HIV實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)技術(shù)及效果分析

玉海玲

（廣西南寧市第四人民醫(yī)院，廣西 南寧 530023）

艾滋?。ˋIDS）又稱為獲得性免疫缺陷綜合征，是因?yàn)槿烁腥玖巳祟惷庖呷毕莶《荆℉IV）所致，嚴(yán)重危害人類身體健康。檢測(cè)HIV以利于盡早發(fā)現(xiàn)疾病，及時(shí)給予有效干預(yù)治療，切斷傳播路徑。自1981年發(fā)現(xiàn)艾滋病以來(lái)，艾滋病已從一種不可治愈的傳染性和致死性極高的疾病發(fā)展成可以控制的慢性傳染性疾病。

1 HIV抗體檢測(cè)

一般情況下被病毒侵入2-12周，就會(huì)出現(xiàn)HIV抗體，從感染HIV病毒到血清中能檢測(cè)出HIV抗體這段時(shí)間稱之為窗口期[1]。隨著醫(yī)療技術(shù)的快速發(fā)展，檢測(cè)技術(shù)也得到很大更新發(fā)展，目前診斷早期HIV感染的主要方法還是血清HIV抗體檢測(cè)。（1）初篩試驗(yàn)：臨床檢測(cè)HIV抗體的主要方法是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。第一代HIV抗體檢測(cè)試劑是于1985年誕生，目前已發(fā)展到第四代。第一代ELISA檢測(cè)試劑存在很多不足，比如：病毒抗原或病毒裂解物作為抗原包裹反應(yīng)板，樣品被不同程度的感染雜蛋白與宿主細(xì)胞，有著較高的假陽(yáng)性率，如此以來(lái)，對(duì)評(píng)估HIV感染情況造成一定影響[2-3]?；蚬こ碳夹g(shù)的發(fā)展推動(dòng)診斷HIV技術(shù)更新，采用基因工程重組或人工合成肽為包被抗原，能同時(shí)檢測(cè)HIV-1和HIV-2，特異性較第1代有了很大提高。早在上個(gè)世紀(jì)末， 第二代試劑就包括了gp36、gp42等抗原，基因有助于混合多種抗原，特性單一，對(duì)比第一代試劑，有著較高的特異性，并提高檢出時(shí)間。第三代檢測(cè)方法主要是雙抗原夾心法，可以同時(shí)檢測(cè)出IgM抗體，對(duì)比第二代試劑可以提前4-5 d檢測(cè)出HIV抗體，目前已普遍應(yīng)用于初篩HIV。第四代試劑可以同時(shí)檢測(cè)出p24抗原與HIV抗體，更加提升檢測(cè)特異度與敏感度，并提升明確窗口期比率[4]。盡管ELISA法檢測(cè)效果取得顯著上升，然而因?yàn)榧夹g(shù)原因，難以排除相互干擾的可能性，對(duì)比分析單獨(dú)抗原抗體，有著不高的靈敏性。伴隨其他檢測(cè)技術(shù)的出現(xiàn)與日臻完善，此方法可以大為提高綜合檢測(cè)HIV患者效率，這些新技術(shù)包括：時(shí)間分辨熒光免疫分析、化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)。（2）確認(rèn)試驗(yàn)：HIV初篩試驗(yàn)會(huì)存在一些假陽(yáng)性，樣本經(jīng)初篩試驗(yàn)結(jié)果呈陽(yáng)性，還應(yīng)當(dāng)實(shí)施確認(rèn)試驗(yàn)，對(duì)受檢者的感染情況進(jìn)行復(fù)查，排除誤診。①免疫印跡試驗(yàn)（WB）：此方法是確認(rèn)HIV的唯一手段，并被認(rèn)可為檢驗(yàn)HIV病毒的金標(biāo)準(zhǔn)，與ELISA法相比，WB檢測(cè)HIV不同的抗原組分，有著較高的特異度及靈敏度，然而此方法有著比較復(fù)雜的檢測(cè)流程，且檢測(cè)成本高，很多時(shí)候會(huì)因?yàn)檎`判與不按規(guī)程檢測(cè)，會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性[5-6]。