高占爭(zhēng)，張文學(xué)，吳正云

（1.四川大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，四川成都 610065；2.四川水井坊股份有限公司，四川成都 610037）

1 白酒微生態(tài)學(xué)的簡(jiǎn)介

微生物生態(tài)學(xué)認(rèn)為，微生態(tài)系統(tǒng)是在一定的時(shí)間空間內(nèi)微生物種群之間，以及它們與生境之間，不斷地進(jìn)行物質(zhì)循環(huán)、能量流動(dòng)和信息傳遞而形成的統(tǒng)一整體。而中國(guó)白酒釀造系統(tǒng)中的大曲、窖泥、糟醅及釀造環(huán)境都是一個(gè)微生態(tài)系統(tǒng)，而這些小的微生態(tài)系統(tǒng)又構(gòu)成了白酒釀造微生態(tài)系統(tǒng)。由此，國(guó)內(nèi)專家學(xué)者開始以微生態(tài)學(xué)的觀點(diǎn)來研究白酒釀造微生態(tài)系統(tǒng)。四川大學(xué)的張文學(xué)教授等[1-2]結(jié)合微生態(tài)學(xué)和白酒釀造的特點(diǎn)，把白酒釀造微生態(tài)學(xué)定義為：研究白酒釀造過程中微生物菌群與微觀釀造環(huán)境之間相互關(guān)系的科學(xué)；研究?jī)?nèi)容包括白酒制曲、窖池、酒醅和發(fā)酵環(huán)境中的微生物菌群以及微觀環(huán)境之間的相互關(guān)系。白酒釀造微生態(tài)的概念提出后，很快得到了行業(yè)內(nèi)專家學(xué)者的認(rèn)同，同時(shí)白酒釀造微生態(tài)學(xué)也得到了快速發(fā)展。根據(jù)SCI 收錄的關(guān)于白酒微生物多樣性的文章可以明顯看出這種趨勢(shì)，2007年到2010 年每年只有一篇文章，2011 年到2013 年每年有4～6 篇文章，而2014 年有14 篇，2015 年有12 篇，2016 年1～6 月已有6 篇文章。其中，早期的論文多數(shù)都是張文學(xué)教授團(tuán)隊(duì)的研究。除了白酒領(lǐng)域之外，張文學(xué)教授團(tuán)隊(duì)還把釀造微生態(tài)的研究引領(lǐng)到泡菜等其他發(fā)酵食品領(lǐng)域，促進(jìn)了中國(guó)各類特色釀造發(fā)酵食品微生態(tài)學(xué)的發(fā)展。白酒釀造微生態(tài)學(xué)的快速發(fā)展離不開研究技術(shù)的支撐，特別是新的分子生物學(xué)技術(shù)層出不窮，有力地促進(jìn)了白酒釀造微生態(tài)學(xué)的快速發(fā)展，在上面這些研究白酒釀造微生態(tài)的文章中，多數(shù)使用了分子生物學(xué)技術(shù)。因此有必要了解釀造微生態(tài)學(xué)研究技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)、應(yīng)用現(xiàn)狀和發(fā)展?fàn)顩r，以便促進(jìn)白酒釀造微生態(tài)學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展，更有利于認(rèn)識(shí)白酒釀造規(guī)律，促進(jìn)白酒生產(chǎn)技術(shù)的改進(jìn)。

2 中國(guó)古代及近現(xiàn)代對(duì)釀酒微生態(tài)的認(rèn)識(shí)

中國(guó)的釀酒文化源遠(yuǎn)流長(zhǎng)，在古代人們認(rèn)為釀酒是神秘的現(xiàn)象，對(duì)釀酒微生物幾乎沒有科學(xué)的認(rèn)識(shí)，但我國(guó)人民在長(zhǎng)期的生產(chǎn)實(shí)踐中不斷地摸索、探索，在不知不覺中運(yùn)用生態(tài)學(xué)的原理及方法進(jìn)行釀酒。例如，我們自古以來就非常重視釀酒地理及生態(tài)環(huán)境，例如必須考慮釀酒當(dāng)?shù)氐臍夂?、土壤、水質(zhì)等因素。

