pH值處理對(duì)黑豆分離蛋白結(jié)構(gòu)、流變特性及乳化性能的影響

曾 琪，胡 淼，王 歡，鐘明明，齊寶坤，江連洲

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

黑豆是豆科植物大豆的干燥成熟種子[1]，亦稱為馬豆、冬豆子、黑大豆，與普通大豆相比，黑豆蛋白的含量更高，常常被人們稱為“植物蛋白之王”、“豆中之王”。作為一種植物蛋白資源，黑豆分離蛋白（black bean protein isolate，BBPI）來(lái)源廣泛，氨基酸構(gòu)成比例合適，較大豆蛋白更為優(yōu)越，是優(yōu)質(zhì)蛋白資源之一。

隨著社會(huì)的發(fā)展，人們對(duì)食品營(yíng)養(yǎng)和安全越發(fā)重視，對(duì)蛋白質(zhì)的需求量日益增加。蛋白質(zhì)的乳化性和流變性是食品加工制造過(guò)程中需要考慮的重要性質(zhì)[2]，許多研究發(fā)現(xiàn)，pH值處理可以使氨基酸帶電，通過(guò)蛋白質(zhì)與水分子間的離子-偶極相互作用進(jìn)而改變蛋白質(zhì)的溶解性，帶同種電荷的蛋白質(zhì)之間相互排斥導(dǎo)致亞基的解離和結(jié)構(gòu)的展開(kāi)[3]，蛋白質(zhì)的溶解性和表面疏水性顯著影響著蛋白質(zhì)其他功能性質(zhì)的發(fā)揮[4]。目前，關(guān)于黑豆的研究主要集中在抗氧化機(jī)理及品種之間的營(yíng)養(yǎng)成分、功能性質(zhì)差異[5]及產(chǎn)品的研發(fā)[6]，有關(guān)黑豆蛋白的研究集中于熱處理及超聲處理對(duì)黑豆蛋白結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的影響[7-8]。較多學(xué)者研究pH值處理改變蛋白質(zhì)性質(zhì)，主要集中在極端酸堿處理對(duì)大豆蛋白、7S、11S的疏水性、溶解性等理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)的影響[9]或極端pH結(jié)合熱處理對(duì)大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)特性的影響[10]，關(guān)于pH值處理對(duì)BBPI的表面性質(zhì)、流變性質(zhì)及其穩(wěn)定乳液的相互關(guān)系的研究較少，植物蛋白的相互關(guān)系的研究可用于乳劑制備、長(zhǎng)期穩(wěn)定性預(yù)測(cè)和食品質(zhì)量控制。

本研究采用不同pH值條件處理BBPI后調(diào)節(jié)回中性條件，研究pH值對(duì)蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)、流變性、乳化性的影響以及與穩(wěn)定乳液的相互關(guān)系，使黑豆的資源能夠得到更好的發(fā)掘。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑豆 北大荒綠野食品有限公司；2,4,6-三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitro-benzenesulfonicacid，TNBS）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）北京索萊寶科技有限公司；二喹啉甲酸法蛋白含量測(cè)定試劑盒 上海荔達(dá)生物科技有限公司；8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS） 美國(guó)Sigma公司。

磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 天津博迪化工股份有限公司；正己烷 天津北科化學(xué)品有限責(zé)任公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CR22G高速冷凍離心機(jī)、F-4500型熒光分光光度計(jì)日本日立公司；PHS-3D pH計(jì) 上海雷磁儀器廠；TU-1810紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；XW-80A旋渦混合器 上海青浦滬西儀器廠；VIC-212電子天平 美國(guó)艾科勒公司；Discovery系列HR-1型流變儀 美國(guó)TA公司；傅里葉紅外光譜儀美國(guó)Nicoler公司。