應(yīng)用WB復(fù)檢HIV初篩結(jié)果，有4%-20%陽(yáng)性樣本可能存在無(wú)法確定的情況，這主要與p24結(jié)合非特異性抗體存在關(guān)聯(lián)，所以通常需要經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)師來(lái)確定檢驗(yàn)結(jié)果[7]。②細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)（IFA）：此方法就是在特異性一抗與HIV感染細(xì)胞相結(jié)合的前提下，把用熒光標(biāo)記的二抗與一抗相結(jié)合，染色呈陽(yáng)性，就可確定為真陽(yáng)性[8]。此方法操作流程便捷，對(duì)比ELISA法，有著更佳的特異性與靈敏度。但此法需要昂貴的熒光顯微鏡，需要接受良好訓(xùn)練的技術(shù)人員，觀察和解釋結(jié)果易受主觀因素的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不宜長(zhǎng)期保存，在判定檢測(cè)結(jié)果時(shí)，有一些患者樣本，因?yàn)榇嬖诜翘禺愋詿晒?，從而?duì)結(jié)果評(píng)估產(chǎn)生影響。故IFA不宜在一般的實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展和應(yīng)用。③放射免疫沉淀試驗(yàn)（RIPA）：此方法的檢測(cè)原理是當(dāng)受檢者血清中的HIV抗體結(jié)合同位素標(biāo)記的HIV蛋白，與葡萄球菌蛋白A產(chǎn)生反應(yīng)后，出現(xiàn)免疫沉淀物，利用放射自顯影技術(shù)，觀察有無(wú)同位素標(biāo)記蛋白條帶，最終確定感染切口[9-10]。此方法的特異度與靈敏度都較高，然而使用試劑流程復(fù)雜，再加上同位素放射性，對(duì)環(huán)境有污染風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)需要嚴(yán)格保護(hù)操作者，故阻礙了此方法的普遍推行。④化學(xué)發(fā)光免疫分析法。此檢測(cè)方法是遵循發(fā)光強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)待測(cè)物的含量進(jìn)行檢測(cè)，從而檢測(cè)血液中HIV，可以于抗原上標(biāo)記酶，或者于抗體上標(biāo)記發(fā)光物質(zhì)，進(jìn)行免疫反應(yīng)后，添加酶底物或氧化劑，從而對(duì)機(jī)體含量進(jìn)行檢測(cè)。此檢測(cè)方法有著較長(zhǎng)有效期限，不會(huì)造成污染，有著寬泛的線性領(lǐng)域與較高的靈敏度。⑤電化學(xué)發(fā)光免疫分析法（ECLIA）。此檢測(cè)方法是綜合各種技術(shù)而成的檢測(cè)方法，包括磁性微珠包被技術(shù)、生物素-親和素技術(shù)、電化學(xué)發(fā)光技術(shù)等，有著較高靈敏性，可以大幅度降低批內(nèi)、批間的誤差，以提供更為精準(zhǔn)的檢測(cè)結(jié)果。此方法于封閉且流動(dòng)系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，可以較好防止發(fā)生交叉污染，試劑的穩(wěn)定性高，結(jié)果更具可靠性。此方法最大特點(diǎn)為可以有效壓縮分析時(shí)間，只要20 min，比酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)速度更快。臨床研究發(fā)現(xiàn)，ECLIA還有一個(gè)特點(diǎn)是對(duì)比酶聯(lián)免疫吸附法，ECLIA檢測(cè)線性領(lǐng)域超出4個(gè)數(shù)量級(jí)，從而更好防止出現(xiàn)因前帶倒鉤所致的假陰性現(xiàn)象，此方法有著較好的穩(wěn)定性與重復(fù)性，能夠進(jìn)行批量化分析，大大壓縮診斷窗口期。然而此法有著較高成本，目前還無(wú)法推廣至基層醫(yī)院。

