牛至細(xì)胞懸浮培養(yǎng)合成多酚及黑曲霉誘導(dǎo)子的促進(jìn)作用

李燕平，劉 媛，王小強(qiáng)，沈倍韻，周香菊，趙文佳，陳繼光,，尹忠平,

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045；2.南開(kāi)大學(xué) 藥物化學(xué)生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300350）

牛至（Origanum vulgare）為唇形科牛至屬多年生草本植物[1]，又名山薄荷、野荊芥、五香草，主要分布于我國(guó)的新疆、甘肅、湖北等省區(qū)以及地中海地區(qū)、北非、北美等地[2]。牛至中含有具有獨(dú)特香味、抗菌消炎活性的香荊芥酚、百里香酚等揮發(fā)性成分[3]，可廣泛用于飲料、食用香料、食品防腐劑、飼料添加劑等[4-6]。除揮發(fā)油外，牛至還富含多酚、三萜和甾醇等非揮發(fā)性活性成分，其中迷迭香酸是牛至多酚類(lèi)物質(zhì)的主要成分。迷迭香酸具有抗菌、抗病毒、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫和改善記憶等多方面的生理活性[7-8]。Kikuzaki等[9]從牛至葉片中分離得到了咖啡酸、迷迭香酸和原兒茶酸等5 種多酚類(lèi)物質(zhì)，并證實(shí)其有很強(qiáng)的抗氧化活性。Farr等[10]研究發(fā)現(xiàn)，迷迭香提取物中所含的迷迭香酸可以顯著提高SAMP8小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。Rocha等[8]通過(guò)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，迷迭香酸具有很好的抗氧化和抗炎能力。因此，牛至中迷迭香酸等多酚類(lèi)物質(zhì)具有很好的開(kāi)發(fā)利用前景。

以植物的根、莖、葉、花、果實(shí)等為原料提取植物次生代謝產(chǎn)物，雖然材料種類(lèi)多、來(lái)源廣，但植物生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，依賴(lài)于自然條件，受環(huán)境和病蟲(chóng)害的影響較大，同時(shí)由于原料成分復(fù)雜，純化的難度較大、成本高；而植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物具有周期短、可控性強(qiáng)、受自然環(huán)境影響小、目標(biāo)物易于提取和純化等諸多優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是一種有巨大潛力的天然產(chǎn)物生產(chǎn)技術(shù)[11]。但從目前的研究報(bào)道看，植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物還存在產(chǎn)量較低的問(wèn)題，而通過(guò)添加誘導(dǎo)子進(jìn)行刺激可有效提高目標(biāo)物的產(chǎn)量，是解決這一問(wèn)題的較好途徑之一[12]。黑曲霉誘導(dǎo)子（Aspergillus nigerelicitor，ANE）是一種能刺激植物和微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的真菌誘導(dǎo)子，其通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)引起相關(guān)基因表達(dá)的變化，從而促進(jìn)多酚類(lèi)、萜類(lèi)、生物堿類(lèi)、黃酮類(lèi)等特定次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成[13]。Rajendran等[14]研究表明，ANE和黃曲霉誘導(dǎo)子均可顯著促進(jìn)胡蘿卜愈傷組織中花青素的合成。熊瓊瓊等[15]在青錢(qián)柳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中添加200 μg/mL的ANE，細(xì)胞內(nèi)總?cè)坪刻岣叩?9.52 mg/g，為對(duì)照組的10.21 倍。Yu Longjiang等[16]發(fā)現(xiàn)外源ANE可以提高紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)體系中紫杉醇合成相關(guān)酶的活性，從而顯著提高紫杉醇產(chǎn)量。上述研究表明，ANE對(duì)植物細(xì)胞合成次生代謝產(chǎn)物有較好的促進(jìn)作用。

本研究以實(shí)驗(yàn)室前期建立的牛至細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系合成迷迭香酸等多酚類(lèi)物質(zhì)，初步鑒定其中的多酚化合物種類(lèi)，為進(jìn)一步提高多酚的含量和產(chǎn)量，采用ANE對(duì)懸浮培養(yǎng)的牛至細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，研究誘導(dǎo)對(duì)迷迭香酸等多酚合成的影響，旨在為牛至細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)多酚提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛至懸浮培養(yǎng)細(xì)胞由江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；黑曲霉（CGMCC3.0453）購(gòu)于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