1.3 方法

1.3.1 制備BBPI

黑豆去皮、烘干、磨粉、過(guò)60 目篩，1∶3（g/mL）料液比加入正己烷脫脂，25 ℃攪拌1 h后4 500 r/min離心20 min，重復(fù)3 次，沉淀物室溫放置24 h干燥得到脫脂豆粉；參照蔣將等[3]的方法并加以改進(jìn)，干燥后的脫脂豆粕按1∶10（g/mL）的料液比加入去離子水混合，常溫?cái)嚢?0 min，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至8.0，攪拌1 h后，4 ℃、9 000 r/min離心20 min取上清液，上清液用2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至4.0，攪拌1 h后，4 ℃，9 000 r/min離心20 min取沉淀物，沉淀物水洗2 次，取沉淀分散于水中，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 7.0，冷凍干燥后備用。

1.3.2 pH值處理BBPI

取10 份等量的冷凍干燥后的BBPI粉末溶解于去離子水（1∶5 g/mL）中，25 ℃攪拌1 h，分別用2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，或用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，25 ℃攪拌2 h，隨即用2 mol/L NaOH或HCl溶液調(diào)節(jié)pH 7.0，保持中性條件誘導(dǎo)重折疊1 h，冷凍干燥后置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 溶解度

參考Morr等[11]的方法研究BBPI的溶解度隨pH值的變化。將質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%的蛋白溶液轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，4 ℃、9 100 r/min離心10 min，去除不溶性殘?jiān)?。上清液梯度稀釋，采用二喹啉甲酸法測(cè)定上清液蛋白質(zhì)含量，溶解度表示為上清液中蛋白質(zhì)含量與樣品中總蛋白質(zhì)含量的百分比。

1.3.4 乳化性及乳化穩(wěn)定性

取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的蛋白溶液15 mL與5 mL葵花籽油混勻，以12 000 r/min高速勻化2 min，形成均一的乳液，第0分鐘時(shí)從底部吸取50 μL加入5 mL 0.1%的SDS溶液，用旋渦混合器混勻，靜置30 min后從乳液底部再吸取50 μL加入5 mL 0.1%的SDS溶液，用旋渦混合器混勻，500 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度。乳化性和乳化穩(wěn)定性分別按式（1）和（2）計(jì)算。

式中：T為2.303；N為稀釋倍數(shù)；C為形成乳化液之前的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（g/mL）；θ為乳化液的油相體積分?jǐn)?shù)/%；A0為乳化液均質(zhì)后第0分鐘時(shí)測(cè)得的吸光度；A30為乳化液均質(zhì)后靜置30 min后測(cè)得的吸光度；t30－t0為2 次測(cè)定的時(shí)間差。

1.3.5 傅里葉紅外光譜測(cè)定

參照朱明華等[12]的方法，分別取不同pH值處理后凍干的蛋白粉末1 mg，以1∶100的比例加入溴化鉀，研磨均勻，壓片，純溴化鉀為參照，掃描波段400～4 000 cm－1，分辨率4 cm－1，掃描次數(shù)32；傅里葉紅外光譜測(cè)定的酰胺I帶可以計(jì)算BBPI的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量，使用peakfit軟件擬合出在酰胺-I 區(qū)域（1 7 0 0 ～1 6 0 0 c m－1）的峰位，酰胺-I區(qū)域?qū)Φ鞍踪|(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)最為敏感[13]，根據(jù)峰的中心位置將其分配到相應(yīng)的結(jié)構(gòu)中，1 600～1 639 cm－1譜帶歸屬于β-折疊；1 640～1 650 cm－1譜帶歸屬于無(wú)規(guī)卷曲；1 651～1 660 cm－1譜帶歸屬于α-螺旋；1 661～1 700 cm－1譜帶歸屬于β-轉(zhuǎn)角[14]。

1.3.6 表面疏水性

參照Kato等[15]的方法稱取一定量蛋白樣品溶于去離子水，稀釋至蛋白質(zhì)濃度為0.005～0.500 mol/mL，取4 mL不同濃度蛋白樣品加入20 μL 8.0 mmol/L ANS，混勻器混勻，避光靜置15 min測(cè)熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)390 nm，發(fā)射波長(zhǎng)470 nm，狹縫寬度5 nm。以熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白濃度作圖，斜率即為該蛋白樣品的表面疏水性。

