色氨酸合成酶基因工程菌的研究

于巧玲，徐禮生，張興桃，李婷婷，葉 靜，孫，于 婷

（宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽宿州 234000）

0 引言

哺乳動物體內(nèi)不存在色氨酸合成途徑，人和動物必須從外界獲取生長所需要的色氨酸，而色氨酸合成酶能夠高效催化吲哚與L-絲氨酸反應(yīng)，合成L-色氨酸。因此，色氨酸合成酶發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，直接影響著色氨酸的產(chǎn)量。色氨酸作為第二必需氨基酸，參與調(diào)解人和動物的生長發(fā)育，缺乏色氨酸將會降低人體消化功能和體液免疫功能。而對于結(jié)核桿菌，色氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株很難在巨噬細胞中繁殖，甚至不能存活。因此，色氨酸被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和飼料添加等領(lǐng)域，色氨酸的功效使得色氨酸合成酶成為研究結(jié)核藥物的核心目標(biāo)。20世紀(jì)50年代，固定化技術(shù)受到關(guān)注和研究，隨后高速發(fā)展，研究者把酶固定成球體，顯著改善了游離菌存在的不足。近年來，隨著對固定化技術(shù)更深層次的研究，酶的機械韌度和穩(wěn)定度得到了提高。從色氨酸合成酶的性質(zhì)、作用機理、酶固定化及應(yīng)用等4個方面進行分析，以期為色氨酸合成酶工業(yè)化應(yīng)用提供一定理論基礎(chǔ)。

1 色氨酸合成酶的性質(zhì)

色氨酸合成酶（TSase） 基因總長807 bp，可編碼269個氨基酸[1]。色氨酸合成酶呈現(xiàn)出α2β2亞基結(jié)構(gòu)，其中α和β亞基能夠獨立編碼，單獨催化反應(yīng)，也可以相互激活調(diào)節(jié)催化反應(yīng)能力[2]。吲哚在α亞基活性部位產(chǎn)生，在β亞基活性中心發(fā)生反應(yīng)，兩亞基間的特殊通道作為“橋梁”協(xié)助反應(yīng)進行[3]，因此色氨酸合成酶成為探索小分子的移動運送通道、分子運送中的能量轉(zhuǎn)移路徑和活性部位間的相互作用、信號傳遞通道以亞基間互相影響的典范[4]。利用生物技術(shù)，克隆色氨酸合成酶基因trpBA，構(gòu)建表達載體pET-trpBA，色氨酸產(chǎn)量達9.8 mg/L，提高了4.9倍[5]。采用 PCR擴增抗反饋抑制的serA和trpBA基因，將2個基因以多種方式串聯(lián)在pET22 b（+）上，在各自啟動子作用下，2種蛋白酶共表達，檢測并篩選出TSase和PGDH酶活性較高的菌株ABA-I，搖床發(fā)酵發(fā)現(xiàn)，該菌株色氨酸產(chǎn)量增加了20.2倍[6]。采用雙菌酶法，將來自不同菌的2種酶結(jié)合，利用酶的優(yōu)勢互補，共同催化吲哚和DL-絲氨酸，提高底物轉(zhuǎn)化率。另外，利用色氨酸合成酶高產(chǎn)菌株，間歇式添加吲哚，同樣能夠達到高產(chǎn)色氨酸的目的?？寺?、表達和純化色氨酸合成酶α，β亞基蛋白，研究重組蛋白的酶學(xué)特性，結(jié)果表明色氨酸合成酶β反應(yīng)最佳溫度為37℃，大于40℃時，酶活顯著降低，80℃的酶活只有10℃時的10%；最適pH值7.5，最佳Na+濃度為0.15 mol/L，最佳Mg2+濃度為0.18 mol/L；當(dāng)TRPSA/TRPSB的濃度比為1.411時，即摩爾比為2.2時，酶活最大[7]。

2 色氨酸合成酶的作用機理

研究顯示，吲哚在α活性部位產(chǎn)生后，經(jīng)過2個亞基間的特殊通道進入β亞基活性中心與L-絲氨酸發(fā)生PLP依賴性反應(yīng)，在β亞基活性中心生成L-色氨酸[8]。晶體結(jié)構(gòu)顯示αββα亞基結(jié)構(gòu)中2個亞基活性中心相距25á，α，β反應(yīng)是相互促進調(diào)節(jié)的。α亞基中，Glu-49和Asp-60是主要的活性位點殘基；Lys87和PLP結(jié)合構(gòu)成連體，在β亞基中催化反應(yīng)。吲哚是一種中等疏水性物質(zhì)，很容易從沒有引流通道的細胞中流失。在Salmonella typhimurium TSase中，2個亞基間形成顯著的疏水通道，β亞基反應(yīng)可抑制開放相位和閉合相位的轉(zhuǎn)化[7]，有效防止吲哚損失，確保催化反應(yīng)的高效性。色氨酸合成酶催化indole-3-GP，形成靛藍的起始原料[9]，細胞色素P450單加氧酶（CYP） 催化吲哚生成吲哚酚[10]，吲哚酚在GL催化下生成靛藍的前體物質(zhì)[11]，并最終合成靛藍類色素物質(zhì)。

