均勻的幼苗，截取基部第一片葉下約1.5 cm的部分，設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。根據(jù)試劑說明書的步驟，使用TRNzol-A+ Reagent試劑盒(天根生化科技有限公司)提取總RNA，通過Nanodrop 2000進(jìn)行質(zhì)量和濃度檢測(cè)，1%瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA樣品的完整性。

cDNA文庫由選取的7株幼苗的總RNA等量混合而成。野生型的樣本文庫命名為：WT_D0、WT_D1、WT_D3，突變體的命名規(guī)則與野生型相同。樣品檢測(cè)合格后，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA，加入Fragmentation Buffer將mRNA隨機(jī)打斷，以mRNA為模板合成第一條cDNA鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二條cDNA鏈，對(duì)純化的雙鏈cDNA進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測(cè)序接頭，然后用AMPure XP beads進(jìn)行片段大小選擇，文庫構(gòu)建成功后，用Illumina平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。cDNA文庫的構(gòu)建和測(cè)序由北京百邁客生物科技有限公司完成。

1.2.7測(cè)序原始數(shù)據(jù)過濾 對(duì)測(cè)序產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，流程如下：過濾掉含有接頭的Reads；過濾含N(不確定堿基)的比例大于10%的Reads；過濾質(zhì)量值Q≤10的堿基數(shù)占整條Read 50%以上的Reads。將過濾后獲得的高質(zhì)量Clean Reads與小麥參考基因組進(jìn)行比對(duì)，對(duì)測(cè)序產(chǎn)出的數(shù)據(jù)和比對(duì)情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.8基因表達(dá)定量和差異表達(dá)基因(DEGs)分析 利用StringTie最大流量算法，采用FPKM作為衡量轉(zhuǎn)錄本或基因表達(dá)水平的指標(biāo)。利用DEseq軟件對(duì)樣品間的差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選，將Fold Change≥2，F(xiàn)DR<0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，分別對(duì)野生型和突變體在對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析。分別利用GOseq R包和KOBAS軟件對(duì)差異表達(dá)基因的GO功能和KEGG通路進(jìn)行富集分析。

1.2.9qRT-PCR驗(yàn)證分析 隨機(jī)選取9個(gè)差異表達(dá)基因，以β-Actin為內(nèi)參基因，使用Beacon Designer 7.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物(表1)。采用All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)合成cDNA。用Top Green qPCR SuperMix熒光定量試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行熒光定量PCR，反應(yīng)儀器為Bio-Rad CFX 96(美國(guó)伯樂)，反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔ t算法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 The primers of qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 株高表型鑒定

jm22d成熟期株高為53±1.8 cm，比WT低約20 cm。自拔節(jié)期起，jm22d的株高始終低于WT植株，各時(shí)期二者的株高差異均達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)水平(P<0.01)(圖1D)。jm22d有4個(gè)節(jié)間，少于WT的5個(gè)節(jié)間，并且jm22d各節(jié)間長(zhǎng)度均小于WT各節(jié)間(P<0.01)，其中穗下第四節(jié)間縮短程度最大(43.8%，圖1E)。因此，節(jié)間數(shù)目的減少以及節(jié)間長(zhǎng)度的縮短是jm22d株高降低的主要原因。

2.2 莖稈細(xì)胞學(xué)分析

jm22d莖稈細(xì)胞的平均長(zhǎng)度為192.8 μm，低于WT的莖稈細(xì)胞長(zhǎng)度(279.2 μm,P<0.01)，jm22d的細(xì)胞長(zhǎng)度相較于WT縮短約31%(圖2)。由此推測(cè)，jm22d節(jié)間長(zhǎng)度的縮短是由節(jié)間細(xì)胞長(zhǎng)度的縮短導(dǎo)致的。

2.3 赤霉素含量分析

jm22d葉片中赤霉素的總含量高于WT，其中GA4的含量是WT的1.8倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，GA1、GA3和GA7的含量較對(duì)照無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖3)。而jm22d莖稈中赤霉素總含量低于WT(P<0.01)，其中WT莖稈中GA1含量為jm22d的2.8倍，GA4含量為jm22d的1.5倍，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而jm22d的GA7含量為WT的2.1倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；兩者中GA3的含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖3)。