MS（Murashige and Skoog）培養(yǎng)基 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；甲醇（色譜純） 美國(guó)Tieda試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TripleTOF5600＋超高效液相色譜-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-time of flight-tandem mass spectrometry，UPLC-TOF-MS/MS）儀美國(guó)ABSciex公司；1260高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國(guó)Agilent科技有限公司；SW-CJ-ICU潔凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；ZHWY-3222回旋振蕩搖瓶機(jī)美國(guó)惠普公司；V-5600紫外分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；SY-360超聲波提取儀 上海寧商超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛至細(xì)胞懸浮培養(yǎng)

選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的牛至懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，重新接種到新的MS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：MS培養(yǎng)基添加3.0 mg/L激動(dòng)素、0.5 mg/L二氯苯氧乙酸和30 g/L蔗糖，置于含有250 mL培養(yǎng)液的500 mL三角瓶中進(jìn)行振蕩光培養(yǎng)，接種量（鮮細(xì)胞質(zhì)量/培養(yǎng)液體積）為15 g/100 mL，培養(yǎng)pH值為5.8±0.2，溫度（28±1）℃，轉(zhuǎn)速120 r/min，每10 d繼代一次。

1.3.2 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制

參照Liu Zebo等[17]方法。選取生長(zhǎng)迅速、性狀穩(wěn)定、活力高的10 d齡懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，篩網(wǎng)過(guò)濾后，稱(chēng)取6 g接種于裝有40 mL MS液體培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，其他培養(yǎng)條件同1.3.1節(jié)，培養(yǎng)16 d，每2 d收獲一次，烘干稱(chēng)質(zhì)量。以干質(zhì)量（g）為縱坐標(biāo)、收獲時(shí)間（d）為橫坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.3.3 細(xì)胞生物量的測(cè)定

將懸浮培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行真空抽濾后，置于50 ℃恒溫烘箱中烘干至質(zhì)量恒定，稱(chēng)量得干質(zhì)量。

1.3.4 細(xì)胞活力的測(cè)定

參照劉澤波[18]方法，采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）法。稱(chēng)取洗滌后的懸浮細(xì)胞200 mg，放入試管，加入0.1% TTC溶液（用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液配制成pH 7）5 mL，置于22 ℃恒溫箱中染色26 h。取出吸去TTC液，用重蒸餾水漂洗2～3 次后，加入5 mL 95%乙醇溶液，置于60 ℃水浴中孵育30 min，待細(xì)胞完全無(wú)色后，離心，取上清液在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，吸光度越大，則細(xì)胞活力越強(qiáng)。

1.3.5 細(xì)胞總多酚的提取

準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g牛至懸浮培養(yǎng)細(xì)胞粉末于試管中，加入20 mL 50%甲醇溶液，在50 ℃恒溫條件下超聲輔助提取50 min，提取液4 000 r/min離心10 min，收集上清液，低溫避光保存，備用。

1.3.6 總多酚含量測(cè)定

采用福林-酚比色法，參照朱仙慕等[19]的方法，以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得回歸方程y=0.010 6x＋0.016 9 （y為吸光度，x為沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度（μg/mL）），檢測(cè)范圍為20～120 μg/mL，R2為0.999 2?？偠喾雍恳悦靠伺Ｖ翍腋∨囵B(yǎng)細(xì)胞（干質(zhì)量）樣品中沒(méi)食子酸當(dāng)量（mg）表示。

1.3.7 HPLC及UPLC-TOF-MS/MS檢測(cè)條件

將1.3.5節(jié)制得的樣品溶液，經(jīng)0.45 μm的有機(jī)濾膜過(guò)濾，備用。標(biāo)準(zhǔn)品均用50%甲醇溶液溶解，經(jīng)0.45 μm的有機(jī)濾膜過(guò)濾，備用。

HPLC檢測(cè)條件：C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速1 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.2%醋酸溶液（B），梯度洗脫（0～40 min，5%～37.5% A、95%～62.5% B；40～45 min，37.5%～5% A、62.5%～95% B）；檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm。

U P L C-TO F-M S/M S 檢 測(cè) 條 件 ： U P L C 條 件 ：流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量2 μL；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.2%醋酸溶液（B），梯度洗脫（0～20 min，5%～40% A、95%～60% B；20～30 min，40%～95% A、60%～5% B；30～32 min，95% A、5% B；32～35 min，95%～5% A、5%～95% B），檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm。MS/MS條件：采用負(fù)離子模式；毛細(xì)管電壓3 500 V；質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 250；霧化氣壓力40 psi；干燥氣流速10 L/min；干燥氣溫度350 ℃；碰撞電壓120 V。