2 病原學(xué)檢驗(yàn)

臨床常用的HIV病原學(xué)檢驗(yàn)方法主要有以下：p24抗原檢驗(yàn)、病毒分離培養(yǎng)、核酸檢驗(yàn)。（1）病毒分離培養(yǎng)：此種檢驗(yàn)手段主要用于篩選抗病毒藥物、取得原始臨床毒種，同時(shí)可以對(duì)半數(shù)抑制藥物濃度與細(xì)胞半數(shù)感染單位進(jìn)行確定[11]。評(píng)估是否感染HIV最精準(zhǔn)的手段就是病毒分離培養(yǎng)，然而此方法因?yàn)橛绊懸蛩剌^多，故不宜運(yùn)用于常規(guī)診斷。病毒分離培養(yǎng)最普遍使用的方法就是共同培養(yǎng)HIV-1感染者的靶細(xì)胞與PBMCS[12]。然而，目前在我國(guó)HIV-1分離成功率較低。HIV-1分離會(huì)受到以下因素的影響：病程發(fā)展、靶細(xì)胞種類、靶細(xì)胞活化狀況、病毒載量、CD4 T淋巴細(xì)胞、輔助受體表達(dá)水平等，選擇共同培養(yǎng)多人的PBMCS，采用不同方法提高病毒分離成功比率，比如：剔除PBMCS中CD8。在分離當(dāng)中，病毒自身因素會(huì)起到極大作用，比如：細(xì)胞嗜性、感染力度。 研究艾滋病當(dāng)中，核心基礎(chǔ)技術(shù)就是HIV分離培養(yǎng)[13-14]。研究HIV生物學(xué)表型、篩選藥物、表型抗藥性、中和抗體親合特性等發(fā)現(xiàn)，分離培養(yǎng)有助于確診HIV感染。對(duì)影響分離培養(yǎng)的因素進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，決定能否成功分離核心就是靶細(xì)胞狀況，靶細(xì)胞的活化狀況、靈敏度都會(huì)影響病毒分離的效率[15]。挑選完全活化、新鮮的正常人PBMC，有助于提高病毒分離比率。感染者機(jī)體包含的病毒載量大小，很大程度上會(huì)對(duì)能否順利分離病毒有很大影響。此外，病毒分離還會(huì)受到共培養(yǎng)中細(xì)胞體積和濃度的影響。（2）HIV p24抗原檢測(cè)：人體感染HIV后，最先被檢測(cè)出的是HIV病毒RNA，接著才是p24抗原，最后檢測(cè)出的是HIV抗體。一般處在窗口期與HIV-1抗體不確定階段應(yīng)用p24抗原檢測(cè)，此檢測(cè)可以評(píng)估病情變化與治療效果，還可以判定嬰兒有無(wú)早期母嬰傳播的情況[16]。HIV處在急性感染階段，p24抗原就會(huì)最早出現(xiàn)，可以間接體現(xiàn)病毒復(fù)制狀況。HIV感染被確診后，需要對(duì)每位感染者的臨床與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)進(jìn)行評(píng)定，從而明確HIV感染時(shí)期。臨床采用ELISA雙抗體夾心法檢驗(yàn)，此方法的靈敏度不高，只能作為診斷的備選輔助手段，需要對(duì)感染者進(jìn)行隨訪，并且再次檢驗(yàn)確定RNA[17]。目前臨床運(yùn)用以下檢驗(yàn)手段大大提升檢測(cè)出p24蛋白的機(jī)率：超敏感酶免疫測(cè)定法（UEI）、免疫復(fù)合物裂解檢測(cè)法（ICD）、線性免疫酶測(cè)定（LIA）等[18]。（3）核酸檢驗(yàn)（NAT）：目前HIV最敏感檢驗(yàn)方法就是核酸檢驗(yàn)，其是依托聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），對(duì)RNA拷貝數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)定HIV病情進(jìn)展與變化?？截悢?shù)越高說(shuō)明病情進(jìn)展速度更快。但病毒載量檢測(cè)不用作診斷工具，因?yàn)榇嬖诩訇?yáng)性或假陰性。病毒基因組的定性檢測(cè)可作為感染的標(biāo)志。但它可以在特殊情況下補(bǔ)充或替代抗體檢測(cè)來(lái)診斷HIV感染，比如：HIV感染母親產(chǎn)下的新生兒，由于來(lái)自母體的抗體，在18個(gè)月齡前都有可能HIV抗體陽(yáng)性。對(duì)于暴露的嬰兒，至少2次核酸檢測(cè)結(jié)果陰性，才能排除HIV感染。

3 無(wú)創(chuàng)性抗體檢驗(yàn)

傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法主要是檢驗(yàn)機(jī)體的血液或血清，而這些檢驗(yàn)方式有著復(fù)雜的檢驗(yàn)流程，給受檢人員帶去很大痛苦。近些年來(lái)，醫(yī)療科技的快速發(fā)展，檢驗(yàn)HIV抗體的內(nèi)容得到擴(kuò)大，由過(guò)去僅檢查血液或血清，發(fā)展到提取受檢人員的尿液或唾液，以診斷疾病。此種檢驗(yàn)方法不會(huì)給受檢人員帶去創(chuàng)傷，極大壓縮受檢時(shí)間，盡管此方法的檢驗(yàn)效果與傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法沒(méi)有多大區(qū)別，然而很大程度上，緩解患者痛苦，此方法成為檢驗(yàn)艾滋病技術(shù)的創(chuàng)新。

4 抗體親和力檢驗(yàn)

抗體親和力檢驗(yàn)可以有效區(qū)分新近感染與過(guò)往感染，有利于流行病學(xué)調(diào)查。其工作原理就是與過(guò)往感染患者相比，新近感染者HIV抗體滴度、親和力都偏低，在適當(dāng)處理樣本后，檢驗(yàn)抗體親和力、滴度，最終鑒別為新近感染或是過(guò)往感染[19-20]。此項(xiàng)技術(shù)是借助HIV抗原抗體復(fù)合物抵抗分離試劑的強(qiáng)度鑒別新近感染與過(guò)往感染，一般選擇ELISA試劑進(jìn)行檢驗(yàn)。

5 小結(jié)

對(duì)于HIV病毒，需要給予有效檢測(cè)，并及時(shí)采取干預(yù)和治療措施，從而減緩其進(jìn)展為艾滋病的進(jìn)程，降低其危害程度。篩查艾滋病主要手段為HIV抗體檢查，而實(shí)施篩查的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量會(huì)直接影響到篩查結(jié)果。在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，應(yīng)當(dāng)不斷完善有關(guān)制度，同時(shí)努力提升操作人員的檢測(cè)專業(yè)技能，盡量防止有假陽(yáng)性或假陰性檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)。所以，臨床需要充分掌握檢驗(yàn)技術(shù)，從根本上預(yù)防與控制艾滋病。在提高有關(guān)操作人員的專業(yè)技能的前提下，人民群眾還需要有主動(dòng)測(cè)意識(shí)，二者有機(jī)結(jié)合，方可盡早確定HIV感染，并及時(shí)進(jìn)行有效干預(yù)，延緩進(jìn)展為艾滋病的進(jìn)程，提高HIV感染者的生活質(zhì)量。