用曲釀酒，是我國(guó)祖先在釀酒科技史上的一大發(fā)明，是中國(guó)釀酒工藝獨(dú)一無(wú)二的特點(diǎn)。曲藥釀酒技術(shù)就體現(xiàn)了人們對(duì)釀酒微生態(tài)的一些初步認(rèn)識(shí)。在《齊民要術(shù)·造神曲并酒》[3]中記載：“造酒法：……一斗曲用水一斗五升，十月桑落，初凍，則收水釀?wù)邽樯蠒r(shí)春酒；正月晦日收水，為中時(shí)春酒；初凍后，盡年暮，水脈既定，收取則用。其春酒及余月，皆須煮水為五沸湯，待冷，浸曲。不然則動(dòng)。”這段話體現(xiàn)的是中國(guó)黃酒傳統(tǒng)釀造的技術(shù)措施之一，巧妙地利用了氣溫的變化和熱水殺菌。冬季氣溫低，雜菌少，燒水也可以殺滅雜菌，這都有利于釀酒功能微生物群落的生長(zhǎng)繁殖，有利于釀造優(yōu)質(zhì)酒。對(duì)微生態(tài)的認(rèn)識(shí)在制曲方面也有體現(xiàn)，例如選擇制曲原料不必墨守陳規(guī)，可以因地制宜，制曲季節(jié)要適時(shí)，踩曲松緊度要適度，曲坯包裹要嚴(yán)密、要注意通風(fēng)保溫等等。這都是為了富集有益微生物群落，盡量減少雜菌。

3 白酒釀造微生態(tài)研究的近現(xiàn)代技術(shù)

中國(guó)雖然釀酒歷史悠久，在早期對(duì)釀造微生態(tài)也有一些初步認(rèn)識(shí)，但是對(duì)釀造微生態(tài)真正的認(rèn)識(shí)和利用還是從近代科學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)開始的。

隨著荷蘭人Leeuwenhoek 發(fā)明制造出顯微鏡，直接觀察到微生物的形態(tài)，人們對(duì)微生物首次有了直接的認(rèn)識(shí)。1910 年又一里程碑技術(shù)——微生物平板純培養(yǎng)技術(shù)的出現(xiàn)，把微生物技術(shù)推向一個(gè)新高度，有力地促進(jìn)了微生物學(xué)的發(fā)展[1]。后來抗生素的出現(xiàn)、無(wú)菌動(dòng)物飼養(yǎng)和厭氧技術(shù)的發(fā)展促使微生物學(xué)和相關(guān)技術(shù)的快速發(fā)展，也促使微生態(tài)學(xué)作為生態(tài)學(xué)的一個(gè)學(xué)科分支出現(xiàn)。

這一時(shí)期主要應(yīng)用顯微鏡和微生物平板純培養(yǎng)法研究釀酒微生物。微生物平板純培養(yǎng)法[4]是根據(jù)特定的，具有明顯特點(diǎn)的微生物選擇相應(yīng)的培養(yǎng)基，分離進(jìn)行純培養(yǎng)，對(duì)純種微生物通過顯微鏡觀察形態(tài)，然后再根據(jù)生理生化特征等方面進(jìn)行分析鑒定。這是傳統(tǒng)的微生物多樣性研究方法，只適用于可培養(yǎng)微生物，微生物態(tài)中還有絕大部分的未培養(yǎng)微生物，因此無(wú)法真正了解微生態(tài)的整體。

我國(guó)對(duì)釀酒微生態(tài)的認(rèn)識(shí)也是隨著這些技術(shù)的發(fā)展逐步深入的。1931 年，我國(guó)黃海化學(xué)工業(yè)研究社查明了各地高粱曲中的微生物[3]，首次分離出多種絲狀真菌和酵母，主要有華根霉、東京根霉、李克犁頭霉、魯氏酵母、釀酒酵母等。這一研究促進(jìn)了人們對(duì)大曲微生物的科學(xué)認(rèn)識(shí)和利用。解放后我國(guó)加大了對(duì)白酒的研究力度，分離出很多純種微生物，例如大曲中的紅曲霉、窖泥中的己酸菌等[5]。這一時(shí)期主要是利用微生物純培養(yǎng)技術(shù)分離出釀酒主要菌種，然后再研究利用這些菌種提高原料利用率、岀酒率等。中國(guó)白酒釀造環(huán)境中微生物種類豐富，種群復(fù)雜，傳統(tǒng)的平板純培養(yǎng)技術(shù)無(wú)法分離和分析更多的微生物，更無(wú)法研究釀酒微生物菌群之間的相互作用。所以這一時(shí)期注重的是單個(gè)微生物的分離、培養(yǎng)和應(yīng)用，雖然對(duì)釀酒微生物和釀酒環(huán)境有了更深入的認(rèn)識(shí)，但受技術(shù)條件限制無(wú)法充分認(rèn)識(shí)和利用釀酒微生態(tài)。

