布魯氏菌毒力因子及致病機(jī)制研究新進(jìn)展

秋葉紅，李靜波，李 響，翟景波，3

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼028000；2.通遼市科爾沁區(qū)婦幼保健院，內(nèi)蒙古 通遼028000；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)布魯氏菌病防治工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 通遼028043）

布魯氏菌是胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性球狀桿菌，可以引起以生殖系統(tǒng)疾病為主要特征的人畜共患病，在全世界廣泛分布，目前該病波及了我國25個(gè)?。ㄊ小⒆灾螀^(qū)），每年感染的羊、牛、豬高達(dá)百萬頭，造成的經(jīng)濟(jì)損失可達(dá)十幾億元人民幣.布魯氏菌侵入人體后，可累及多個(gè)組織器官形成慢性感染，難以治愈.筆者從布魯氏菌毒力因子和致病機(jī)制兩個(gè)方面，對(duì)布魯氏菌的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述.

1 毒力因子

1.1 脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）

普遍認(rèn)為LPS是一種毒力因子，根據(jù)有兩點(diǎn)：（1）布魯氏菌LPS免疫原性差，不能激活補(bǔ)體系統(tǒng)，使其能夠在吞噬細(xì)胞內(nèi)存活繁殖；（2）LPS缺陷突變株對(duì)補(bǔ)體和多粘菌素B介導(dǎo)的溶菌作用較為敏感.Anne等研究證實(shí)，去除WboA基因的牛種布魯氏菌變異株，其毒力要比原代菌株S2308明顯減弱.布魯氏菌S2308株的光滑型LPS具有潛在的免疫調(diào)節(jié)活性［1]，LPS分子可以不被巨噬細(xì)胞降解，并和MHC-II類分子形成復(fù)合物，維持布魯氏菌在宿主巨噬細(xì)胞中長期生存.LPS分子的完整性決定了布魯氏菌的毒力和胞內(nèi)生存機(jī)制.

1.2 BvrR/BvrS雙組分調(diào)控系統(tǒng)

布魯氏菌雙組分調(diào)控系統(tǒng)可以通過感應(yīng)和處理環(huán)境信號(hào)來發(fā)揮調(diào)控作用，是一類重要的毒力調(diào)控系統(tǒng).BvrR/BvrS 缺失突變株導(dǎo)致布魯氏菌復(fù)制能力下降，不能有效抑制吞噬小體和溶酶體的融合，從而使細(xì)菌在進(jìn)入細(xì)胞后被吞噬溶酶體消滅，BvrR/BvrS 雙組分調(diào)控系統(tǒng)能夠阻止溶酶體融合.另外，該系統(tǒng)可以增強(qiáng)布魯氏菌在營養(yǎng)缺乏的環(huán)境中的生存能力，使其能在細(xì)胞內(nèi)長期存活.

1.3 Cyclic-1-2-glucans（CβG）

布魯氏菌CβG屬Ⅱ型滲透調(diào)節(jié)的周質(zhì)葡聚糖（osmoregulated periplasmic glucans，OPGS）家族.CβG通過作用于巨噬細(xì)胞表面的脂質(zhì)筏，影響細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)運(yùn)輸，這些葡聚糖參與吞噬體-溶酶體融合的控制.CβG缺失的突變體無法阻止吞噬體-溶酶體融合，使細(xì)菌不能繁殖.此外，經(jīng)CβG處理的突變體能夠通過避免溶酶體融合來控制空泡成熟，使布魯氏菌存活并到達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)而在此復(fù)制［2].

1.4 尿素酶（Urease）

尿素酶是一種金屬蛋白酶，它將尿素分解為碳酸和氨形式，從而使pH值增加，此特征使其能夠在酸性環(huán)境中存活［3].由1MB的DNA分離的染色體Ⅰ中有兩個(gè)尿素-操縱子：ure-1和ure-2.ure-1和ure-2編碼結(jié)構(gòu)基因?yàn)槟蛩谹、尿素B、尿素C和輔助基因：尿素D、尿素E、尿素F、尿素G［4].當(dāng)布魯氏菌通過口服途徑進(jìn)入宿主體內(nèi)時(shí)，尿素酶可以保護(hù)其通過消化道［5].除牛種布魯氏菌外的所有種屬的布魯氏菌都會(huì)產(chǎn)生尿素酶［6].

