鄭小凡，徐利虹，石潔，祝宏

（浙江省血液中心，浙江 杭州310052）

獻(xiàn)血者血液標(biāo)本采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測HBsAg。目前，大多數(shù)血站采用兩個不同廠家的ELISA試劑對HBsAg進(jìn)行檢測。從血液安全角度出發(fā)，針對ELISA檢測的特點，血站一般在檢測的結(jié)果中設(shè)置灰區(qū)（grey zone），以盡可能避免假陰性的發(fā)生，但是各實驗室設(shè)置灰區(qū)的標(biāo)準(zhǔn)存在差異，各機構(gòu)無統(tǒng)一的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)[1-2]。李麗平等[3]在58例HBsAg檢測灰區(qū)標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)核酸陽性9例，提出ELISA灰區(qū)范圍內(nèi)的血液存在一定的感染風(fēng)險；但是胡文佳等[4]評估第3、4代抗-HIV ELISA試劑，認(rèn)為抗-HIV檢測可以不必設(shè)置灰區(qū)。2016年我國對獻(xiàn)血者增加了HBV核酸（DNA）的檢測[5]，本文結(jié)合血液核酸檢測情況，評估設(shè)置灰區(qū)對血液安全的影響，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇2017年1月-2019年12月浙江省血液中心無償獻(xiàn)血者的血液樣本540372例。實驗儀器：STAR 8CH自動加樣儀、FAME 24/20和24/30自動酶聯(lián)免疫處理系統(tǒng) （瑞士哈曼頓公司）；酶標(biāo)比色儀Spectra（奧地利Anthos公司）；核酸檢測設(shè)備 Panther（西班牙 Grifols公司）、Cobas 201系統(tǒng)（美國羅氏診斷產(chǎn)品有限公司）。實驗試劑：HB-sAg檢測試劑分別來自英科新創(chuàng)（廈門）科技有限公司、美國Bio-Rad公司；HBV DNA檢測試劑為TaqScreen MPX v2.0核酸聯(lián)合檢測試劑（美國羅氏診斷產(chǎn)品有限公司）；Procleix Ultrio Elite血液核酸聯(lián)合檢測試劑（西班牙Grifols公司）。

1.2 方法 （1）采用ELISA法檢測HBsAg。所有標(biāo)本均采用兩個不同廠家的ELISA方法試劑[英科新創(chuàng)（廈門）科技有限公司（試劑一）、美國Bio-Rad公司（試劑二）]在自動酶聯(lián)免疫處理系統(tǒng)（型號FAME 24/20及FAME 24/30，瑞士哈曼頓公司）平臺上進(jìn)行，嚴(yán)格按照試劑和儀器說明書操作。（2）ELISA灰區(qū)設(shè)置[1-4]。參考試劑說明書中S/CO值（標(biāo)本吸光度值/Cutoff）≥1.00判定為標(biāo)本檢測反應(yīng)性，＜1.00為標(biāo)本檢測無反應(yīng)性。從血液安全角度設(shè)置灰區(qū)S/CO值為≥0.85～1.00，＞1.00判定為反應(yīng)性，＜0.85則判定為無反應(yīng)性。（3）HBV DNA核酸檢測。按照試劑說明書要求在其配套平臺上進(jìn)行操作和結(jié)果判定，每例標(biāo)本只采用其中一種核酸檢測試劑。（4）單個樣本結(jié)果判定。兩種ELISA試劑HBsAg檢測以及HBV核酸檢測均無反應(yīng)性，則判定該樣本為陰性；兩種ELISA試劑HBsAg檢測呈反應(yīng)性或無反應(yīng)性，HBV核酸檢測呈反應(yīng)性，即判定該樣本為陽性。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)本檢測情況 檢測標(biāo)本總數(shù)為540372例，試劑一反應(yīng)性標(biāo)本為1207例，其中灰區(qū)標(biāo)本為39例（3.23%）；試劑二反應(yīng)性標(biāo)本為1454例，其中灰區(qū)標(biāo)本為107例（7.36%）。試劑一和試劑二均呈反應(yīng)性966例，合計反應(yīng)性標(biāo)本1695例，灰區(qū)標(biāo)本為146例，占整個反應(yīng)性標(biāo)本的8.61%。灰區(qū)標(biāo)本核酸檢測反應(yīng)性為22例（15.07%）。試劑一檢測為灰區(qū)而試劑二檢測為反應(yīng)性的標(biāo)本有9例，其S/CO值為1.79±0.86；試劑二灰區(qū)而試劑一反應(yīng)性標(biāo)本18例，其S/CO值為3.49±2.08。以核酸檢測呈反應(yīng)性為真陽性標(biāo)準(zhǔn)，試劑一灰區(qū)標(biāo)本7例真陽性，占17.95%，試劑二灰區(qū)標(biāo)本15例真陽性，占14.02%，即不設(shè)置灰區(qū)最多可能有22個標(biāo)本發(fā)生漏檢，占0.000407‰。詳見圖 1。

