黃州蘿卜早花特性調(diào)查及應(yīng)對(duì)措施研究

付 俊，彭穎冰，王林泠，李竟才，李世升

(1. 湖北省經(jīng)濟(jì)林木種質(zhì)改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，黃岡師范學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)資源學(xué)院，湖北 黃岡 438000;2,湖北省中科產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院, 湖北 黃岡 438000)

蘿卜(RaphanussativusL.)屬十字花科蘿卜屬一年或兩年生植物，別名萊菔，以肉質(zhì)根為主要食用部分。蘿卜既可鮮食，又可加工，且耐貯運(yùn)，是我國重要的根菜類蔬菜，在世界各地廣泛栽培。蘿卜屬低溫長日照類型，早春種植的蘿卜因低溫春化影響，較快開始花芽分化，出現(xiàn)先期抽薹開花的問題，也稱早花或未熟早花[1]。早期抽薹后導(dǎo)致蘿卜肉質(zhì)根生長不充分，嚴(yán)重影響其產(chǎn)量、營養(yǎng)和商品品質(zhì)等。先期抽薹已成為蘿卜生產(chǎn)中的一個(gè)重要問題[2]，因此研究蘿卜早薹機(jī)制并找到應(yīng)對(duì)策略迫在眉睫。劉可群等[3]據(jù)蘿卜生長期對(duì)低溫春化的反應(yīng)特點(diǎn)建立了蘿卜抽薹生育期的數(shù)學(xué)模型，該模型可以很好地預(yù)測蘿卜的抽薹期，從而可以用于指導(dǎo)蘿卜的栽培生產(chǎn)。王淑芬等[4]對(duì)蘿卜抽薹過程中GA3和IAA含量的測定結(jié)果表明，GA3在抽薹前夕有一個(gè)明顯的高峰，而IAA含量在花芽分化及抽薹時(shí)明顯增加。宋賢勇等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在現(xiàn)蕾抽薹過程中多種激素的平衡比單一激素對(duì)蘿卜抽薹開花的影響更大。另外有學(xué)者發(fā)現(xiàn)不同蘿卜品種對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力不同，而且不同蘿卜品種在從播種到現(xiàn)蕾、抽薹和開花所需的時(shí)間以及所需的適宜低溫處理?xiàng)l件(溫度、處理時(shí)間)等均有顯著差異[6]。汪炳良等[7]發(fā)現(xiàn)從播種至現(xiàn)蕾、抽薹和開花所需的時(shí)間不僅在品種間和播種期之間存在顯著差異，且品種與播種期之間的互作效應(yīng)也達(dá)到極顯著水平。許園園等[8]采用電子克隆與基因組步移(Genomewalking)策略分離出蘿卜Rs-FPF1基因gDNA和cDNA及啟動(dòng)子序列，進(jìn)一步證明了Rs-FPF1基因能夠促進(jìn)蘿卜提早開花。YI等[9]利用從頭組裝的轉(zhuǎn)錄組策略在蘿卜中分離了3個(gè)FLC的同源基因RsFLC1，RsFLC2和RsFLC3。這3個(gè)FLC基因在非春化的植物中高表達(dá)，且被春化作用所抑制。在擬南芥中表達(dá)這3個(gè)FLC基因可以顯著延遲開花，證明其可能起著開花抑制子的功能。王夏等[10]通過構(gòu)建蘿卜抽薹開花相關(guān)基因的cDNA文庫，獲得了大量的EST序列，并進(jìn)行了FLC、FT、LFY等關(guān)鍵基因在蘿卜EST序列中同源片段的克隆，并在蘿卜抽薹的表觀遺傳學(xué)研究方面也有了新的發(fā)現(xiàn)。宋賢勇[11]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在蘿卜未現(xiàn)蕾-現(xiàn)蕾-抽薹過程中基因組DNA甲基化水平先降低，隨著花莖的伸長又逐漸上升，在各個(gè)時(shí)期的CCGG內(nèi)側(cè)胞嘧啶完全甲基化程度均高于半甲基化的程度。

“黃州蘿卜”是湖北省黃岡市具有濃厚地方特色的常規(guī)蘿卜品種，有著悠久的種植歷史,因其有著“生食甜，熟食香，腌食脆，冬藏春食好煨湯”等優(yōu)點(diǎn)深受廣大民眾歡迎[12-13]。2008年8月，“黃州蘿卜”正式成為國家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品[12]；2011年被評(píng)為湖北省名優(yōu)蔬菜,成黃岡市蔬菜產(chǎn)業(yè)的一張名片[13]。近年來由于長期自交, 品種自身甚出現(xiàn)退化現(xiàn)象，其中就表現(xiàn)出了“黃州蘿卜”提早抽薹開花的問題?！包S州蘿卜”早花問題極大限制了其巨大社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益的發(fā)揮。因此開展“黃州蘿卜”早花特性調(diào)查及應(yīng)對(duì)措施研究尤為重要。