1.5 細(xì)胞色素氧化酶

細(xì)胞色素氧化酶是一種可以促進(jìn)布魯氏菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活的酶.由于在巨噬細(xì)胞內(nèi)氧的利用受到限制，細(xì)胞色素cbb3氧化酶在體外表達(dá)［7]，并且能夠使布魯氏菌在缺氧組織中定植.細(xì)胞色素bd（ubiquinol oxidases）氧化酶在細(xì)胞增殖的過程中表達(dá)，在細(xì)胞復(fù)制的過程中對(duì)復(fù)制的微環(huán)境起到調(diào)節(jié)作用.缺乏此類細(xì)胞色素bd氧化酶的布魯氏菌，在感染小鼠模型中高度衰減.

1.6 烷基過氧化氫還原酶（AhpC，AhpD）

這種酶起到防御氧自由基和活性氮的作用［8].在啟動(dòng)子的控制下，AhpC 和AhpD 被同一個(gè)操縱子調(diào)控.AhpC突變體對(duì)過氧化物滅活更加敏感而且更容易發(fā)生自發(fā)突變［9，3].

1.7 一氧化氮還原酶（Nord）

布魯氏菌內(nèi)的一氧化氮還原酶由四種類型的還原酶組成：NNR-亞硝酸鹽還原酶，NAR-硝酸鹽還原酶，NOR-一氧化氮還原酶和NOS-一氧化二氮還原酶.一氧化氮還原酶的產(chǎn)生有助于保護(hù)布魯氏菌免受巨噬細(xì)胞內(nèi)低氧環(huán)境的影響［3].

1.8 布魯氏菌毒力因子A（Brucella virulence factor A，bvfA）

bvfA是僅在布魯氏菌屬中產(chǎn)生的周質(zhì)蛋白，在基因序列數(shù)據(jù)庫中沒有同源序列.吞噬細(xì)胞酸化誘導(dǎo)bvfA表達(dá)，由此可推測(cè)該蛋白參與復(fù)制細(xì)胞內(nèi)環(huán)境.目前bvfA的功能尚不明確［10].

1.9 T4SS

T4SS是由VirB操縱子編碼的多蛋白復(fù)合物家族.布魯氏菌入侵機(jī)體時(shí)T4SS能夠調(diào)控大量毒力因子的誘導(dǎo)表達(dá)，產(chǎn)生多種效應(yīng)子（VceA、VceC［11]等），有效地阻止溶酶體與吞噬小體融合，使布魯氏菌適應(yīng)不良的宿主胞內(nèi)環(huán)境，克服和逃避巨噬細(xì)胞的各種防御機(jī)制，進(jìn)而在吞噬細(xì)胞內(nèi)生存復(fù)制.

1.10 外膜蛋白

外膜蛋白是布魯氏菌重要的抗原和毒力因子，特別是在粘附侵襲過程中起到了重要作用.Omp19能夠穩(wěn)定布魯氏菌外膜蛋白結(jié)構(gòu)［11]，Omp25 是布魯氏菌外膜的結(jié)構(gòu)蛋白，與肽聚糖（PG）相關(guān)密切，其分子量大小為20KDa.使布魯氏菌S2308、16M 和LSU99 的Omp25基因缺失，得到的缺失突變株，免疫BALB/c小鼠，并與野毒株比較.結(jié)果顯示，野毒株的體內(nèi)外存活能力及激發(fā)體液免疫能力均明顯高于突變株，說明Omp25是布魯氏菌的重要毒力基因［13].有報(bào)道稱，Omp25與引發(fā)流產(chǎn)有關(guān)［14].Omp31 是布魯氏菌的另一免疫保護(hù)性抗原，它具有維持外膜完整性的作用，同時(shí)也是一種潛在的血紅素利用蛋白，與布魯氏菌對(duì)鐵的攝取有關(guān).