2.2 灰區(qū)標(biāo)本S/CO值分布 將灰區(qū)標(biāo)本分為S/CO 值≥0.85～0.90、＞0.90～0.95、＞0.95～1.00 三組，試劑一、試劑二的灰區(qū)標(biāo)本S/CO值分布詳見表1，顯示不同S/CO值水平均存在核酸檢測反應(yīng)性標(biāo)本和/或另外一種試劑反應(yīng)性標(biāo)本。

表1 兩種檢測試劑中灰區(qū)標(biāo)本S/CO值分布情況（n）

3 討論

血站在檢測HBsAg時自動設(shè)備控制程序上需等候一定時間，因此不同檢測板的酶聯(lián)反應(yīng)溫育時間略有差異；此外，試劑本身的質(zhì)量、標(biāo)本保存時間等因素導(dǎo)致特定標(biāo)本檢測出的吸光度數(shù)值有一定的波動。按照《血站技術(shù)規(guī)程》（2019版）的規(guī)定，血站ELISA檢測試劑批內(nèi)變異系數(shù)要求在15%以內(nèi)，批間變異系數(shù)在20%以內(nèi)。為防止?jié)撛谌蹶栃詷?biāo)本的漏檢，血站通常在ELISA試劑檢測HBsAg、抗HCV、抗HIV和梅毒抗體時設(shè)置灰區(qū)[1-4]。

灰區(qū)是指在定性的ELISA方法中標(biāo)本測定值處于臨界判定值（Cut off）附近，該標(biāo)本存在潛在反應(yīng)性結(jié)果的可能?？紤]到ELISA試劑讀數(shù)的可比性，一般采用S/CO值進(jìn)行描述[1-4]，灰區(qū)設(shè)置值包括Cut off上限、下限兩種情況，但其標(biāo)準(zhǔn)不一[1-4]；張立波等[6]利用不確定度分析，認(rèn)為灰區(qū) 為臨界值下調(diào)22%。本研究從血液安全角度出發(fā)，只考慮設(shè)置Cut off下限的灰區(qū)，同時將灰區(qū)標(biāo)本按照反應(yīng)性標(biāo)本進(jìn)行判定和管理[3-4]。從結(jié)果看，灰區(qū)標(biāo)本占一定的比例，但是兩種試劑反應(yīng)性標(biāo)本的灰區(qū)占比不同，可能與試劑質(zhì)量有關(guān)。在灰區(qū)反應(yīng)性標(biāo)本中，共有22例（15.07%）標(biāo)本核酸呈反應(yīng)性，說明在灰區(qū)標(biāo)本中有較高比例的真陽性標(biāo)本，與既往的報道一致[1，7-8]。根據(jù)血站標(biāo)準(zhǔn)要求ELISA試劑批內(nèi)變異系數(shù)在15%以內(nèi)，因此本實驗將設(shè)置的灰區(qū)定為臨界值下調(diào)15%。如果不設(shè)置灰區(qū)，則至少有22例HBV DNA反應(yīng)性標(biāo)本會漏檢。當(dāng)這些血液用于臨床時，可能造成輸血傳播性疾病的發(fā)生，嚴(yán)重影響血液安全。因此，從安全角度考慮并結(jié)合現(xiàn)有實際操作因素的影響，提示需要維持現(xiàn)有臨界判定值下限的灰區(qū)。但應(yīng)注意到，部分灰區(qū)標(biāo)本在另一試劑檢測中其S/CO值較高，可能與試劑包被抗體的特性、不同亞型檢測的能力差異有關(guān)。本文報道的獻(xiàn)血者HB-sAg反應(yīng)性率為0.31%，遠(yuǎn)低于普通人群，這與獻(xiàn)血前的篩選和健康教育有關(guān)[1-4]。從實驗結(jié)果可知，兩個試劑檢測HBsAg陰性的標(biāo)本中，均存在少數(shù)HBV核酸反應(yīng)性標(biāo)本，分別為10.00%、2.25%，提示該ELISA試劑可能漏檢這些標(biāo)本，試劑質(zhì)量有待于進(jìn)一步提高。

圖1 標(biāo)本檢測結(jié)果示意圖

本文采用雙試劑同步檢測血液標(biāo)本HBsAg，結(jié)果顯示試劑一或試劑二灰區(qū)標(biāo)本在另外一種試劑或核酸檢測中絕大多數(shù)呈無反應(yīng)性，提示這部分標(biāo)本大多數(shù)為假陽性反應(yīng)。按照血站的管理要求，只要有反應(yīng)性（包括假陽性反應(yīng)）的獻(xiàn)血者均須進(jìn)行屏蔽和血液報廢，淘汰了部分符合標(biāo)準(zhǔn)的獻(xiàn)血者。因此，部分學(xué)者建議可取消灰區(qū)設(shè)置[9-10]，但灰區(qū)設(shè)置有助于檢出HBsAg真陽性標(biāo)本，提升了臨床用血的安全性。因此，本研究結(jié)果支持設(shè)置灰區(qū)，針對“存在假反應(yīng)性”的情況，可結(jié)合核酸檢測再次確認(rèn)，以便充分地利用血液資源。