4 近年白酒微生態(tài)學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用

近年來分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)的快速發(fā)展有力地促進(jìn)了白酒微生態(tài)學(xué)和研究技術(shù)的發(fā)展。目前白酒微生態(tài)學(xué)研究中除傳統(tǒng)的微生物分析方法外，還用到一些生態(tài)學(xué)研究常用技術(shù)，例如磷脂脂肪酸分析方法（PLFA），而用到的最主要的技術(shù)為分子生物學(xué)技術(shù)，如基于PCR 的指紋圖譜分析、基因測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育分析、克隆文庫(kù)、熒光原位雜交技術(shù)（FISH）、宏基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)等。

4.1 基于PCR 的指紋圖譜分析技術(shù)

現(xiàn)在白酒釀造微生態(tài)研究中最常用的技術(shù)就是基于PCR 的指紋圖譜分析技術(shù)，主要有DGGE（變性梯度凝膠電泳，Denaturing gradient gel electrophoresis）、SSCP（單鏈構(gòu)象多態(tài)性，Single strand conformation polymorphism）、RFLP（限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性，Restriction fragment length polymorphism）等。在這些技術(shù)中使用最多的是PCR-DGGE 技術(shù)，此外DGGE 分析技術(shù)還可以與實(shí)時(shí)定量PCR（quantitative real-time PCR）、DNA 芯片、巢式PCR（Nested PCR）等技術(shù)相結(jié)合分析白酒釀造微生物的多樣性。

PCR-DGGE 技術(shù)[6-7]首先分離純化環(huán)境樣品DNA，再用通用引物PCR 擴(kuò)增核糖體核糖核酸的部分序列，原核生物一般是16S rRNA/16S rDNA 的V3、V4、V5 區(qū)，真核生物18S rRNA/18S rDNA 的V4 區(qū)以及ITS 序列，然后進(jìn)行DGGE 分析。再通過DGGE 優(yōu)勢(shì)條帶的切膠回收、測(cè)序、鑒定，獲取微生物種群結(jié)構(gòu)信息。

在白酒釀造微生態(tài)的研究中，以PCR-DGGE技術(shù)為主并結(jié)合其他技術(shù)在窖泥、糟醅、大曲的微生物多樣性研究中均有廣泛應(yīng)用。Liang 等[8]為了區(qū)分成熟窖泥和退化窖泥，用PCR-DGGE 和qPCR技術(shù)比較分析不同地區(qū)中國(guó)濃香型白酒成熟窖泥與退化窖泥中細(xì)菌群落。此作者還用同樣的技術(shù)分析了新窖泥和成熟窖泥的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)[9]。Liu等[10]用DGGE 技術(shù)分析了中國(guó)濃香型白酒窖泥（窖齡分別為1 年、50 年、100 年、400 年）中梭菌I 的多樣性。Deng 等[11]用PCR-DGGE 方法分析不同窖齡窖泥微生物群落。Ding 等[12]用PCR-DGGE 與FISH 結(jié)合分析人工窖泥中的古細(xì)菌和真細(xì)菌群落特征。Wang 等[13-14]從不同大曲中提取DNA 用于PCR 擴(kuò)增，使用16S rRNA,26S rRNA 和18S rRNA的通用引物，擴(kuò)增后分別用DGGE 方法分析，研究了清香型大曲的微生物多樣性。Xiong 等[15]用PCR-DGGE 方法系統(tǒng)研究了3 種大曲（機(jī)制大曲、手工、混合制曲）中細(xì)菌、芽孢桿菌、真菌、酵母群落。Du 等[16]用PCR 擴(kuò)增放線菌rDNA，然后用DGGE 方法分析了大曲培養(yǎng)過程中鏈霉菌的生態(tài)情況，結(jié)果表明，大曲培養(yǎng)過程中鏈霉菌廣泛存在。