1.3.8 迷迭香酸含量測(cè)定

采用HPLC法進(jìn)行測(cè)定，具體條件如1.3.7節(jié)所示。以迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=10 989x＋7.712 4（y為吸光度，x為迷迭香酸質(zhì)量濃度（μg/mL）），檢測(cè)范圍為25～400 μg/mL，R2為0.999 4。迷迭香酸含量以每克牛至懸浮培養(yǎng)細(xì)胞（干質(zhì)量）樣品中迷迭香酸當(dāng)量（mg）表示。

1.3.9 ANE的制備

參照熊瓊瓊[15]的方法，取振蕩培養(yǎng)7 d的成熟黑曲霉菌絲，置于十字研磨器中，添加適量磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）進(jìn)行研磨勻漿，4 000 r/min離心10 min；取上層懸濁液，121 ℃滅菌30 min，即得ANE。ANE質(zhì)量濃度以總糖含量計(jì)，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)，采用蒽酮-硫酸比色法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.10 誘導(dǎo)參數(shù)單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

ANE質(zhì)量濃度：牛至懸浮培養(yǎng)細(xì)胞處理、培養(yǎng)條件同1.3.2節(jié)，培養(yǎng)至第10天時(shí)分別添加質(zhì)量濃度為25、50、100、200 μg/mL的ANE，空白對(duì)照組加入等體積的緩沖液（pH 6.0），繼續(xù)培養(yǎng)2 d后收獲細(xì)胞。

ANE添加時(shí)間：牛至懸浮培養(yǎng)細(xì)胞處理、培養(yǎng)條件同1.3.2節(jié)，分別在指數(shù)生長(zhǎng)初期（第8天）、指數(shù)生長(zhǎng)中期（第10天）、指數(shù)生長(zhǎng)末期（第12天）添加50 μg/mL的ANE，空白對(duì)照組在相同時(shí)間點(diǎn)加入等體積的緩沖液（pH 6.0），均在添加誘導(dǎo)子后繼續(xù)培養(yǎng)2 d收獲細(xì)胞。

ANE持續(xù)作用時(shí)間：牛至懸浮培養(yǎng)細(xì)胞處理、培養(yǎng)條件同1.3.2節(jié)，待其生長(zhǎng)至第10天時(shí)加入50 μg/mL的ANE，每組均設(shè)置空白對(duì)照，空白對(duì)照組均在相同時(shí)間點(diǎn)加入等體積的緩沖液（pH 6.0），持續(xù)作用1、2、3 d后收獲細(xì)胞。

1.3.11 優(yōu)化誘導(dǎo)參數(shù)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

牛至懸浮培養(yǎng)細(xì)胞處理、培養(yǎng)條件同1.3.2節(jié)，采用單因素試驗(yàn)得出的最佳條件，測(cè)定其生物量、總多酚和迷迭香酸的含量及產(chǎn)量，設(shè)置空白對(duì)照組，空白對(duì)照組加入等體積的緩沖液（pH 6.0），每組均設(shè)置3 個(gè)平行。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用Origin和SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3 次重復(fù)，數(shù)據(jù)結(jié)果以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛至懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)特性

如圖1所示，牛至懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線總體呈典型的“S”型，與文獻(xiàn)報(bào)道的青錢(qián)柳[20]、黃梔子[17]細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線基本相似。為期16 d的生長(zhǎng)周期大致可以劃分為4個(gè)階段：遲滯期（0～8 d）、指數(shù)生長(zhǎng)期（8～12 d）、穩(wěn)定期（12～14 d）及衰退期（14～16 d）。當(dāng)牛至懸浮培養(yǎng)細(xì)胞剛接種到新的培養(yǎng)環(huán)境中時(shí)，需要一定時(shí)間適應(yīng)新環(huán)境，因此有一個(gè)較長(zhǎng)的生長(zhǎng)遲滯期，此時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢；當(dāng)細(xì)胞逐漸適應(yīng)了新的培養(yǎng)環(huán)境，開(kāi)始迅速增殖，進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期（8～12 d），4 d時(shí)間內(nèi)細(xì)胞生物量從8.5 g/L迅速提高到19.00 g/L；第12天為細(xì)胞生物量最大時(shí)間點(diǎn)，此時(shí)細(xì)胞呈濃密狀態(tài)，且無(wú)褐化現(xiàn)象；14 d后細(xì)胞逐漸衰亡，生物量逐漸下降，出現(xiàn)較明顯褐化現(xiàn)象。

圖1 牛至懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線Fig. 1 Growth curve of suspension-cultured O. vulgare cells

2.2 牛至懸浮培養(yǎng)細(xì)胞多酚的合成特征

圖2 牛至細(xì)胞總多酚含量和產(chǎn)量Fig. 2 Content and yield of polyphenols in suspension-cultured O. vulgare cells