1.11 應(yīng)激反應(yīng)蛋白

布魯氏菌可以表達(dá)應(yīng)激反應(yīng)蛋白，用來適應(yīng)不良的胞內(nèi)環(huán)境，從而能夠在巨噬細(xì)胞內(nèi)生存繁殖.其中已經(jīng)證實(shí)的應(yīng)激反應(yīng)蛋白有如下幾種：

1.11.1 抗氧化物歧化酶SOD、H2O2酶 研究表明［15]，SOD在活體巨噬細(xì)胞內(nèi)起作用.Fred M等人通過對(duì)牛種布魯氏菌S2308毒力株和S19疫苗株Cu/Zn-SOD基因缺失研究表明，變異株在HeLa 細(xì)胞和J774細(xì)胞系中的存活和生長能力與它的親本株相同，接種在BALB/c小鼠后，S19變異株恢復(fù)了向膜內(nèi)感染的能力，而S2308 變異株接種BALB/c 小鼠與親本株比較，其脾的重量明顯輕于野生株感染鼠，這些結(jié)果表明，抗氧化物歧化酶在布魯氏菌存活和致病性方面有主要功能.

1.11.2 熱休克蛋白 dnaK是一種熱休克蛋白和分子伴侶，參與毒力因子的折疊和正確定位，具有修復(fù)蛋白的作用，有助于布魯氏菌適應(yīng)胞內(nèi)惡劣環(huán)境.gorEL基因是一種分子伴侶，能夠參與新生蛋白的正確折疊.周質(zhì)蛋白酶HtrA是外周胞質(zhì)的應(yīng)激反應(yīng)蛋白，阻礙高溫及氧化劑對(duì)細(xì)菌的殺傷.該基因與逃避白細(xì)胞殺傷、在巨噬細(xì)胞中的復(fù)制及其毒力有關(guān).

1.11.3 QS QS是一種細(xì)菌胞間信號(hào)傳遞系統(tǒng)，可以協(xié)調(diào)基因的表達(dá)，從而使細(xì)菌適應(yīng)胞內(nèi)環(huán)境、產(chǎn)生毒力因子.布魯氏菌也含有QS系統(tǒng)，有VjbR和BlxR兩個(gè)LuxR轉(zhuǎn)錄激活因子.胞內(nèi)生存和小鼠體內(nèi)存活實(shí)驗(yàn)表明，VjbR突變株在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存能力下降，毒力減弱，與Rambow 等研究結(jié)果相符.另外，文獻(xiàn)報(bào)道［16]VjbR 也可以通過調(diào)控鞭毛調(diào)控子FtcR 來調(diào)控鞭毛基因的轉(zhuǎn)錄.這些結(jié)果表明，QS與布魯氏菌的毒力基因表達(dá)密切相關(guān)，可以通過對(duì)菌體信號(hào)作出應(yīng)答，從整體水平上調(diào)控細(xì)菌的各種毒力因子.

2 致病機(jī)制

2.1 侵入巨噬細(xì)胞

在調(diào)理狀態(tài)下，布魯氏菌主要通過Fc 、補(bǔ)體或纖連蛋白受體被巨噬細(xì)胞攝取.而未受調(diào)理作用的布魯氏菌通過已知和未知的受體分子（如FcR，C3Br）結(jié)合到細(xì)胞膜分泌位點(diǎn)，再通過脂質(zhì)筏侵入巨噬細(xì)胞.布魯氏菌感染巨噬細(xì)胞后，可激活cAMP蛋白激酶A途徑，這對(duì)于布魯氏菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存及復(fù)制是必需的［17].有文獻(xiàn)報(bào)道［18]，與野生株相比，BvrS/BvrR 突變株雖然可以與細(xì)胞結(jié)合，但是進(jìn)入細(xì)胞的效率卻明顯降低.此外，當(dāng)BvrS/BvrR 突變株的外膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變并伴有外膜蛋白Omp25 和Omp22 的缺失以及脂多糖（LPS）的缺陷時(shí)，細(xì)菌即喪失入侵細(xì)胞的能力.這說明，BvrS/BvrR 雙組分系統(tǒng)參與布魯氏菌對(duì)吞噬細(xì)胞的侵襲［19，20].