1.3.7 內(nèi)源熒光光譜分析

取不同pH值處理后的BBPI樣品溶于去離子水中，蛋白質(zhì)的最終質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL，采用F-4500型熒光分光光度計(jì)測(cè)定BBPI的內(nèi)源性熒光光譜，激發(fā)波長(zhǎng)為290 nm，發(fā)射光的掃描范圍為280～350 nm，狹縫為5 nm，每個(gè)樣品溶液掃描3 次。

1.3.8 流變學(xué)特性的測(cè)定

1.3.8.1 表觀黏度的測(cè)定

不同pH值處理后的BBPI樣品的表觀黏度利用馬爾文流變儀進(jìn)行測(cè)定，將各個(gè)樣品分別溶解于去離子水中制成質(zhì)量濃度為200 mg/mL的蛋白溶液，60 mm、0.5°的錐板，實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行，測(cè)定樣品在0.1～100 s－1頻率范圍內(nèi)的表觀黏度。

1.3.8.2 彈性模量（G’）和黏性模量（G’’）的測(cè)定

用流變儀測(cè)定蛋白質(zhì)的振蕩界面膨脹流變特性隨pH值的變化。將蛋白溶液（200 mg/mL）緩慢注入充滿夾具（60 mm，0.5°的錐板）中，室溫保溫5 min，測(cè)試參數(shù)：振幅值0.3%，剪切頻率0.1～10 Hz，溫度25 ℃，分析樣品分散液的G’、G’’及損耗角正切值（tanδ）隨角頻率的變化。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

利用SPSS 18.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性及相關(guān)性分析，采用Origin 8.0軟件作圖。紅外圖譜數(shù)據(jù)處理采用Peakfit 4.21軟件進(jìn)行擬合分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶解性與表面疏水性

圖1 p值對(duì)BBPI的溶解性與表面疏水性的影響Fig. 1 Effect of pH on solubility and surface hydrophobicity of BBPI

由圖1可知，BBPI的等電點(diǎn)在pH 4.0～5.0之間，表面疏水性在遠(yuǎn)離等電點(diǎn)的兩側(cè)均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)且在等電點(diǎn)附近出現(xiàn)最大值，溶解性在pH 5.0時(shí)最低，遠(yuǎn)離pH 5.0的兩側(cè)時(shí)隨酸堿度的增加而增加，這表明在遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)溶解性與表面疏水性呈負(fù)相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與Kato等[15]的研究一致，即溶解性高的蛋白質(zhì)分子表面存在的疏水性殘基較少。

pH值處理通過(guò)改變蛋白質(zhì)的電離情況進(jìn)而改變BBPI的溶解度；蛋白質(zhì)的疏水性殘基大部分位于蛋白質(zhì)內(nèi)部，pH值處理后BBPI發(fā)生不同程度的變性，蛋白質(zhì)之間的相互作用改變導(dǎo)致蛋白質(zhì)的表面疏水性發(fā)生改變，隨酸堿度增加，疏水基團(tuán)暴露增多，當(dāng)疏水基團(tuán)增加到一定程度時(shí)，蛋白質(zhì)分子間會(huì)通過(guò)疏水鍵相互聚集[9]，發(fā)生疏水坍塌，從而引起表面疏水性下降。等電點(diǎn)附近表面疏水性出現(xiàn)最高值（pH 3.0）可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)亞基解離后經(jīng)過(guò)重折疊呈現(xiàn)舒展的狀態(tài)，位于α-螺旋內(nèi)部的疏水氨基酸殘基暴露，導(dǎo)致疏水性增高。

2.2 pH值處理對(duì)BBPI熒光強(qiáng)度的分析

圖2 不同p值處理下BBPI的熒光光譜Fig. 2 Fluorescence spectra of black bean protein isolate under pH treatments

由圖2可以看出，相比于未經(jīng)pH值處理的BBPI，pH值處理后，BBPI的熒光強(qiáng)度均有所下降且最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生不同程度的紅移，說(shuō)明pH值處理改變了蛋白質(zhì)色氨酸殘基的微環(huán)境，BBPI色氨酸殘基暴露；由表1可知，BBPI的最大吸收波長(zhǎng)（λmax）分布在325～340 nm之間；pH值處理?xiàng)l件下，隨酸處理程度加深，熒光強(qiáng)度從202.6增長(zhǎng)到265.4，最大吸收波長(zhǎng)從330 nm紅移到332 nm；隨堿處理程度加深，熒光強(qiáng)度從324.6增長(zhǎng)到408.2，蛋白質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)從330 nm紅移到333 nm，由此可見(jiàn)，經(jīng)pH值處理后的蛋白質(zhì)的色氨酸殘基所處的微環(huán)境極性有所提高且堿處理對(duì)BBPI影響較大。