A：拔節(jié)期；B：抽穗期；C：成熟期；D：株高動(dòng)態(tài)變化；E：株高及各節(jié)間長(zhǎng)度圖1 株高表型鑒定Fig.1 Plant height phenotype of WT and jm22d

A：細(xì)胞顯微照片；B：細(xì)胞長(zhǎng)度。**—與WT相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。圖2 莖稈細(xì)胞觀察Fig.2 The observation of stem cell

2.4 赤霉素對(duì)WT和jm22d苗期性狀的影響

如圖4所示，WT和jm22d在未施加赤霉素處理(D0)和施加赤霉素處理的第1天(D0)、第3天(D3)時(shí)，株高和根長(zhǎng)隨時(shí)間逐漸增加，但是赤霉素處理和對(duì)照組的苗高和根長(zhǎng)均無顯著差異，說明jm22d為赤霉素不敏感型突變體；而jm22d與WT相比，其苗高和根長(zhǎng)在D0、D1和D3 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均極顯著小于WT。

2.5 葉綠素含量分析

在赤霉素處理0(D0)、1(D0)和3 d(D3)，對(duì)jm22d和WT取樣提取葉綠素，利用分光光度計(jì)法，根據(jù)Arnon算法計(jì)算二者在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)體內(nèi)葉綠素含量的變化。結(jié)果(圖5)顯示，在赤霉素處理0天時(shí)，jm22d體內(nèi)葉綠素含量極顯著高于WT；赤霉素處理1和3 d后，jm22d中葉綠素含量呈下降趨勢(shì)，而WT中葉綠素含量呈上升趨勢(shì)。赤霉素處理1 d后，jm22d體內(nèi)葉綠素含量開始高于WT，但未達(dá)到顯著差異。赤霉素處理3 d后，jm22d中葉綠素含量極顯著低于WT。由此說明持續(xù)的赤霉素處理對(duì)jm22d體內(nèi)葉綠素的合成具有明顯的抑制作用。

**—與同組WT相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。圖3 赤霉素含量測(cè)定Fig.3 The concentration of gibberellin

A：幼苗表型；B：株高；C：根長(zhǎng)圖4 赤霉素處理后幼苗表型Fig.4 Phenotype of GA-treated wheat seedlings

**—與同組WT相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。圖5 葉綠素含量測(cè)定Fig.5 Determination of chlorophyll content

2.6 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比對(duì)

共構(gòu)建18個(gè)RNA-seq測(cè)序文庫，每個(gè)樣本包含3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。測(cè)序原始經(jīng)過質(zhì)量控制后，各樣品clean data均達(dá)到6.13 GB，Q20和Q30的百分比均高于94.33%，GC含量不低于57.55%。分別將各樣品的Clean Reads與小麥參考基因組序列進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)效率分布在89.24%～94.78%不等，其中唯一比對(duì)到參考基因組的Reads數(shù)占84.8%以上，比對(duì)到參考基因組多處位置的Reads在6.55%以下(表2)。將皮爾遜相關(guān)系數(shù)r2(pearson’s correlation coefficient)作為生物學(xué)重復(fù)相關(guān)性的評(píng)估指標(biāo)，分別計(jì)算各處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù)之間的皮爾遜相關(guān)系數(shù)，兩兩樣品之間的r2均在0.956以上(表3)。綜上，表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量和樣品重復(fù)性良好。

表2 轉(zhuǎn)錄測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics of RNA-seq

2.7 差異表達(dá)基因分析

對(duì)jm22d和WT中的差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選和分組對(duì)比分析。赤霉素處理0 d時(shí)(WT_D0vs.jm22d_D0)，從兩個(gè)材料中篩選出955個(gè)差異表達(dá)基因(270個(gè)上調(diào)表達(dá)，685個(gè)下調(diào)表達(dá))；赤霉素處理1 d時(shí)(WT_D1vs.jm22d_D1)，篩選出772個(gè)差異表達(dá)基因(278個(gè)上調(diào)表達(dá)，494個(gè)下調(diào)表達(dá))；赤霉素處理3 d時(shí)(WT_D3vs.jm22d_D3)，篩選出1 067個(gè)差異表達(dá)基因(318個(gè)上調(diào)表達(dá)，749個(gè)下調(diào)表達(dá))；jm22d和WT中共篩選到1 763個(gè)差異基因，在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有顯著差異的基因數(shù)目為411個(gè)，其中62個(gè)上調(diào)表達(dá)，349個(gè)下調(diào)表達(dá)(圖6)。