之所以基于PCR 的DGGE 應(yīng)用這么廣泛，是因?yàn)槠溆型怀鰞?yōu)點(diǎn)[17-18]：可以快速、簡(jiǎn)便通過DGGE 圖譜來檢測(cè)和鑒定微生物種類。但是還有一些技術(shù)缺陷，需要進(jìn)一步改進(jìn)[17-18]，主要缺陷有：①檢出信息量低，難以建立系統(tǒng)發(fā)育樹；② 很難檢出微生物總量低的微生物(＜1%)；③有共遷移現(xiàn)象，而且影響結(jié)果的因素比較多，例如DNA 提取分離效果、凝膠濃度、PCR 擴(kuò)增效率、電泳時(shí)間等。

針對(duì)PCR-DGGE 的一些弱點(diǎn)，也有改進(jìn)的方法，例如NestedPCR-DGGE[17]，通過特殊引物的兩次擴(kuò)增，既增加了檢測(cè)的靈敏性，又增加了檢測(cè)的可靠性。Wang 等[19]從3 個(gè)發(fā)酵糟醅和12 個(gè)環(huán)境因子中提取總DNA，包括糟醅、大曲、窖泥、土壤、空氣、高粱，然后擴(kuò)增16S 和18S rRNA 基因，用Nested PCR-DGGE 分析典型微生物的分布。同時(shí)用16S rRNA 和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）的qPCR 擴(kuò)增評(píng)估樣品中微生物豐度。Ding 等[20]用NestedPCR-DGGE 方法調(diào)查和比較了濃香型白酒窖池窖壁和窖底窖泥中古細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)。Zhang 等[21]用NestedPCR-DGGE 分析大曲微生物群落特征。

除了使用PCR-DGGE 技術(shù)，還有一些研究者利用基于PCR 指紋圖譜分析的其他技術(shù)，例如Chen 等[22]優(yōu)化了PCR-SSCP 分析條件，然后用于濃香型白酒發(fā)酵微生物多樣性分析。Hai 等[23]利用PCR-SSCP研究河套酒大曲細(xì)菌群落特征。Liu等[24]用實(shí)時(shí)定量PCR 研究了中國(guó)濃香型白酒窖泥中Syntrophomonadaceae 類菌的發(fā)展現(xiàn)狀，研究結(jié)果表明，此方法快速、靈活、準(zhǔn)確，針對(duì)性強(qiáng)、靈敏度高。定量結(jié)果可以進(jìn)一步了解Syntrophomonadaceae 在窖泥中不同時(shí)間和空間的分布。Wei 等[25]用熒光實(shí)時(shí)PCR 定量不同窖齡窖泥（3 年、13 年、25年）中的微生物的數(shù)量。

4.2 基因測(cè)序分析及克隆文庫(kù)技術(shù)

DNA 序列分析方法是利用已有的許多功能基因及專門的rDNA 序列數(shù)據(jù)庫(kù)軟件，進(jìn)行序列比較，揭示更高水平的多態(tài)性。大多數(shù)DNA 多樣性的研究以核糖體RNA（rRNA）或其編碼基因rDNA為對(duì)象，利用其中的16S rRNA/rDNA 或18S rRNA/rDNA 序列信息的保守區(qū)和變異區(qū)，區(qū)分微生物種差異[1，26，27]。

在白酒的微生態(tài)研究中也主要是利用16S rRNA/rDNA 或18S rRNA/rDNA 序列信息進(jìn)行微生物多樣性研究。例如王濤等[28]基于16S rRNA 的基因序列分析研究了宜賓地區(qū)濃香型大曲酒釀造過程中可培養(yǎng)細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育多樣性。Zhang 等[29]用DGGE 方法和18S rRNA 基因分析方法研究分析了中國(guó)濃香型白酒釀造過程中糟醅的真菌群落。Chen 等[22]用PCR 擴(kuò)增的片段為16S rDNA 的V3 區(qū)研究發(fā)酵糟醅的微生物群落。Liang 等[30]用基于16S rRNA 基因的V3 區(qū)鑒定大曲中細(xì)菌。Zheng等[31]分析16S rDNA 的V9 區(qū)，研究大曲制曲過程中芽孢桿菌群落。Deng 等[11]分析16S rDNA 的v6 到V8 區(qū)，研究不同時(shí)期濃香型酒窖池窖泥的微生物群落。除了以上對(duì)16S rRNA/rDNA 或18S rRNA/rDNA 序列分析研究，還有專家學(xué)者利用其他的一些基因序列進(jìn)行微生物多樣性的研究。Sun 等[32]分析26S rDNA D1/D2 分區(qū)的序列，對(duì)茅臺(tái)酒不同釀造階段的酵母進(jìn)行鑒定。Xiang 等[33-34]基于SSU rRNA 免培養(yǎng)技術(shù)，研究了中國(guó)濃香型酒釀造過程中發(fā)酵糟微生物群落的演替。

