杜美娜 劉建明 劉楊
摘要:目的:建立蒙藥制劑烏力吉-18的微生物限度檢驗(yàn)方法。方法:按《中國藥典》2015年版四部非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查法:控制菌檢查法進(jìn)行適用性試驗(yàn)。結(jié)果:供試品5種試驗(yàn)菌回收比在0.5~2之間,控制菌均能正常檢出。
關(guān)鍵詞:烏力吉-18;微生物限度;適用性試驗(yàn)
本文參考相關(guān)文獻(xiàn),根據(jù)蒙藥制劑中成分的抑菌作用強(qiáng)度不同,采用了平皿法建立烏力吉-18相應(yīng)的微生物限度檢查方法,經(jīng)方法適用性試驗(yàn)證實(shí)該方法簡易有效。
一、實(shí)驗(yàn)材料
1.樣品名稱
烏力吉-18,批號(hào):20180502、20181018、20190410,具由新疆維吾爾自治區(qū)博爾塔拉蒙古自治州蒙醫(yī)醫(yī)院生產(chǎn)。
2.菌種
枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉菌[CMCC(F)98003]、沙門氏菌[CMCC(B)50094]以上培養(yǎng)基和菌種均由中國食品藥品檢定研究院提供工作菌株為第3代。
二、菌液及供試液制備
1.菌液制備
取經(jīng)35℃培養(yǎng)18-24小時(shí)的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌胰酪大豆胨液體培養(yǎng)物,用0.9%無菌氯化鈉溶液制成含菌數(shù)不大于10000cfu/ml的菌懸液;取經(jīng)35℃培養(yǎng)18-24小時(shí)的大腸艾希氏菌、銅綠假單胞菌、沙門氏菌胰酪大豆胨液體培養(yǎng)物,用0.9%無菌氯化鈉溶液制成含菌數(shù)不大于100cfu/ml的菌懸液;取經(jīng)25℃培養(yǎng)2-3天的白色念珠菌沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)物,用0.9%無菌氯化鈉溶液制成含菌數(shù)不大于10000cfu/ml的菌懸液;取經(jīng)25℃培養(yǎng)5-7天黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物加入3~5ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫,用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成含菌數(shù)不大于10000cfu/ml的孢子懸液。
2.供試液制備
取樣品10g,加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml,混勻,制成1:10的供試液;取1:10的供試液10ml,加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至50ml,制成1:50的供試液。
三、需氧菌總數(shù)和霉菌及酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)檢查方法適用性
供試液分別加入上述5種代表性實(shí)驗(yàn)菌株,再加15-20ml規(guī)定的瓊脂培養(yǎng)基待凝固后,置規(guī)定溫度培養(yǎng)24-72小時(shí),觀察結(jié)果,平板計(jì)數(shù),測定回收比值。
試驗(yàn)組:取上述1:10供試液10ml加入0.1ml試驗(yàn)菌,混勻,取含菌供試液1ml分別注入無菌平皿中,立即相應(yīng)的瓊脂培養(yǎng)基,每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿,按平皿法測定其菌數(shù)。需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)的試驗(yàn)菌株為金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌,相應(yīng)的瓊脂培養(yǎng)基為胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基;霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)的試驗(yàn)菌株為沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。供試品對照組:取制備好的供試液,不加菌液,按試驗(yàn)組計(jì)數(shù)方法,測定供試品本底菌數(shù)。菌液對照組:取pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試液,按試驗(yàn)組操作加入試驗(yàn)菌液并進(jìn)行測定其菌數(shù)。結(jié)果如下:
四、控制菌檢查方法適用性
1.適用性試驗(yàn)
大腸艾希氏菌,取1:10的供試液10ml,加入大腸埃希菌菌液1ml,加入100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基,混勻,置35℃培養(yǎng)18小時(shí),取上述培養(yǎng)物1ml接種至100ml麥康凱液體培養(yǎng)基中,42℃培養(yǎng)24小時(shí)。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上35℃培養(yǎng)18小時(shí),麥康凱瓊脂培養(yǎng)基應(yīng)能檢出大腸艾希氏菌反應(yīng)特征。
耐膽鹽革蘭陰性菌,取樣品1:10供試液100ml,置25℃培養(yǎng)2小時(shí),取上述培養(yǎng)物10ml,加大腸埃希菌菌液、銅綠假單胞菌菌液各1ml,搖勻,接種至100ml腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中,35℃培養(yǎng)24小時(shí)后,分別劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上,35℃培養(yǎng)18小時(shí),紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上應(yīng)能檢出耐膽鹽革蘭陰性菌的反應(yīng)特征。
沙門氏菌,取供試品10g,加入200ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基,沙門氏菌菌液1ml混勻,35℃培養(yǎng)24小時(shí)。取的上述培養(yǎng)物1ml,接種至10mlRV沙門增菌液體培養(yǎng)基中。35℃培養(yǎng)18小時(shí),取少量RV沙門氏菌增菌液體培養(yǎng)物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上,35℃培養(yǎng)18小時(shí),木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上應(yīng)能檢出沙門氏菌的反應(yīng)特征。
2.上述結(jié)果表明
本品的控制菌檢查方法為:大腸艾希氏菌,取樣品1:10供試液10ml接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)基用量100ml;耐膽鹽革蘭陰性菌,取25℃培養(yǎng)2小時(shí)樣品1:10供試液10ml,接種至腸道菌增菌液體培養(yǎng)基,培養(yǎng)基用量100ml。
五、結(jié)論
按《中國藥典》2015年版四部微生物限度檢查法、控制菌檢查法進(jìn)行三次獨(dú)立適用性試驗(yàn),5種試驗(yàn)菌回收比在0.5~2之間,控制菌均能正常檢出。
參考文獻(xiàn):
[1]中國藥典通則四部[M].北京:醫(yī)藥衛(wèi)生出版社.
[2]蒙藥烏力吉-18丸的藥理與臨床研究概況[J].內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版).
課題名稱:論文來自課題《博州蒙藥制劑微生物限度檢驗(yàn)方法的研究》