2.8 差異表達(dá)基因GO功能注釋和富集分析

對(duì)jm22d和WT間的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能注釋和富集分析，1 763個(gè)差異基因中注釋到了生物學(xué)過程(biological process)、細(xì)胞組分(cellular component)、分子功能(molecular function)的條目分別有19、15和13個(gè)。生物學(xué)過程中注釋數(shù)目前三位的條目分別是代謝過程(metabolic process)、細(xì)胞進(jìn)程(cellular process)和單一生物過程(single-organism process)，注釋基因的數(shù)目分別為777個(gè)(44.1%)、674個(gè)(38.2%)和598個(gè)(33.9%)；細(xì)胞組分中注釋數(shù)目前三位的條目分別是細(xì)胞成分(cell part)、細(xì)胞(cell)和細(xì)胞器(organelle)，注釋基因的數(shù)目分別為840(47.6%)、840(47.6%)和714個(gè)(40.5%)；分子功能中注釋基因數(shù)目前三位的條目分別是催化活性(catalytic activity)、結(jié)合(binding)和轉(zhuǎn)運(yùn)活性(transporter activity)，注釋基因的數(shù)目分別為708(40.2%)、674(38.2%)和89個(gè)(5%)(圖7)。

表3 生物學(xué)重復(fù)間相關(guān)系數(shù)Table 3 The correlation coefficient of biological replicates

A：差異基因柱狀圖；B：差異基因韋恩圖；C：上調(diào)差異基因；D：下調(diào)差異基因圖6 差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)Fig.6 Statistics of differentially expressed genes

將3個(gè)時(shí)間點(diǎn)上調(diào)表達(dá)和下調(diào)表達(dá)的差異基因進(jìn)行GO富集分析。上調(diào)表達(dá)的差異基因富集最顯著的4個(gè)GO條目分別是半乳糖脂酶活性(galactolipase activity)、硫酸鹽運(yùn)輸(sulfate transport)、分子結(jié)構(gòu)活性(structural molecule activity)和β-葡糖苷酶活性(beta-glucosidase activity)(圖8A); 下調(diào)表達(dá)的差異基因富集最顯著的4個(gè)GO條目分別是光合作用-光捕獲(photosynthesis, light harvesting)、葉綠體膜(chloroplast membrane)、脅迫反應(yīng)(response to stress)和谷氨酰tRNA還原酶活性(glutamyl-tRNA reductase activity)(圖8B)。

2.9 差異表達(dá)基因KEGG富集分析

將3個(gè)時(shí)間點(diǎn)共有的差異基因進(jìn)行KEGG富集分析，結(jié)果顯示，在光合作用-天線蛋白(photosynthesis-antenna proteins，ko00196)、亞油酸的新陳代謝(linoleic acid metabolism，ko00591)以及卟啉與葉綠素代謝(porphyrin and chlorophyll metabolism，ko00860)通路中富集最顯著(圖9)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，赤霉素處理0 d時(shí)，WT和jm22d中差異表達(dá)基因富集到93個(gè)通路中，其中在亞油酸的新陳代謝(linoleic acid metabolism，ko00591)通路上顯著富集，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工(protein processing in endoplasmic reticulum，ko04141)途徑上富集有大量的差異表達(dá)基因；赤霉素處理1 d時(shí)，差異表達(dá)基因富集到光合作用-天線蛋白、卟啉和葉綠素代謝等81個(gè)通路上，光合作用-天線蛋白(photosynthesis-antenna proteins，ko00196)表現(xiàn)為顯著富集，且富集到的差異表達(dá)基因數(shù)目也較多；赤霉素處理3 d時(shí)，沒有發(fā)現(xiàn)顯著富集的通路，但在植物與病原菌互作(plant-pathogen interaction，ko04626)、淀粉和蔗糖代謝(starch and sucrose metabolism，ko00500)和碳代謝(carbon metabolism，ko01200)等通路上富集到大量差異表達(dá)基因。