克隆文庫(kù)技術(shù)是以PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)，并與基因測(cè)序技術(shù)相結(jié)合，經(jīng)常用于環(huán)境微生態(tài)的研究。其基本過程[35-37]是先提取樣本DNA，然后用通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物、構(gòu)建克隆文庫(kù)、測(cè)序分析、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，最后推測(cè)復(fù)雜環(huán)境微生物群落的分類學(xué)地位。此技術(shù)在白酒微生態(tài)研究中也有較多使用。例如陳玲等[35]用16S rDNA 克隆文庫(kù)法和高通量測(cè)序法，分析了濃香型白酒大曲中細(xì)菌微生物群落的組成，并通過豐度和多樣性分析，比較了兩種方法在研究大曲樣品細(xì)菌多樣性方面的適用性。Zheng 等[38]利用16S rRNA 和26S rRNA 基因克隆文庫(kù)分析不同大曲中微生物群落特征。王濤等[39]利用16S rRNA 基因克隆文庫(kù)，分析了濃香型白酒窖泥、出窖糟醅的細(xì)菌區(qū)系的相似性。王明躍等[40]用PCR-ARDRA和16S rRNA 基因克隆測(cè)序技術(shù)，對(duì)四川和安徽產(chǎn)區(qū)窖泥細(xì)菌和古菌進(jìn)行了研究?？寺∥膸?kù)技術(shù)，技術(shù)成熟，可操作性好。但其操作步驟較為繁瑣，工作量較大，反映總體微生物信息有限，并有可能在一定程度上高估物種豐度及低估微生物群落大小和多樣性。但如果主要以優(yōu)勢(shì)菌群的認(rèn)識(shí)研究為主，不看重極低豐度菌群的存在，不失為一種很好的釀造微生態(tài)學(xué)研究方法。

4.3 磷脂脂肪酸分析方法（PLFA）及熒光原位雜交技術(shù)（FISH）

磷脂脂肪酸分析方法[41-42]是基于細(xì)胞中磷脂類化合物相對(duì)穩(wěn)定作為微生物生物量指標(biāo)，磷脂類化合物中脂肪酸組成特異性和多態(tài)性能反映環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性。此方法能夠依靠脂肪酸譜圖定量描述整個(gè)微生物群落,是一種快捷、可靠的檢測(cè)方法，但它不能在菌種和菌株的水平鑒別出微生物的種類。此外，微生物在不同的生長(zhǎng)時(shí)期以及環(huán)境壓力下的磷脂脂肪酸的含量會(huì)有所變化，也會(huì)給監(jiān)測(cè)帶來困難。

磷脂脂肪酸分析方法是生態(tài)學(xué)研究中的一種常用方法，近年在白酒微生態(tài)研究中也有較多應(yīng)用。Zhang 等[43]用PLFA 方法分析3 種汾酒大曲的微生物群落，此方法可潛在用于各種曲的代表性生物標(biāo)記。Zheng 等[44]利用非培養(yǎng)技術(shù)（PLFA、DGGE）對(duì)兩個(gè)不同廠（劍南春和豐谷）糟醅的不同糟層（上、中、下層）細(xì)菌群落的空間分布進(jìn)行研究。Wu 等[45]用PLFA 方法分析大曲微生物群落特征。Zhao 等[46]用磷脂脂肪酸分析方法研究了不同窖齡窖池窖泥的菌群落結(jié)構(gòu)。

熒光原位雜交技術(shù)[47-48]是dsDNA 變性后和帶有互補(bǔ)序列的同源單鏈褪火配對(duì)形成雙鏈DNA 或DNA/RNA 異質(zhì)雙鏈結(jié)構(gòu)的過程，利用熒光標(biāo)記的探針探測(cè)同源核酸序列。熒光原位雜交技術(shù)能夠同時(shí)對(duì)微生物進(jìn)行定性、定量和其群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，操作容易、安全、檢測(cè)迅速，己廣泛用于研究環(huán)境微生態(tài)和食品微生態(tài)。目前有人也開始用此技術(shù)研究白酒微生態(tài)，例如吳冬梅等[49]利用熒光原位雜交(FISH)技術(shù)，研究了窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)特征。Ding 等[12]結(jié)合PCR-DGGE 和熒光原位雜交(FISH)技術(shù)研究了濃香白酒窖池古生菌和真菌群落結(jié)構(gòu)特征。

