生物酶法提取鐵觀音茶梗中茶多酚工藝技術(shù)研究

羅蘭心，姜青，李翔，傅孝龍，張雅暄，滕杰，*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，江西南昌330045；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品與工程學(xué)院，江西南昌330045；3.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)軟件學(xué)院，江西南昌330045；4.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)計(jì)算機(jī)與信息工程學(xué)院，江西南昌330045）

隨著我國(guó)茶產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展，茶葉加工及深加工的規(guī)模與日遞增，同時(shí)，茶產(chǎn)品加工過程中產(chǎn)生了大量廢棄物，如茶渣、茶梗、茶碎末等。其中，茶梗以烏龍茶中的鐵觀音茶最為常見[1]，茶梗中主要含有茶多酚[2]、茶多糖[3]、生物堿[4]、芳香類物質(zhì)[5]等活性成分，李楊等[6]測(cè)定鐵觀音茶梗中茶多酚含量為8.07%，茶多糖含量為1.10%，許雨石[7]測(cè)定鐵觀音茶梗中茶多酚含量為11.95%。目前，茶梗產(chǎn)量約占烏龍茶總量的20%，僅福建省安溪縣每年茶梗產(chǎn)量就高達(dá)50000 t[7]，只有少量茶梗制成茶枕或空氣吸附劑，造成資源的極大浪費(fèi)[8]，若能對(duì)茶梗中的功能成分進(jìn)行提取利用，既能提高茶葉的附加值，又能變廢為寶，對(duì)資源優(yōu)化和環(huán)境治理具有重要意義。

茶多酚（tea polyphenols，TP）又名茶單寧、茶鞣質(zhì)，是茶葉中所含有的一類多羥基酚類化合物的總稱，約占茶葉干重的18%～36%，在烏龍茶梗中含量為6%～13%。兒茶素類化合物為茶多酚的主體成分，約占到茶多酚總量的65%～80%[9]。茶多酚作為一種新型的天然抗氧化劑，具有殺菌和抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用，還可清除活性氧自由基、抑制脂質(zhì)過氧化、抗衰老、抗輻射等，在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、日用化工等領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊[10-11]。

目前，提取茶多酚的常用方法包括有機(jī)溶劑法、生物酶法、超聲波輔助浸提法、微波輔助浸提法、沉淀法、超高壓法、超臨界萃取法[12-14]。其中，有機(jī)溶劑法存在試劑殘留、安全隱患問題，超濾法、超壓真空法、超臨界萃取、超聲波輔助浸提和微波輔助浸提所用的設(shè)備技術(shù)和經(jīng)濟(jì)成本高[15]，酶法最大優(yōu)勢(shì)是反應(yīng)條件溫和，茶多酚中有效成分兒茶素在提取過程中幾乎不損失，有效成分的提取量高；同時(shí)所得產(chǎn)物純度、穩(wěn)定性、活性均較高，且無(wú)污染。此外，酶法還具有縮短提取時(shí)間、降低能耗、降低生產(chǎn)成本等優(yōu)勢(shì)[16]。本試驗(yàn)以烏龍茶梗中茶多酚提取量為考察指標(biāo)，利用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)研究生物酶法提取茶多酚的工藝條件，旨在為茶梗廢棄物的精深加工提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

烏龍茶茶梗：市售，2019年產(chǎn)自福建省安溪縣如意茶廠，茶梗粉碎后過40目篩。

果膠酶（≥1.1 U/mg）：美國(guó)Fluka公司；中性蛋白酶（≥50 000 U/g）：山東蘇柯漢生物工程股份有限公司；纖維素酶（≥15 000 U/g）、福林酚試劑（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（＞98%，分析純）：上海展云化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ME204E電子分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；722N紫外可見分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；SHZ-82A水浴恒溫振蕩器：金壇市醫(yī)療儀器廠；DHG-9053A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SHB-III T循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；FZ102植物粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及茶多酚含量測(cè)定

茶多酚含量測(cè)定參照國(guó)標(biāo)GB/T 8318-2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法》的福林酚法[17]。稱取0.110 g沒食子酸于100 mL容量瓶中溶解并定容，搖勻后分別移取 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液于100 mL容量瓶中，蒸餾水定容、搖勻。分別移取1.0 mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液，加入5.0 mL 10%福林酚試劑搖勻，靜置3 min～8 min，再加入4 mL 7.5%碳酸鈉溶液，25℃室溫靜置60 min，765 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。以蒸餾水代替沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液為空白組。以沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.011 7x+0.019 1，R2=0.998 1，說明測(cè)定范圍內(nèi)線性關(guān)系較好。吸取1.0 mL茶梗提取液于25 mL容量瓶中，移取上述1.0 mL供試液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算茶梗中茶多酚總含量及不同浸提條件下的茶多酚提取量。