圖7 差異表達(dá)基因GO功能注釋Fig.7 GO function classification and GO enrichment of DEGs

2.10 植物激素相關(guān)差異表達(dá)基因

從jm22d下調(diào)表達(dá)的基因中篩選到5個(gè)與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因，分別是TraesCS2B01G582300、TraesCS2B01G600800、TraesCS2B01G556600、TraesCS2B01G630000和TraesCS6B01G439600。其中TraesCS2B01G582300是細(xì)胞分裂素信號(hào)途徑中的負(fù)反饋調(diào)控因子(ARR-A)，在WT中表達(dá)量高，且隨著外源赤霉素處理時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)量增加，但該基因在jm22d中不表達(dá)。TraesCS2B01G600800是生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的GH3響應(yīng)基因，在WT中表達(dá)量保持穩(wěn)定，在jm22d中不表達(dá)。TraesCS2B01G5-56600是水楊酸信號(hào)途徑中的TGA轉(zhuǎn)錄因子，在WT和jm22d中赤霉素處理1和3 d時(shí)表達(dá)量均上調(diào)，但3個(gè)時(shí)間點(diǎn)在WT中的表達(dá)量均顯著高于jm22d，差異倍數(shù)分別為4.7、5.0和4.9倍。TraesCS2B01G630000是脫落酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中SRK2蛋白激酶編碼基因，該基因在WT和jm22d中均隨著赤霉素處理時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)上調(diào)，在jm22d中3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量均顯著低于WT。TraesCS6B01G439600是乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的ETR受體，該基因在WT中赤霉素處理1和3 d后表達(dá)量持續(xù)上調(diào)，但在jm22d中表達(dá)量無明顯差異，3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的差異倍數(shù)分別為12.3、16.5和35.2倍(表4)。

2.11 光合作用相關(guān)差異表達(dá)基因

KEGG富集分析顯示，差異表達(dá)基因在光合作用相關(guān)通路上有顯著的富集，主要包括光合作用-天線蛋白(photosynthesis-antenna proteins，ko00196)與卟啉和葉綠素代謝(porphyrin and chlorophyll metabolism，ko00860)兩條通路。光合作用-天線蛋白通路上共富集到15個(gè)基因，均注釋到葉綠素a-b結(jié)合蛋白LHCII 1，這15個(gè)基因在jm22d中隨著赤霉素處理時(shí)間的延長(zhǎng)持續(xù)下調(diào)，而在WT中表現(xiàn)為赤霉素處理1 d上調(diào)表達(dá)，處理3 d時(shí)下調(diào)表達(dá)，并且D0、D1和D3 3個(gè)時(shí)間

A：上調(diào)差異基因GO富集；B：下調(diào)差異基因GO富集圖8 差異表達(dá)基因GO富集分析Fig.8 GO enrichment of DEGs

圖9 差異表達(dá)基因KEGG富集分析Fig.9 KEGG enrichment of DEGs

表4 激素相關(guān)差異表達(dá)基因KEGG注釋和FPKM值Table 4 The KEGG annotation and FPKM of DEGs related with plant hormone

點(diǎn)在jm22d中的表達(dá)量均顯著低于在WT中的表達(dá)量。卟啉和葉綠素代謝通路上富集到6個(gè)基因，分別注釋到谷氨酰tRNA還原酶和葉綠素b還原酶，這6個(gè)基因未施加赤霉素處理時(shí)在jm22d中的表達(dá)量高于WT中的表達(dá)量；隨后經(jīng)過赤霉素處理1和3 d時(shí)，在jm22d中的表達(dá)量低于在WT中的表達(dá)量(表5)。

2.12 熒光定量PCR驗(yàn)證

為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，隨機(jī)選取9個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行了qRT-PCR定量分析，并與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，qRT-PCR的結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致(圖10)。