2.2 侵入胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞

孕期婦女體內(nèi)的布魯氏菌與胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞表面的熱休克蛋白70結(jié)合，其表面的IFN-γ可促進(jìn)胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞對(duì)布魯氏菌的吞噬作用［21]，布魯氏菌在胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞中大量生長繁殖，感染胎盤使其完整性遭到破壞，最終產(chǎn)下帶菌胎兒，嚴(yán)重者可導(dǎo)致流產(chǎn).目前對(duì)胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞中的布魯氏菌的致病形態(tài)還處于探索階段.一些反芻動(dòng)物可以在感染布魯氏菌后產(chǎn)生糖醇類物質(zhì)，刺激細(xì)胞內(nèi)的布魯氏菌生長和繁殖.

2.3 形成布氏小體（BCV）

布魯氏菌毒力株侵入巨噬細(xì)胞后，吞噬小泡與巨噬細(xì)胞內(nèi)的早期內(nèi)吞網(wǎng)絡(luò)相關(guān)環(huán)節(jié)發(fā)生相互作用，激活Rho家族的小GTP酶和中度募集絲狀肌動(dòng)蛋白，通過巨噬細(xì)胞上的某些受體分子使布魯氏菌發(fā)生內(nèi)化，這一過程持續(xù)30 min左右［22].布魯氏菌此時(shí)定居在含有溶酶體相關(guān)膜糖蛋白及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志物SecG1B陽性的囊泡中.大約1h以后，通過獲得溶酶體相關(guān)膜蛋白LAMP21逐漸形成含布魯氏菌的囊泡［23].感染4h后，巨噬細(xì)胞募集的一些抗菌因子已經(jīng)殺滅近90%侵入巨噬細(xì)胞內(nèi)的布魯氏菌，僅有約10%能在巨噬細(xì)胞內(nèi)生存、復(fù)制.這些幸存的布魯氏菌在吞噬體內(nèi)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）持續(xù)作用.感染24h后，含布魯氏菌的吞噬體與ER的部分膜成分交換，獲得ER的部分膜成分后成為BCV，極好的抵御了最初定位的細(xì)胞內(nèi)的酸性環(huán)境，更加有利于布魯氏菌長期生存和復(fù)制.

2.4 抑制巨噬細(xì)胞的活化和凋亡

布魯氏菌感染巨噬細(xì)胞時(shí)，一方面通過阻斷主要致炎細(xì)胞因子TNF-α分泌［24]，阻止感染巨噬細(xì)胞自分泌和旁分泌殺菌活性物質(zhì)，這使得布魯氏菌可以在天然免疫的炎癥階段由于TNF-α的缺乏而產(chǎn)生免疫耐受或偏移的特異性免疫應(yīng)答.此外，通過提高細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量來抑制人巨噬細(xì)胞的活化.另一方面通過誘導(dǎo)抗凋亡基因A1的表達(dá)及激活凋亡抑制劑cAMP 和CREB 等方法，抑制巨噬細(xì)胞的凋亡［25].從而利用巨噬細(xì)胞內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)生存復(fù)制，逃脫免疫系統(tǒng)的攻擊.

3 結(jié)語

本文綜述了布魯氏菌毒力因子與致病機(jī)制的研究進(jìn)展，布魯氏菌含有多種不同的毒力因子，在感染過程中，毒力因子使抗原提呈細(xì)胞的吞噬能力降低，幫助布魯氏菌在吞噬細(xì)胞和非吞噬細(xì)胞中生存繁殖.巨噬細(xì)胞是布魯氏菌感染的靶細(xì)胞，布魯氏菌通過攻擊宿主單核巨噬細(xì)胞，削弱巨噬細(xì)胞的殺傷功能，使巨噬細(xì)胞的抗原提呈功能部分喪失，通過改變抗原提呈細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境，長期存在于細(xì)胞中復(fù)制和繁殖，引發(fā)慢性感染.隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，布魯氏菌的致病機(jī)制在分子水平上將會(huì)有更深入的成果.明確布魯氏菌的致病機(jī)制有助于相關(guān)疫苗的研發(fā)，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)布魯氏菌病的預(yù)防與治療.