如圖2所示，在為期16 d的生長(zhǎng)周期中，總多酚含量大致呈“一”字型，而其產(chǎn)量走勢(shì)大致和生長(zhǎng)曲線相似呈典型的“S”型，且均在第12天達(dá)到峰值，分別為9.58 mg/g、182.08 mg/L。在生長(zhǎng)周期的前8 d，細(xì)胞總多酚含量基本維持在同一水平，但其產(chǎn)量逐漸增加；培養(yǎng)8～12 d，總多酚含量呈現(xiàn)小幅增加的趨勢(shì)，可能此期間是細(xì)胞多酚的合成期；培養(yǎng)12 d后，細(xì)胞逐漸衰亡，總多酚含量和產(chǎn)量也逐漸下降。綜合分析牛至細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和多酚的積累量可知，在整個(gè)生長(zhǎng)周期中，總多酚含量一直維持在相對(duì)較低水平，其產(chǎn)量也相對(duì)較低，且其產(chǎn)量的提高大部分是由生物量引起的而非含量。目前的研究表明，ANE誘導(dǎo)是提高植物細(xì)胞次生代謝物含量的有效手段。杜坤玉[21]用黑曲霉粗提物處理虎杖愈傷組織，發(fā)現(xiàn)其白藜蘆醇含量顯著提高。劉澤波等[22]在青錢(qián)柳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中加入200 μg/mL ANE 10 h后，三萜含量提高到了36.46 mg/g，為對(duì)照組的3.36 倍。因此，后續(xù)進(jìn)行ANE誘導(dǎo)研究，以進(jìn)一步提高牛至細(xì)胞總多酚含量。

2.3 牛至懸浮培養(yǎng)細(xì)胞多酚類(lèi)物質(zhì)的鑒定

2.3.1 HPLC分析

圖3 牛至細(xì)胞提取物的PLC圖Fig. 3 HPLC chromatograms of the extract from O. vulgare cells

由圖3可知，在本實(shí)驗(yàn)所采用的檢測(cè)方法和條件下，樣品溶液中的各色譜峰得到了較好分離，表明其中的化合物分離度較好，可以采用此條件進(jìn)行后續(xù)的檢測(cè)和分析；細(xì)胞提取物檢測(cè)色譜圖中主要有7 個(gè)色譜峰，為了確定這7 個(gè)色譜峰所代表的物質(zhì)，結(jié)合UPLC-TOF-MS/MS進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)和分析。

2.3.2 UPLC-TOF-MS/MS分析

在HPLC檢測(cè)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用UPLC-TOF-MS/MS對(duì)牛至懸浮細(xì)胞提取物中的多酚類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行鑒定，UPLC圖和總離子流圖如圖4所示，各物質(zhì)二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖5。在UPLC-TOF-MS/MS檢測(cè)圖譜中，保留時(shí)間為1.25 min處有一個(gè)較高的峰，通過(guò)對(duì)比其與樣品制備所用溶劑的一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜信息，推斷為溶劑峰而非次級(jí)代謝產(chǎn)物峰。

圖4 UPLC（a）和總離子流圖（b）Fig. 4 UPLC chromatogram (a) and total ion current chromatogram (b)

圖5 UPLC-TOF-MS/MS測(cè)定牛至細(xì)胞多酚類(lèi)物質(zhì)Fig. 5 Detection of polyphenols from suspension-cultured O. vulgare cells by UPLC-TOF-MS/MS

1號(hào)峰的保留時(shí)間為2.81 min，其分子離子峰[M－H]－為m/z315.073 3，與原兒茶酸和己糖形成的糖苷類(lèi)化合物的分子質(zhì)量相吻合。在其二級(jí)質(zhì)譜中，出現(xiàn)了m/z152.013 6、153.020 5、108.025 4和109.032 5的特征碎片離子（圖5a），與Karar等[23]所鑒定的原兒茶酸-O-己糖苷的質(zhì)譜檢測(cè)數(shù)據(jù)基本相符。因此，初步推斷1號(hào)峰為原兒茶酸-O-己糖苷。

2號(hào)峰的保留時(shí)間為3.98 min，其分子離子峰[M－H]－為m/z299.114 6，二級(jí)質(zhì)譜中有59.021 6、119.054 5、71.019 2和137.067 0等特征碎片離子（圖5b），參照文獻(xiàn)[24]推斷2號(hào)峰為紅景天苷。細(xì)胞多酚提取物加入紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)品后進(jìn)行HPLC檢測(cè)，結(jié)果表明紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)品與2號(hào)峰出峰時(shí)間一致，加標(biāo)后的峰面積相應(yīng)增大，峰形左右對(duì)稱(chēng)。因此，推斷2號(hào)峰為紅景天苷。