表1 不同p值處理下BBPI的熒光強(qiáng)度和最大吸收波長(zhǎng)Table 1 Fluoresceine intensity and maximum absorption wavelength of black bean protein isolate under p treatments

表1 不同p值處理下BBPI的熒光強(qiáng)度和最大吸收波長(zhǎng)Table 1 Fluoresceine intensity and maximum absorption wavelength of black bean protein isolate under p treatments

pH 未處理 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 λmax/nm 328 332 332 331 330 330 330 330 330 332 333熒光強(qiáng)度 464.9 265.4 232.9 214.9 202.6 302.7 314.6 324.6 337.2 346.2 408.2

λmax與色氨酸殘基所處的環(huán)境有關(guān)，λmax＜330 nm表示色氨酸殘基位于非極性環(huán)境，相反λmax＞330 nm則表示色氨酸殘基位于極性環(huán)境，由表1可知，未經(jīng)pH值處理的BBPI的最大吸收波長(zhǎng)為328 nm，表明蛋白質(zhì)色氨酸殘基仍位于蛋白質(zhì)內(nèi)部非極性環(huán)境中，而熒光強(qiáng)度為464.9 nm，明顯大于pH值處理后的樣品熒光強(qiáng)度，可能是因?yàn)锽BPI自身外部的疏水基團(tuán)較多，所以BBPI的溶解性較差；經(jīng)pH值處理后蛋白質(zhì)的色氨酸殘基不同程度的暴露在外部的極性環(huán)境中[16]且BBPI的熒光強(qiáng)度隨著pH值處理程度加深而增加，反映了這種結(jié)構(gòu)變化屬于一種動(dòng)態(tài)過(guò)程，pH值處理后的蛋白樣品熒光強(qiáng)度低于未處理組，可能是因?yàn)锽BPI在pH值處理后再調(diào)整回pH 7的過(guò)程中可能會(huì)產(chǎn)生一種處于變性與未變現(xiàn)之間的“熔球態(tài)”的蛋白，這種情況下的蛋白質(zhì)部分折疊，雖然不能恢復(fù)到之前的狀態(tài)，但蛋白質(zhì)分子的再聚集會(huì)導(dǎo)致更多色氨酸殘基被包裹于更加疏水的分子內(nèi)部，從而引起內(nèi)源熒光強(qiáng)度的下降[17]；也可能是因?yàn)樗釅A環(huán)境下蛋白質(zhì)分子展開(kāi)，使內(nèi)部色氨酸殘基暴露，蛋白質(zhì)分子間相互作用使色氨酸微環(huán)境變化，導(dǎo)致內(nèi)源熒光強(qiáng)度下降[18]。

2.3 pH值處理對(duì)BBPI傅里葉紅外光譜分析

表2 酰胺I帶擬合p值處理下BBPI二級(jí)結(jié)構(gòu)含量Table 2 Contents of secondary structures of black bean protein isolate under p treatments measured by curve-fitting of amide ? band

表2 酰胺I帶擬合p值處理下BBPI二級(jí)結(jié)構(gòu)含量Table 2 Contents of secondary structures of black bean protein isolate under p treatments measured by curve-fitting of amide ? band