本文以具有濃郁地方特色的湖北黃岡地標(biāo)產(chǎn)品“黃州蘿卜”為研究對(duì)象，通過實(shí)地調(diào)查及基因表達(dá)檢測等方式力圖揭示其早苔機(jī)制并提出應(yīng)對(duì)措施。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為黃州蘿卜和春蘿卜(中蘿一號(hào)來自中國農(nóng)科院南方經(jīng)濟(jì)作物研究所梅時(shí)勇研究員提供的耐薹晚開花的蘿卜商品種)，均來自黃岡師范學(xué)院大別山生物資源庫，于2019年2月1日，2019年4月10日，2019年6月10日及9月1日分四批種植于黃岡師范學(xué)院實(shí)驗(yàn)田。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1田間調(diào)查

待田間植物抽薹后，觀察田間植株的抽薹情況，編號(hào)并作好調(diào)查結(jié)果記錄。

1.2.2總RNA的提取、質(zhì)量檢測及cDNA合成

采用TiangenRNA抽提試劑盒分別提取黃州蘿卜和春蘿卜生長點(diǎn)處組織的總RNA。取2μL的總RNA在1%的瓊脂糖凝膠上電泳，檢測其質(zhì)量和完整性。通過M-MLV Reverse Transcriptase(Invitrogen)將提取好的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.3引物序列

本實(shí)驗(yàn)一共涉及20個(gè)開花相關(guān)的基因(來自NCBI數(shù)據(jù)庫)及內(nèi)參基因Actin引物，供定量PCR檢測相關(guān)基因表達(dá)量之用，各基因引物經(jīng)Primer 3設(shè)計(jì)，各基因引物序列詳見表1，引物由金斯瑞公司合成。

1.2.4基因表達(dá)量定量檢測

以蘿卜Actin2/7 US (5’-GCATCACACTTTCTACAAC-3’) and UAS (5’-CCTGGATAGCAACAT CAT -3’)作為內(nèi)參，在ABI7500定量PCR儀中開展上述20個(gè)基因的表達(dá)量定量分析。基于2×SYBR Green定量PCR Master的定量PCR反應(yīng)體系為95 ℃變性15 s和 60 ℃延伸40 s共40個(gè)循環(huán)。

表1 表1用于定量PCR的20對(duì)引物Tab. 1 20 Pairs of Primers for quantitative PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時(shí)間批次蘿卜抽薹情況調(diào)查結(jié)果分析

據(jù)實(shí)際調(diào)查發(fā)現(xiàn)，全年四個(gè)時(shí)間批次的蘿卜種植過程中，因低溫因素(表2)導(dǎo)致第一批(2019年2月)和第二批(2019年4月)黃州蘿卜均出現(xiàn)提前抽薹情況，而剩下兩批次(2019年6月和2019年9月)均未出現(xiàn)提前抽薹情況。相比之下，春蘿卜在全年四個(gè)批次的種植過程中均未出現(xiàn)提前抽薹情況，僅在第一批次種植過程中春蘿卜有部分在肉質(zhì)根膨大完全，已經(jīng)完全成熟的較晚時(shí)期抽薹。圖1是第一批次在田間觀察到的生長早期兩組蘿卜品種的抽薹情況，圖1(a)是春蘿卜，植株整體長勢較低矮，且均未抽薹，葉片普遍較長，寬大。圖1(b)是黃州蘿卜，植株整體長勢較高，絕大部分植株都已抽薹，葉片普遍較短且細(xì)小。

表2 2019年3月至11月期間各月環(huán)境溫度統(tǒng)計(jì)表Tab. 2 Environment temperature on each month during plant period

圖1 蘿卜抽薹情況調(diào)查結(jié)果圖(a)尚未抽薹的春蘿卜;(b)已經(jīng)抽薹的黃州蘿卜Fig.1 Observation results of bolting of radish (a) radish cultivar without bolting;(b) bolted Huangzhou radish

經(jīng)對(duì)上述兩蘿卜品種在第一批次(2019年2月)種植后待肉質(zhì)根膨大早期的抽薹率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，兩個(gè)品種的抽薹率統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖2。由圖2可見兩蘿卜品種的抽薹率差異顯著，其中春蘿卜植株無一抽薹，抽薹率為0%，黃州蘿卜都已抽薹，抽薹率為100%。

圖2 兩品種抽薹率統(tǒng)計(jì)結(jié)果Fig.2 Statistical results of bolting rate of two cultivar