5 白酒釀造微生態(tài)研究的新技術(shù)

分子生物學(xué)快速發(fā)展，新技術(shù)不斷涌現(xiàn)，例如新一代測(cè)序技術(shù)（高通量測(cè)序技術(shù)）、基因芯片技術(shù)、宏基因組學(xué)技術(shù)、生物信息學(xué)技術(shù)、代謝組學(xué)技術(shù)、蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)等。宏基因組學(xué)是以新一代測(cè)序和基因芯片技術(shù)為基礎(chǔ)的，已經(jīng)是比較成熟的組學(xué)技術(shù)，在環(huán)境微生物學(xué)研究中已有較廣泛應(yīng)用，在白酒釀造微生態(tài)學(xué)研究中也開始使用。其他的一些新技術(shù)雖然不夠成熟，但隨著這些技術(shù)的不斷完善，將來肯定會(huì)成為白酒釀造微生態(tài)學(xué)研究中的重要常用技術(shù)。因此進(jìn)一步了解這些新技術(shù)的發(fā)展?fàn)顩r，對(duì)白酒釀造微生態(tài)將來的發(fā)展非常重要。

宏基因組學(xué)[50]是指不依賴分離培養(yǎng)技術(shù)，直接分析菌群中微生物基因組序列和功能的方法。鑒于自然環(huán)境中約有99%的至今尚不能培養(yǎng)且一無(wú)所知的微生物存在，利用宏基因組學(xué)技術(shù)可以獲得比培養(yǎng)方法多得多的遺傳信息，為研究非培養(yǎng)微生物提供了有效手段。宏基因組學(xué)技術(shù)的基本步驟[51-52]是首先直接抽提環(huán)境微生物DNA，然后將DNA 片段克隆、轉(zhuǎn)化，構(gòu)建宏基因文庫(kù)。利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行隨機(jī)DNA 序列測(cè)定，研究微生物群落組成，尋找特定的功能基因或表達(dá)的特殊表型。近年來，宏基因組學(xué)已逐漸成為微生物多樣性研究的重要工具之一。

生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及新一代測(cè)序技術(shù)有利地促進(jìn)了宏基因組學(xué)技術(shù)的發(fā)展和完善。被稱為深度測(cè)序技術(shù)(deep sequencing)的新一代測(cè)序技術(shù)（next generation sequencing，NGS）[53-56]，包括第二代及第三代測(cè)序技術(shù)，并且開始出現(xiàn)了第四代測(cè)序技術(shù)。目前第二代測(cè)序技術(shù)應(yīng)用較為成熟，該技術(shù)基于聚合反應(yīng)和連接反應(yīng)，同時(shí)對(duì)大量DNA 分子平行測(cè)序，代表性平臺(tái)有454 焦磷酸測(cè)序系統(tǒng)（Roche）、SOL iD 平臺(tái)（Life Technologies）、Solexa 平臺(tái)（Illumina）。第三代測(cè)序技術(shù)克服了二代技術(shù)的讀長(zhǎng)序列短、需要模板擴(kuò)增步驟等缺點(diǎn)，以單分子測(cè)序和讀長(zhǎng)序列長(zhǎng)為特點(diǎn)，目前已開始有一些應(yīng)用。第四代測(cè)序技術(shù)以納米孔測(cè)序?yàn)榇恚捎梦锢矸椒ㄖ苯幼x出其堿基序列，目前此技術(shù)尚處于實(shí)驗(yàn)階段，無(wú)實(shí)際應(yīng)用。在白酒釀造微生態(tài)研究中，應(yīng)用最多是第二代測(cè)序技術(shù)中的焦磷酸測(cè)序，例如Zhang 等[57]利用焦磷酸測(cè)序分析清香型大曲的細(xì)菌群落，Tao 等[58]利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)研究了不同窖齡窖泥的原核微生物群落結(jié)構(gòu)，并研究了窖泥中微生物的群落和多樣性，Li 等[59]用焦磷酸測(cè)序方法對(duì)細(xì)菌16S rRNA 和真菌內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)進(jìn)行了測(cè)序，研究大曲的微生物多樣性。