3號(hào)峰的保留時(shí)間為4.78 min，其質(zhì)譜信息與Karar等[23]等通過(guò)UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS法鑒定山楂中所含的水楊酸-O-葡糖苷的質(zhì)譜信息基本一致，其[M－H]－為m/z299.078 5，二級(jí)質(zhì)譜中有m/z93.038 9和137.026 5這兩個(gè)主要碎片離子峰（圖5c）。因此，推斷3號(hào)峰為水楊酸-O-葡糖苷。

4、5、6號(hào)峰的保留時(shí)間分別為10.074、11.598 min和12.438 min，其分子離子峰m/z分別為521.129 7、359.082 0和373.093 4，二級(jí)質(zhì)譜中均有m/z161.02、135.04、179.03、197.04這些特征碎片離子峰。研究表明，迷迭香酸分子離子峰為[M－H]－為m/z359.08，二級(jí)質(zhì)譜主要碎片離子峰為m/z161.02、135.04、179.04、197.04[25]。因此，推斷這3 個(gè)化合物為迷迭香酸及其衍生物。5號(hào)峰的二級(jí)碎片主要有161.025 7、133.031 4、135.045 9、179.035 7和197.046 0（圖5e），其質(zhì)譜信息與Parejo等[25]所鑒定的迷迭香酸檢測(cè)數(shù)據(jù)基本一致，推斷5號(hào)峰為迷迭香酸。通過(guò)加入迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行HPLC檢測(cè)，確證5號(hào)峰為迷迭香酸。4號(hào)峰和6號(hào)峰的二級(jí)碎片還分別有323.077 2、359.082 0、521.129 7（圖5d）和175.041 0（圖5f），通過(guò)與Yang Yimin[26]和Abedini[27]等報(bào)道的質(zhì)譜信息進(jìn)行比對(duì)，推斷4號(hào)峰為迷迭香酸-3-O-葡糖苷，6號(hào)峰為迷迭香酸甲酯。

保留時(shí)間為6.8 min的色譜峰，其分子離子峰為m/z221.047 8，二級(jí)質(zhì)譜特征碎片峰的m/z77.045 9、133.068 5、55.027 9、159.047 0、131.052 4，尚未發(fā)現(xiàn)類(lèi)似的質(zhì)譜檢測(cè)數(shù)據(jù)報(bào)道，因此目前還無(wú)法做出判斷，有待于進(jìn)一步鑒定。

2.4 ANE質(zhì)量濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和多酚積累的影響

2.4.1 ANE質(zhì)量濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

由圖6可知，在設(shè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)添加ANE，細(xì)胞生物量無(wú)顯著性差異，細(xì)胞活力基本保持在同一水平，說(shuō)明添加25～200 μg/mL ANE對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)不會(huì)產(chǎn)生顯著影響。當(dāng)ANE質(zhì)量濃度低于200 μg/mL時(shí)，所收獲細(xì)胞的外觀形態(tài)和顏色與對(duì)照組相比基本沒(méi)有差異，均呈淡黃白色；當(dāng)ANE質(zhì)量濃度為200 μg/mL 時(shí)，細(xì)胞發(fā)生了輕微的褐化，細(xì)胞顏色加深，呈淡黃褐色（圖7a）。較高質(zhì)量濃度的ANE處理會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生一定程度的褐化，這與李萍等[28]的研究報(bào)道相似。為了觀察ANE誘導(dǎo)作用下懸浮培養(yǎng)細(xì)胞在微觀形態(tài)上的變化，在倒置顯微鏡下觀察了不同ANE質(zhì)量濃度處理下的細(xì)胞形態(tài)（圖7b），發(fā)現(xiàn)在設(shè)定范圍內(nèi)，ANE誘導(dǎo)對(duì)細(xì)胞的微觀形態(tài)基本沒(méi)有影響，細(xì)胞均為圓形或橢圓形，大多數(shù)細(xì)胞聚集成10 個(gè)細(xì)胞左右的細(xì)胞團(tuán)。Yin Zhongping等[20]在研究青錢(qián)柳細(xì)胞生長(zhǎng)的研究中表明，單細(xì)胞和過(guò)大的細(xì)胞聚集體均不利于細(xì)胞生長(zhǎng)，最適合青錢(qián)柳細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞聚集體大小為10～80 個(gè)細(xì)胞。