2.2 兩種蘿卜開花后肉質(zhì)根對(duì)比結(jié)果

圖3所示春蘿卜及黃州蘿卜在開花后肉質(zhì)根的比較情況，通過比較發(fā)現(xiàn)盡管有部分春蘿卜在晚期抽薹，春蘿卜肉質(zhì)根卻已明顯膨大，肉質(zhì)根生長飽滿且肥碩圖3(B～D)；與之相反，抽薹已久的黃州蘿卜肉質(zhì)根十分細(xì)小，肉質(zhì)根未明顯膨大圖3(A)。從植株的開花情況可以看出，黃州蘿卜的的主薹生長充分，具有一定高度，且抽薹分枝數(shù)與右側(cè)的春蘿卜相比茂密很多，右側(cè)春蘿卜基生葉較黃州蘿卜顯著增多，主薹較矮小，主薹分枝數(shù)較少。

圖3 同一時(shí)期蘿卜開花后肉質(zhì)根比較圖片(A為黃州蘿卜，B～D分別為同一時(shí)期開花情況不同的春蘿卜)Fig.3 Comparison of taproots of radish after flowering during in the same period(A.Huangzhou radish; B～D.Different flowering performance other radish cultivar during the same development stage)

2.3 定量PCR檢測結(jié)果及數(shù)據(jù)分析

對(duì)兩種蘿卜開花相關(guān)基因表達(dá)量進(jìn)行比較，從圖4中不難發(fā)現(xiàn)FLC[9, 14]、FT[15]、FR1[15]、SVPX[15]、CO[15]、AP1XM[15]、AP1XM2及SCAR1(LOC108806645)等8個(gè)基因在春蘿卜和黃州蘿卜中表達(dá)量差異十分顯著。其中FLC基因在黃州蘿卜中低表達(dá)，F(xiàn)T基因在黃州蘿卜中表達(dá)量相對(duì)春蘿卜較高，上述結(jié)果與涉及經(jīng)典成花途徑調(diào)控的FLC抑制FT基因表達(dá)，導(dǎo)致FLC和FT表達(dá)量完全相反[9，14，15]的情況完全一致。此外SVPX、FR1、CO和SCARS三個(gè)基因都是在黃州蘿卜的表達(dá)情況高于春蘿卜，僅有AP1XM兩個(gè)同源基因在黃州蘿卜中的表達(dá)量明顯低于春蘿卜。

因此，初步推測FT、FR1、SVPX、CO、SCARS這三類基因可能對(duì)黃州蘿卜抽薹過程有促進(jìn)作用，而FLC和AP1XM(RsAP1XM和RsAP1XM2)兩類基因可能對(duì)黃州蘿卜抽薹有抑制作用。

圖4 開花相關(guān)基因表達(dá)量比較Fig.4 Comparison on expression level of flowering relative genes between two cultivar in radish

本研究通過對(duì)黃州蘿卜和春蘿卜(中蘿一號(hào))兩種類型蘿卜在田間不同種植時(shí)間批次的抽薹情況和開花后肉質(zhì)根膨大情況進(jìn)行對(duì)比觀察，進(jìn)一步在上述兩蘿卜品種內(nèi)分析開花相關(guān)基因的表達(dá)量差異，研究發(fā)現(xiàn)：黃州蘿卜容易受低溫春化等因素影響導(dǎo)致提前抽薹，最終影響肉質(zhì)根形態(tài)及產(chǎn)量均差于耐抽薹的春蘿卜品種；經(jīng)基因表達(dá)量差異分析，初步找到開花相關(guān)基因的差異表達(dá)可能是黃州蘿卜容易受低溫春化等因素影響而提前抽薹開花原因。

黃州蘿卜在低溫春化作用下極易抽薹開花，其對(duì)溫度敏感性強(qiáng)于春蘿卜，阻礙其常年栽培，限制其經(jīng)濟(jì)價(jià)值的充分體現(xiàn)。FLC直接抑制成花素基因FT和FD表達(dá)，從而防止植物在過冬前或越冬時(shí)開花。冬季低溫通過“春化路徑”抑制FLC基因表達(dá)。來年春季，隨著溫度升高以及日照變長，“光周期路徑” 激活FT表達(dá)，F(xiàn)T和FD形成異源蛋白二聚體直接調(diào)控花發(fā)育基因，從而促進(jìn)開花[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)黃州蘿卜中在低溫條件下FLC基因表達(dá)量極低，本應(yīng)被抑制的FT基因反而大量表達(dá)，該基因表達(dá)的差異是黃州蘿卜不耐抽薹而表現(xiàn)提前開花的主要原因。

因此，為避免因黃州蘿卜提前開花導(dǎo)致肉質(zhì)根不能正常膨大形成而影響產(chǎn)量，建議可一方面可通過基因改造[18]，結(jié)合現(xiàn)在基因編輯技術(shù)抑制FT等促進(jìn)黃州蘿卜提前開花的基因表達(dá)，徹底改良黃州蘿卜不耐抽薹而易早花的缺點(diǎn)；另一方面則是結(jié)合設(shè)施栽培技術(shù)幫助黃州蘿卜在實(shí)際栽培過程中避免低溫誘導(dǎo)而提前開花。