注：同列小寫字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。

%pH α-螺旋 β-折疊 β-轉(zhuǎn)角 無(wú)規(guī)卷曲未處理 18.44±0.55a 42.58±0.53ab 22.15±0.05de 16.82±0.05d 2 16.18±0.57de 40.18±0.51cd 25.16±0.58ab 18.49±1.03bc 3 15.78±0.56ef 43.79±0.60a 21.26±0.54e 19.16±0.19b 4 15.09±0.05f 42.64±0.52ab 23.24±0.54cd 19.02±0.02bc 5 14.93±0.02f 42.15±1.02b 22.04±1.05de 20.87±0.02a 6 15.52±0.48ef 42.82±0.05ab 22.72±0.50cde 18.92±0.03bc 7 16.31±0.57de 41.71±1.49b 23.13±1.01cd 18.84±0.03bc 8 16.85±0.83cd 41.36±1.32bc 23.27±1.11cd 18.52±0.59bc 9 17.43±0.59bc 39.97±0.72cde 24.31±1.40bc 18.29±0.20c 10 17.92±0.59ab 39.77±0.05de 24.88±1.00ab 17.43±0.60d 11 18.17±0.56ab 38.71±0.57e 26.07±0.80a 17.05±0.48d

由表2可知，BBPI含有4 種二級(jí)結(jié)構(gòu)組分：α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲，其中α-螺旋和β-折疊為BBPI的有序結(jié)構(gòu)，β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲為無(wú)序結(jié)構(gòu)；與未處理BBPI樣品對(duì)比，pH值處理?xiàng)l件下BBPI的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量減少，無(wú)規(guī)卷曲含量增加，可能是因?yàn)閜H值處理使得BBPI發(fā)生部分變性，變性過(guò)程與α-螺旋結(jié)構(gòu)數(shù)量的減少和無(wú)序結(jié)構(gòu)的數(shù)量增加有關(guān)[19]；在遠(yuǎn)離等電點(diǎn)的pH值處理下，α-螺旋含量顯著增加，β-折疊含量顯著下降，且隨著酸堿度的增加，這些變化更加明顯；靠近等電點(diǎn)時(shí)，α-螺旋含量減小、β-折疊含量增多，可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)表面電荷量少，靜電斥力減小、疏水相互作用增大、分子間氫鍵增大導(dǎo)致的[20]，無(wú)規(guī)卷曲含量的增加可能是受蛋白質(zhì)聚集的影響。β-折疊比例增加的同時(shí)α-螺旋結(jié)構(gòu)的比例減小，可能是因?yàn)閜H值的變化影響了α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)之間的平衡，使其發(fā)生了結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化[21]。通過(guò)與表面疏水性變化規(guī)律相關(guān)性分析表明，表面疏水性與β-轉(zhuǎn)角含量負(fù)相關(guān)（r=－0.423，P＜0.05），表面疏水性與β-折疊含量正相關(guān)（r=0.502，P＜0.05），說(shuō)明蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化影響了其功能性質(zhì)的表達(dá)，王中江等[22]采用圓二色譜研究pH值對(duì)大豆分離蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，得到的結(jié)果與本研究結(jié)果一致。

2.4 pH值處理對(duì)BBPI乳化性的分析

如圖3所示，在pH值處理下，BBPI的乳化性及乳化穩(wěn)定性呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，等電點(diǎn)附近乳化性及乳化穩(wěn)定性最低，可能是因?yàn)榈入婞c(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)表面電荷量少，缺乏靜電排斥的相互作用會(huì)使得乳液中蛋白質(zhì)絮凝、聚集導(dǎo)致乳化性降低，偏離等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)表面靜電荷含量增加，增加了蛋白質(zhì)的溶解性進(jìn)而提高蛋白質(zhì)的乳化活性及乳化穩(wěn)定性，隨酸堿度增加，蛋白質(zhì)逐漸變性，變性蛋白所含氨基酸殘基的疏水基團(tuán)指向油相，而親水性基團(tuán)指向水，越偏離等電點(diǎn)乳化活性越好，可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)發(fā)生了改性，增強(qiáng)了與油相之間的作用，乳化活性更好[23]。

圖3 p值對(duì)BBPI乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響Fig. 3 Effect of pH on EAI and ESI of BBPI

pH值處理可能會(huì)使得BBPI部分形成“熔融態(tài)”的蛋白質(zhì)[24]，這部分蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，但三級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)有所變化，結(jié)構(gòu)展開(kāi)會(huì)導(dǎo)致蛋白內(nèi)部疏水氨基酸暴露，表面疏水性增強(qiáng)，蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的改變顯著提高了蛋白質(zhì)的乳化性能[24]，結(jié)構(gòu)展開(kāi)使得蛋白質(zhì)具有相對(duì)柔軟的構(gòu)象，多肽鏈松散，乳化性能提高[25]。