圖6 不同質(zhì)量濃度AN作用下的細(xì)胞生物量及細(xì)胞活力Fig. 6 Biomass and viability of the harvested cells under the elicitation of ANE at different concentrations

圖7 AN作用下細(xì)胞外觀（a）和顯微鏡下的細(xì)胞形態(tài)（b）Fig. 7 ANE-elicited cells (a) and its morphology observed under inverted microscope (b)

2.4.2 ANE質(zhì)量濃度對(duì)細(xì)胞多酚積累的影響

由圖8可知，隨著ANE質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞總多酚和迷迭香酸（細(xì)胞中的代表性多酚化合物）的含量和產(chǎn)量均呈現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)，大致呈倒“V”字形，均在50 μg/mL時(shí)達(dá)到最高峰值；細(xì)胞總多酚的峰值含量和產(chǎn)量分別為26.21 mg/g、485.00 mg/L，分別增加了1.67 倍和1.83 倍；迷迭香酸的峰值含量和產(chǎn)量分別為18.55 mg/g、336.77 mg/L，分別增加了2.24 倍和2.37 倍。在懸浮培養(yǎng)的牛至細(xì)胞中，迷迭香酸是多酚中的主要成分，其占總多酚比例在58.35%～76.76%之間，ANE對(duì)細(xì)胞多酚合成的促進(jìn)作用主要體現(xiàn)在促進(jìn)迷迭香酸的合成上。綜合分析細(xì)胞生物量、總多酚含量和產(chǎn)量的變化規(guī)律可知，ANE誘導(dǎo)牛至懸浮培養(yǎng)細(xì)胞合成多酚的作用效果是通過(guò)提高細(xì)胞內(nèi)迷迭香酸等多酚物質(zhì)的含量實(shí)現(xiàn)的，而非細(xì)胞生物量。劉冉[29]在以茉莉酸甲酯誘導(dǎo)紅松細(xì)胞多酚合成的研究中發(fā)現(xiàn)，1.00～2.50 μmol/L茉莉酸甲酯處理組與對(duì)照組相比，原花青素積累量沒(méi)有顯著差異；當(dāng)濃度為5.00、10.00 μmol/L時(shí)，原花青素含量顯著高于對(duì)照組；而高濃度（20.00～40.00 μmol/L）處理則顯著降低了原花青素的積累量，其誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與本研究基本一致。

圖8 不同質(zhì)量濃度AN作用下牛至細(xì)胞迷迭香酸、總多酚的含量和產(chǎn)量Fig. 8 Contents and yields of rosmarinic acid and polyphenol in O. vulgare cells under the elicitation of ANE at different concentrations

2.5 ANE添加時(shí)間對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和多酚積累的影響

2.5.1 不同時(shí)間點(diǎn)添加ANE對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

圖9 不同時(shí)間點(diǎn)添加AN作用下細(xì)胞生物量（A）和細(xì)胞活力（B）Fig. 9 Biomass (A) and viability (B) of cells under the elicitation of ANE added at different times

在指數(shù)生長(zhǎng)初期添加ANE對(duì)牛至懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)有輕微的抑制作用，此時(shí)細(xì)胞生物量下降為對(duì)照組的94%；在指數(shù)生長(zhǎng)中期和末期添加誘導(dǎo)子對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)基本沒(méi)有影響，ANE誘導(dǎo)組的細(xì)胞生物量大致與對(duì)照組細(xì)胞生物量持平（圖9A）。細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果（圖9B）表明，隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞活力呈逐漸下降的趨勢(shì)；在不同的時(shí)間點(diǎn)添加誘導(dǎo)子，ANE組細(xì)胞活力與對(duì)照組細(xì)胞活力基本一致，說(shuō)明添加50 μg/mL ANE不會(huì)抑制細(xì)胞活力。此外，在指數(shù)生長(zhǎng)期添加誘導(dǎo)子對(duì)細(xì)胞的外觀形態(tài)沒(méi)有影響，培養(yǎng)瓶中均有細(xì)胞掛壁，細(xì)胞培養(yǎng)物呈現(xiàn)濃稠膏狀，真空抽濾后的細(xì)胞顆粒均一、呈細(xì)砂狀（圖10）。

圖10 第10天添加50 誘導(dǎo)作用2 d后的細(xì)胞Fig. 10 Cells elicited for 2 days by ANE added on the 10th day

2.5.2 不同時(shí)間點(diǎn)添加ANE對(duì)細(xì)胞多酚積累的影響

圖11 不同時(shí)間點(diǎn)添加AN作用下迷迭香酸、總多酚的含量（a）和產(chǎn)量（b）Fig. 11 Contents (a) and yields (b) of rosmarinic acid and total polyphenols in O. vulgare cells under the elicitation of ANE with different addtion times