3 討論

激素在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程中扮演著重要的角色，它們與外界環(huán)境和發(fā)育過程一起構(gòu)成了一個(gè)完整的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[22]。如擬南芥中細(xì)胞分裂素響應(yīng)元件B型ARR可以抑制生長(zhǎng)素的積累[23]；水稻中低濃度油菜素甾醇可以促進(jìn)GA3ox2的表達(dá)，促進(jìn)赤霉素的合成[24]；生長(zhǎng)素和赤霉素可以協(xié)同調(diào)控水稻XET基因的表達(dá)來調(diào)節(jié)莖稈的負(fù)向重力反應(yīng)[25]，生長(zhǎng)素也可以正向調(diào)節(jié)DELLA蛋白的穩(wěn)定性從而影響根部細(xì)胞的發(fā)育[26]。本研究中矮稈突變體jm22d葉片中赤霉素含量高于WT，而莖稈中的赤霉素含量顯著低于WT，可能是jm22d中赤霉素轉(zhuǎn)運(yùn)途徑出現(xiàn)異常導(dǎo)致其莖稈中赤霉素含量顯著降低，引起植株出現(xiàn)矮化表型。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，赤霉素處理后，在生長(zhǎng)素、乙烯、細(xì)胞分裂素等激素途徑中篩選到5個(gè)差異基因，如生長(zhǎng)素響應(yīng)基因GH3家族(TraesCS2B01G600800)和細(xì)胞分裂素信號(hào)途徑中的負(fù)反饋調(diào)控因子ARR-A(TraesCS2B01G582300)，它們?cè)趈m22d中不表達(dá)，但在WT中高表達(dá)，且隨著赤霉素處理,表達(dá)量出現(xiàn)上調(diào)或者下調(diào)的變化，由此推斷生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素等植物激素相關(guān)基因的差異可能會(huì)影響jm22d細(xì)胞的伸長(zhǎng)、細(xì)胞的分裂等多個(gè)發(fā)育過程，從而引起植株株高降低，同時(shí)也說明外源赤霉素對(duì)植物體內(nèi)其他激素具有明顯調(diào)節(jié)作用。綜上，jm22d可能是一個(gè)赤霉素轉(zhuǎn)運(yùn)途徑異常的突變體，其矮化可能與莖稈部分赤霉素含量的減少以及其他植物激素信號(hào)通路中不表達(dá)或者低表達(dá)的基因有關(guān)。

表5 光合作用相關(guān)通路上的差異表達(dá)基因Table 5 DEGs related with photosynthesis

光合作用是綠色植物將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能儲(chǔ)藏在有機(jī)物中的過程，葉綠素作為光合作用中重要的色素，它對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育意義重大。葉綠素的生物合成是L-谷氨酰-tRNA經(jīng)過L-谷氨酰-tRNA還原酶等多種酶的作用形成葉綠素a，再經(jīng)過葉綠素酸酯加氧酶氧化形成葉綠素b，整個(gè)合成過程共有15步反應(yīng)，主要包括L-谷氨酰-tRNA到原卟啉Ⅸ的生物合成和原卟啉Ⅸ到葉綠素的生物合成兩部分[27]。前期有研究證明外源赤霉素能夠影響植物的光合作用，如在蠶豆葉片上噴施赤霉素可以顯著提高葉片的光合作用速率[28]；Dijkstra[29]的研究則表明外源赤霉素使得葉綠素a的含量以及單位葉面積的光合速率降低，但對(duì)蒸騰速率無顯著影響。本實(shí)驗(yàn)中施加外源赤霉素后，jm22d中葉綠素含量明顯降低，KEGG富集分析顯示大量差異表達(dá)基因在光合作用相關(guān)通路有明顯富集，如光合作用-天線蛋白、光合作用和卟啉-葉綠素代謝，說明外源赤霉素對(duì)jm22d中葉綠素含量的積累具有負(fù)向效應(yīng)，并且外源赤霉素對(duì)光合作用相關(guān)代謝通路有較大影響，能夠調(diào)控光合作用相關(guān)基因的表達(dá)，與毛竹中的研究結(jié)果一致[30]。

圖10 qPCR驗(yàn)證結(jié)果Fig.10 The result of qPCR and RNA-seq

為了進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究還選取了植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、光合作用等通路上的9個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致。矮稈突變體jm22d中的生長(zhǎng)素響應(yīng)因子AUX15、GH3表達(dá)量較低或者不表達(dá)可能是引起矮化的關(guān)鍵基因，施加外源赤霉素后這些基因的表達(dá)量出現(xiàn)明顯的上調(diào)或者下調(diào)，說明植物體內(nèi)的多種激素具有明顯的相互作用，它們之間的協(xié)同作用共同調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育。光合作用和葉綠素代謝途徑相關(guān)通路上富集有大量的差異表達(dá)基因，如HEMA1、PORA等基因出現(xiàn)了不同程度的下調(diào)，從而引起jm22d中葉綠素含量的降低，說明外源赤霉素對(duì)jm22d葉綠素的含量具有負(fù)向影響。本研究進(jìn)一步豐富了小麥矮稈材料和基因資源的多樣性，同時(shí)也為突變體中赤霉素的作用機(jī)制解析提供了重要的理論參考。