2.5 pH值處理對(duì)BBPI流變學(xué)特性的分析

2.5.1 表觀黏度

圖4 p值對(duì)BBPI表觀黏度的影響Fig. 4 Effect of pH on apparent viscosity of BBPI

由圖4可知，在同一剪切速率下，不同pH條件處理后BBPI溶液的表觀黏度不同，pH值處理后的蛋白質(zhì)溶液的表觀黏度大于未處理組，說(shuō)明處理后的蛋白體系趨于穩(wěn)定[26]；不同pH條件處理的蛋白溶液樣品間表觀黏度值和變化趨勢(shì)差異較大，等電點(diǎn)時(shí)的表觀黏度最低，所有樣品的表觀黏度隨剪切速率的增加均呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，即表現(xiàn)出剪切稀釋的現(xiàn)象，符合非牛頓流體特性，這與Karaman等[27]報(bào)道的乳液剪切稀化一致。

表觀黏度的變化規(guī)律與乳化活性及乳化穩(wěn)定性大體一致，即遠(yuǎn)離等電點(diǎn)均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。在pH 3時(shí)表觀黏度大于pH 2條件下的蛋白溶液，可能是因?yàn)樵摋l件處理BBPI導(dǎo)致疏水基團(tuán)暴露較多，蛋白間形成了三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，降低了流動(dòng)性，即蛋白質(zhì)分子之間的連接更加緊密，表觀黏度增大[28-29]。表觀黏度呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)且在等電點(diǎn)時(shí)最小，這與孫少敏等[30]報(bào)道的小麥醇溶蛋白溶液的研究一致，這是因?yàn)榕R近等電點(diǎn)，水合度小，溶液流動(dòng)時(shí)受到的阻力小，故在pH 4、5時(shí)黏度較小；遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)溶解性高，水化程度比較高，能固定更多的水分子，體積變大，根據(jù)托克斯定律[31]，蛋白溶液體積越大，溶液在流動(dòng)的過(guò)程中受到的內(nèi)部阻力越大，阻礙了介質(zhì)的自由移動(dòng)從而表現(xiàn)出較高的表觀黏度，所以表觀黏度呈上升趨勢(shì)[32]；尤其當(dāng)pH值過(guò)于偏酸偏堿時(shí)，蛋白質(zhì)發(fā)生部分變性，削弱了表面水合層蛋白質(zhì)分子間發(fā)生聚集形成較大的聚合物，很大程度上提高了蛋白質(zhì)溶液的黏度[33]。也可能是因?yàn)檫h(yuǎn)離等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)表面帶同種電荷量增加，靜電斥力增加導(dǎo)致黏度增加[33]。

2.5.2 BBPI黏彈性

圖5 p值對(duì)BBPI的G’、G’’的影響Fig. 5 Effect of pH on G’ and G’’ of BBPI

由于蛋白質(zhì)發(fā)生凝膠的能力與聚集狀態(tài)有很大的關(guān)系，所以蛋白質(zhì)在不同的pH值處理?xiàng)l件發(fā)生的不同聚集模式可能對(duì)蛋白質(zhì)的凝膠能力有很大的影響，小幅振蕩變形流變測(cè)試已經(jīng)被廣泛用于研究蛋白凝膠過(guò)程中的黏彈性和分子間相互作用。由圖5可以看出，儲(chǔ)能模量對(duì)掃描頻率具有一定的依賴性，pH值處理后的樣品G’值高于未處理組，說(shuō)明pH值處理BBPI可以在一定程度上促進(jìn)形成均一、致密、高強(qiáng)度的蛋白質(zhì)凝膠狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[34]，pH值處理后的樣品的G’增大，原因可能是pH值處理后蛋白質(zhì)中的亞基發(fā)生變性，巰基氧化形成二硫鍵，新的二硫鍵進(jìn)一步加強(qiáng)了蛋白質(zhì)分子間的共價(jià)作用，加固了蛋白的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，G’增強(qiáng)[35]；pH 4.0、5.0時(shí)G’、G’’增長(zhǎng)緩慢可能是因?yàn)榕R近等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)水合能力差，蛋白質(zhì)重排變得困難，降低了G’增長(zhǎng)的速度，蛋白質(zhì)發(fā)生聚集生成沉淀不能產(chǎn)生凝膠，黏彈性較差。pH 11.0樣品的G’和G’’低，可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)變性結(jié)構(gòu)展開(kāi)，有序結(jié)構(gòu)向無(wú)序結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變導(dǎo)致流動(dòng)性增加，這有可能破壞已經(jīng)形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，所以G’下降[35]；也可能是極端pH值條件下破壞了疏水相互作用力和范德華力，使蛋白亞基之間的二硫鍵發(fā)生斷裂，蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)部分展開(kāi)，從而改變了蛋白質(zhì)緊密的三維結(jié)構(gòu)，黏彈性減弱。不同pH值處理后樣品的G’增幅差異較大，說(shuō)明pH值對(duì)蛋白形成凝膠網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)有很大的影響。