有研究表明，在遲滯期添加誘導(dǎo)子會(huì)抑制次生代謝產(chǎn)物的合成，而在穩(wěn)定期添加誘導(dǎo)子對(duì)細(xì)胞幾乎沒(méi)有刺激效果，因?yàn)榇藭r(shí)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分基本被消耗完，細(xì)胞已經(jīng)停止生長(zhǎng)；只有指數(shù)生長(zhǎng)期最適于誘導(dǎo)，此時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛、活力最強(qiáng)，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗最快，次生代謝產(chǎn)物合成相關(guān)酶的表達(dá)量最高，添加誘導(dǎo)子往往能達(dá)到最佳刺激效果。何夢(mèng)玲等[30]分別在廣藿香懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的第0、7、9、13天時(shí)加入1 mg/L水楊酸進(jìn)行誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)在第9天（指數(shù)生長(zhǎng)初期）添加誘導(dǎo)效果最好。王瑩[31]對(duì)培養(yǎng)至第9～11天的紅豆杉細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)在指數(shù)期添加誘導(dǎo)子能迅速、顯著提高次生代謝產(chǎn)物合成的相關(guān)信號(hào)強(qiáng)度，細(xì)胞對(duì)刺激最敏感，且不同時(shí)期誘導(dǎo)產(chǎn)生效應(yīng)的機(jī)制也不同。結(jié)合2.1節(jié)和2.2節(jié)研究結(jié)果可知，牛至細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)期是多酚的合成期，因此本研究選擇細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)初、中、末期3 個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)添加ANE以促進(jìn)牛至細(xì)胞多酚的合成，圖11表明，在指數(shù)生長(zhǎng)期的不同時(shí)間點(diǎn)添加50 μg/mL ANE進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)，對(duì)細(xì)胞合成多酚的刺激效果差別很大。在細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)初期和中期添加誘導(dǎo)子，細(xì)胞總多酚的積累量顯著提高，含量分別提高了1.43 倍和1.76 倍，其中迷迭香酸含量分別提高了1.51 倍和2.27 倍，而在指數(shù)生長(zhǎng)末期添加誘導(dǎo)子基本上沒(méi)有促進(jìn)作用，ANE誘導(dǎo)組細(xì)胞總多酚含量與對(duì)照組大致相同。

綜合分析誘導(dǎo)子對(duì)牛至細(xì)胞的生長(zhǎng)和總多酚積累的影響可知，在指數(shù)生長(zhǎng)中期（第10天）添加ANE，對(duì)多酚合成的誘導(dǎo)效果最好，此時(shí)總多酚產(chǎn)量達(dá)到485.00 mg/L，提高了1.80 倍，其中迷迭香酸產(chǎn)量占70.12%，達(dá)到340.08 mg/L，是對(duì)照組的3.27 倍。因此，細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)中期為添加ANE的最佳時(shí)間點(diǎn)。

2.6 ANE持續(xù)作用時(shí)間對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和多酚積累的影響

圖12 不同AN作用時(shí)間下細(xì)胞生物量、細(xì)胞活力（a）和添加AN作用2 d后的細(xì)胞液外觀（b）Fig. 12 Biomass and viability of cells under the elicitation of ANE for different durations (a) and cells elicited by ANE for 2 days (b)

誘導(dǎo)子作用1～3 d，誘導(dǎo)組的細(xì)胞生物量和細(xì)胞活力與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異（圖12a），添加50 μg/mL ANE對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響。此外，誘導(dǎo)子作用時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物的外觀形態(tài)沒(méi)有顯著影響（圖12b），但ANE作用時(shí)間對(duì)細(xì)胞合成多酚的影響較為顯著（表1）。隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞總多酚含量和產(chǎn)量呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)作用時(shí)間為2 d時(shí)，ANE對(duì)細(xì)胞合成多酚的促進(jìn)效果最好，此時(shí)總多酚含量提高了1.62 倍，產(chǎn)量為480.38 mg/L；其中迷迭香酸含量提高了2.28 倍，產(chǎn)量達(dá)到353.25 mg/L。因此，ANE誘導(dǎo)的最佳作用時(shí)間為2 d。Zhao Jian等[32]研究也表明，如果誘導(dǎo)子處理時(shí)間太短，誘導(dǎo)效果不明顯，但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則可能會(huì)抑制次生代謝產(chǎn)物合成并造成細(xì)胞死亡。