3 色氨酸合成酶固定化

固定化是一項重要的革新技術(shù)，酶的固定化是在蛋白質(zhì)固定化的發(fā)展下演變而來。可通過吸附、離子交換、交聯(lián)、包埋、共價連接物等方法將酶固定在特定載體或區(qū)域上[12]。相對于游離的單細胞而言，固定化酶在保持原有催化活力的同時，還具有產(chǎn)率高、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點。將酶固定成球體，不僅增加了酶分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，提高細胞對底物和產(chǎn)物的耐受性，還有利于產(chǎn)物分離，有效控制生產(chǎn)過程。海藻酸鈉具備良好的穩(wěn)定性和較高的強度，是包埋游離菌的良好材料。然而，需要改進由海藻酸鈉和戊二醛包埋制備的固定化細胞的吸附性和機械強度。因此，當(dāng)合成L-2-甲基色氨酸時，采用改性玉米秸稈纖維作為填料來制備固定化色氨酸合成酶基因工程菌[13]，有效改善了包埋法存在的不足。

4 色氨酸合成酶的應(yīng)用

克隆表達色氨酸合成酶α亞基基因，擴增trpA基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒，大腸埃希菌DH5α作為宿主菌體，表達并純化色氨酸合成酶α亞基[4]，其功能研究為色氨酸合成酶的藥物挑選提供了參考依據(jù)。優(yōu)化密碼子，采用單因素和響應(yīng)面法研究最佳反應(yīng)條件，以甲硫醇和L-絲氨酸為反應(yīng)原料，制備S-甲基-L-半胱氨酸，從而為S-甲基-L-半胱氨酸的制備提供新方法[14]。構(gòu)建H37 vTRPSA和TRPSB氨基酸序列進化樹，分析色氨酸合成酶α，β亞基之間的進化關(guān)系，結(jié)果表明，TRPSA，TRPSB在分枝桿菌中是特異的、保守的。因此，H37 vTRPSA和TRPSB可以作為藥靶用于設(shè)計針對分枝桿菌的新型藥物[7]。針對增強色氨酸合成酶活性、提高底物的溶解度和反應(yīng)效率，以甲苯為有機相，在最佳反應(yīng)條件下催化合成2-甲基-L-色氨酸時，色氨酸合成酶具有最高的相對酶活性[15]。使用生物信息學(xué)方法分析和功能預(yù)測DMATS（二甲烯丙基色氨酸合成酶）蛋白質(zhì)序列，發(fā)現(xiàn)該基因家族的保守motif是設(shè)計編碼內(nèi)生真菌DMATS基因的RNA干擾引物的切入點，抑制該基因表達，影響合成堿的能力，從而使醉馬草“脫毒”成為“益草”[16]。目前，色氨酸合成酶反饋抑制位點的殘基尚無定論，將trpAB的活性位點與Thermus thermophiles TRPSB螯合PLP的模板進行比較，找出PLP周圍適宜范圍內(nèi)的氨基酸殘基，利用定點突變，對具有最突出空間位置和作用力的位點進行誘變，表達純化測定酶活，找到可能的活性中心位點 Ser390，Ser99，Gln128，Ser249，Asn250，Glu364，Thr204，His100，發(fā)現(xiàn)突變后酶活下降明顯，因此鑒定這些位點對催化反應(yīng)有十分重要的作用。

5 結(jié)語

酶的固定化和基因工程技術(shù)的應(yīng)用極大地推動了生產(chǎn)色氨酸的工業(yè)化進程，基因工程菌的構(gòu)建顯著提高了生產(chǎn)菌株的底物轉(zhuǎn)化能力。產(chǎn)量高、操作簡單、易于自動化生產(chǎn)等優(yōu)點使得基因工程菌的氨基酸生產(chǎn)水平逐漸滿足市場需求。同時，低污染、低成本的優(yōu)越生產(chǎn)方式深受研究者的青睞。作為基因工程菌，色氨酸合成酶高效的催化吲哚與絲氨酸反應(yīng)，合成L-色氨酸，使色氨酸在醫(yī)療保健、食品生產(chǎn)等方面發(fā)揮作用。通過吸附、離子交換、交聯(lián)、包埋、共價連接物等方法制備固定化酶，在保持酶活力的同時，有效控制生產(chǎn)過程，簡化生產(chǎn)工藝。近年來，定向進化技術(shù)飛速發(fā)展，未來色氨酸合成酶的應(yīng)用前景將會更加廣闊。