圖6 p值對(duì)BBPI的tanδ的影響Fig. 6 Effect of pH on tanδ of BBPI

tanδ值可以作為衡量蛋白質(zhì)在凝膠三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的動(dòng)態(tài)性質(zhì)。由圖6可知，未處理組、pH 2.0、4.0、5.0、11.0的BBPI溶液tanδ＞1且呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明蛋白溶液體系的聚合度變小，形成的凝膠狀的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)不夠穩(wěn)定，可能在高剪切頻率下，破壞了已經(jīng)形成的三維結(jié)構(gòu)。pH值處于等電點(diǎn)時(shí)tanδ值大，說(shuō)明蛋白質(zhì)的G’’性強(qiáng)，流動(dòng)性大，不利于形成凝膠狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[36]。pH 3.0時(shí)tanδ＜1且隨頻率增加有所上升，表明pH 3的條件顯著提高BBPI的黏彈性[37]。pH 6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的蛋白溶液的tanδ＜1且從低剪切頻率到高剪切頻率幾乎不變，表明在這個(gè)范圍內(nèi)蛋白質(zhì)的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)黏性越低，彈性越高，tanδ值越低表明形成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更好[38]，說(shuō)明在6＜pH＜10范圍內(nèi)pH值處理使得蛋白在溶液中的彈性更強(qiáng)，結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，可能是疏水相互作用在穩(wěn)定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)聚集物方面發(fā)揮重要作用。對(duì)比表面疏水性數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，表面疏水性強(qiáng)的BBPI樣品溶液形成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更好。

3 結(jié) 論

pH值處理對(duì)BBPI的理化性質(zhì)及流變性質(zhì)產(chǎn)生了一定的影響，遠(yuǎn)離等電點(diǎn)隨pH值升高，蛋白質(zhì)間的疏水作用降低，減少了靜電粒子的相互作用，溶解性得到改善，具有高溶解性蛋白質(zhì)的表面疏水性較低；三級(jí)結(jié)構(gòu)展開(kāi)，亞基解離，巰基氧化成二硫鍵可以進(jìn)一步加強(qiáng)蛋白質(zhì)的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，疏水氨基酸暴露影響蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)，表面活性增強(qiáng)，溶解性和乳化性隨之增強(qiáng)，蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了由β-折疊向α-螺旋的轉(zhuǎn)變，表面疏水性與β-折疊含量正相關(guān)（r=0.502，P＜0.05），溶解度與乳化性變化趨勢(shì)一致，與表面疏水性變化趨勢(shì)相反。

隨pH值處理?xiàng)l件變化，表觀黏度先減少后增大，pH值處理后BBPI乳液的黏彈性均高于未處理組，表面疏水性對(duì)形成凝膠狀的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)發(fā)揮重要作用；研究發(fā)現(xiàn)制備乳液時(shí)具有高溶解性和低疏水性（pH 11.0）的蛋白質(zhì)能更好的與油水界面結(jié)合，乳化活性與穩(wěn)定性最好；具有高溶解性和高疏水性（pH 3.0）的蛋白質(zhì)能形成強(qiáng)黏彈性界面膜，且表面疏水性越高，形成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更好。