表1 AN不同作用時(shí)間下迷迭香酸、總多酚的含量和產(chǎn)量Table 1 Contents and yields of rosmarinic acid and total polyphenols in O. vulgare cells under the elicitation of AN for different durations

表1 AN不同作用時(shí)間下迷迭香酸、總多酚的含量和產(chǎn)量Table 1 Contents and yields of rosmarinic acid and total polyphenols in O. vulgare cells under the elicitation of AN for different durations

時(shí)間/d 指標(biāo) 迷迭香酸 總多酚對(duì)照組 ANE組 對(duì)照組 ANE組作用1 含量/（mg/g） 5.82±0.12 13.19±0.95 10.03±0.26 20.82±1.19產(chǎn)量/（mg/L） 98.94±2.29 224.23±8.91 170.51±3.59 353.94±10.54 2 含量/（mg/g） 5.74±0.21 18.84±1.24 9.79±1.07 25.62±1.07產(chǎn)量/（mg/L） 107.63±2.24 353.25±10.28 183.56±2.55 480.38±10.39 3 含量/（mg/g） 5.78±0.11 16.02±1.23 11.21±1.04 23.85±1.04產(chǎn)量/（mg/L） 112.71±2.38 312.39±9.74 218.60±2.57 465.08±10.88

2.7 ANE優(yōu)化誘導(dǎo)條件的驗(yàn)證

對(duì)優(yōu)化的ANE誘導(dǎo)條件進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明，優(yōu)化誘導(dǎo)條件下（即在第10天添加50 μg/mL ANE，持續(xù)作用2 d后收獲細(xì)胞），ANE誘導(dǎo)組細(xì)胞的迷迭香酸含量和產(chǎn)量分別為對(duì)照組的3.25 倍和3.33 倍，總多酚含量和產(chǎn)量分別為對(duì)照組的2.83 倍和2.90 倍（表2），與前述實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致，表明ANE誘導(dǎo)確實(shí)能有效地促進(jìn)細(xì)胞合成多酚。孫思琳等[33]研究了硫化氫對(duì)白樺懸浮細(xì)胞多酚積累的影響，結(jié)果表明經(jīng)硫化氫處理后，細(xì)胞多酚含量為2.70 mg/g，是對(duì)照組的1.37 倍；劉冉等[34]分別以60、80 μmol/L茉莉酸甲酯和水楊酸誘導(dǎo)紅松細(xì)胞，松多酚的含量分別增加了7.23 mg/g和14.68 mg/g；與上述研究結(jié)果相比，牛至細(xì)胞經(jīng)ANE誘導(dǎo)后多酚含量和產(chǎn)量都處于更高水平，說(shuō)明ANE對(duì)牛至細(xì)胞合成多酚具有更加顯著的誘導(dǎo)效果，因此具有較好的應(yīng)用前景。

表2 優(yōu)化后的AN誘導(dǎo)作用條件下牛至懸浮細(xì)胞迷迭香酸和總多酚的含量及產(chǎn)量Table 2 Contents and yields of rosmarinic acid and total polyphenols in AN-treated O. vulgare cells under optimized conditions

表2 優(yōu)化后的AN誘導(dǎo)作用條件下牛至懸浮細(xì)胞迷迭香酸和總多酚的含量及產(chǎn)量Table 2 Contents and yields of rosmarinic acid and total polyphenols in AN-treated O. vulgare cells under optimized conditions

總多酚產(chǎn)量/（mg/L）ANE組 0.76±0.02 19.02±0.28 27.16±0.78 361.38±8.77 516.04±10.23對(duì)照組 0.74±0.03 5.86±0.12 9.61±0.19 108.41±9.11 177.79±2.97組別 生物量/（g/40 mL）迷迭香酸含量/（mg/g）總多酚含量/（mg/g）迷迭香酸產(chǎn)量/（mg/L）

3 結(jié) 論

以牛至細(xì)胞懸浮培養(yǎng)合成多酚，通過(guò)UPLC-TOFMS/MS鑒定了該細(xì)胞中原兒茶酸-O-己糖苷、紅景天苷、水楊酸-O-葡糖苷、迷迭香酸-3-O-葡糖苷、迷迭香酸和迷迭香酸甲酯6 種多酚類(lèi)物質(zhì)；50 μg/mL ANE可顯著促進(jìn)牛至細(xì)胞多酚的合成，誘導(dǎo)后總多酚的含量和產(chǎn)量分別增加了1.83 倍和1.90 倍，其中迷迭香酸含量和產(chǎn)量分別增加了2.25 倍和2.33 倍。