隨著測(cè)序技術(shù)不斷的發(fā)展，測(cè)序數(shù)據(jù)通量呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)，生物信息學(xué)變得越來越重要，高通量測(cè)序數(shù)據(jù)的處理算法和生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)成為宏基因組學(xué)發(fā)展的重要基礎(chǔ)，目前也是宏基因組學(xué)發(fā)展的一個(gè)技術(shù)瓶頸[60]。生物信息學(xué)是隨著各種生物信息學(xué)軟件的開發(fā)而快速發(fā)展，這些軟件的功能主要有基礎(chǔ)分析（Cluster W、BioEdit 等）、親緣關(guān)系分析（Mage、PAUP 等）、指紋圖譜分析（Quantity One、T-Ali 等）、群落結(jié)構(gòu)分析（UniFrac、Fast-UnFrac 等）、多樣性指數(shù)分析（DOTUR 等）、序列提交（Sequin、Sequence Read Archive 等）[61-63]；目前高通量測(cè)序發(fā)展較快，高通量數(shù)據(jù)/綜合分析軟件主要有Mothur、Qiime、RDP、Pipeline 等；基因序列分析的核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)主要有GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)（美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心），EMBL 數(shù)據(jù)庫(kù)（歐洲生物信息學(xué)研究所）和DDBJ 數(shù)據(jù)庫(kù)（日本國(guó)立遺傳學(xué)研究所）[64]。這些軟件和數(shù)據(jù)庫(kù)是研究微生物生態(tài)的重要基礎(chǔ)，在海洋、土壤、人體、食品等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。

蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)在對(duì)微生物生態(tài)的研究中也有應(yīng)用。蛋白質(zhì)組學(xué)的一種新技術(shù)——宏蛋白質(zhì)組學(xué)[65]：在特定的時(shí)間對(duì)微生物群落所有的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析研究的技術(shù)，在極端環(huán)境微生物的功能基因表達(dá)、特殊功能蛋白質(zhì)開發(fā)以及生態(tài)元素循環(huán)等方面有一些應(yīng)用。在白酒微生態(tài)研究中應(yīng)用較少，但已有人利用此技術(shù)對(duì)窖泥微生態(tài)進(jìn)行研究，例如Zheng 等[66]首先從30 年和300 年的窖泥微生物中提取總蛋白質(zhì)和DNA，然后利用基于iTRAQ 蛋白組學(xué)技術(shù)研究微生物表達(dá)形成香味的功能蛋白質(zhì)。

現(xiàn)在代謝組學(xué)在生態(tài)學(xué)領(lǐng)域也開始有越來越多的應(yīng)用，主要應(yīng)用在土壤、海洋等傳統(tǒng)生態(tài)學(xué)領(lǐng)域，與蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和基因組學(xué)等技術(shù)的結(jié)合應(yīng)用也日益密切。代謝組學(xué)[67-68]是通過考察生物體系受到刺激或擾動(dòng)前后代謝產(chǎn)物圖譜及其動(dòng)態(tài)變化來研究生物體系的代謝網(wǎng)絡(luò)的一種技術(shù)，主要研究相對(duì)分子質(zhì)量1000 以下的內(nèi)源性小分子。近年來代謝組學(xué)與生態(tài)學(xué)相結(jié)合出現(xiàn)了一門新興學(xué)科——生態(tài)代謝組學(xué)[69]，其定義為對(duì)某一生物系統(tǒng)中產(chǎn)生的或已存在的代謝物組的研究的建立與發(fā)展。

各學(xué)科技術(shù)的交叉結(jié)合使用為生態(tài)學(xué)研究提供了有力的工具，我們可以利用宏基因組學(xué)、宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)、宏蛋白質(zhì)組學(xué)及代謝組學(xué)對(duì)釀酒微生物生態(tài)在不同層面進(jìn)行研究，包括窖泥、糟醅、大曲的微生物群落結(jié)構(gòu)、多樣性、以及微生物繁殖代謝與環(huán)境因子的關(guān)系、特殊功能性微生物及其產(chǎn)物、篩選分析未知微生物等。白酒釀造中微生物非常復(fù)雜，將來利用這些技術(shù)進(jìn)一步揭示白酒微生物釀造規(guī)律，進(jìn)而指導(dǎo)白酒生產(chǎn)，既可以促進(jìn)生產(chǎn)更多優(yōu)質(zhì)白酒，又可以弘揚(yáng)中國(guó)傳統(tǒng)文化。