1.4 單因素試驗(yàn)

1.4.1 酶種類對(duì)茶梗茶多酚提取量的影響

準(zhǔn)確稱取1.0 g茶梗粉末，在pH 5.0，料液比1∶20（g/mL），酶解溫度50℃，反應(yīng)時(shí)間50 min參數(shù)下，分別考察酶添加量為1.0%（以底物質(zhì)量計(jì)）的5種酶體系[果膠酶（種類1），纖維素酶（種類2），果膠酶與纖維素酶合成復(fù)合酶（種類3），果膠酶，纖維素酶及蛋白酶合成復(fù)合酶（種類4），蛋白酶（種類5）]對(duì)茶多酚提取量的影響。

1.4.2 果膠酶與纖維素酶質(zhì)量比對(duì)茶梗茶多酚提取量的影響

準(zhǔn)確稱取1.0 g茶梗粉末，在pH 5.0，料液比1∶20（g/mL），復(fù)合酶添加量 1.0%（以底物質(zhì)量計(jì)），酶解溫度50℃，反應(yīng)時(shí)間50 min參數(shù)下，考察果膠酶與纖維素酶質(zhì)量比為 2∶1、1∶1、2∶3、1∶2、2∶5對(duì)茶多酚提取量的影響。

1.4.3 復(fù)合酶添加量對(duì)茶梗茶多酚提取量的影響

準(zhǔn)確稱取1.0 g茶梗粉末，在pH 5.0，料液比1∶20（g/mL），酶解溫度50℃，反應(yīng)時(shí)間50 min參數(shù)下，分別考察0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%復(fù)合酶（果膠酶∶纖維素酶=2∶3，質(zhì)量比）添加量對(duì)茶多酚提取量的影響。

1.4.4 料液比對(duì)茶梗茶多酚提取量的影響

準(zhǔn)確稱取1.0 g茶梗粉末，在pH 5.0，復(fù)合酶（果膠酶∶纖維素酶=2∶3，質(zhì)量比）添加量1.0%，酶解溫度50 ℃，反應(yīng)時(shí)間 50 min 參數(shù)下，考察1∶10、1∶15、1∶20、1 ∶25、1∶30（g/mL）的料液比對(duì)茶多酚提取量的影響。

1.4.5 酶解溫度對(duì)茶梗茶多酚提取量的影響

準(zhǔn)確稱取1.0 g茶梗粉末，在pH 5.0，料液比1∶20（g/mL），復(fù)合酶（果膠酶∶纖維素酶=2 ∶3，質(zhì)量比）添加量1.0%，反應(yīng)時(shí)間50 min參數(shù)下，考察酶解溫度30、40、50、60、70 ℃對(duì)茶多酚提取量的影響。

1.4.6 酶解時(shí)間對(duì)茶梗茶多酚提取量的影響

準(zhǔn)確稱取1.0 g茶梗粉末，在pH 5.0，料液比1∶20（g/mL），復(fù)合酶（果膠酶∶纖維素酶=2∶3，質(zhì)量比）添加量1.0%，酶解溫度50℃參數(shù)下，考察反應(yīng)時(shí)間30、40、50、60、70 min 對(duì)茶多酚提取量的影響。

1.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

依照Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，基于單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取復(fù)合酶添加量（A）、料液比（B）、酶解溫度（C）為響應(yīng)因子，使用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合優(yōu)化鐵觀音茶梗中茶多酚提取工藝。試驗(yàn)因素水平編碼見表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素與水平Table 1 Variables and levels in response surface design

1.6 試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

通過Excel 2007軟件處理相關(guān)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，并用SPSS 21.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和顯著性分析，利用Design-expert 8.0軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)和分析回歸模型結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶種類的確定

不同酶種類對(duì)茶梗中茶多酚提取量的影響見圖1。

由圖1可知，5種酶體系獲得茶梗中茶多酚提取量差異顯著（P＜0.05），且復(fù)合酶的作用效果高于單一酶。提取量最低的是種類5（蛋白酶），僅有27.47 mg/g，種類3（果膠酶與纖維素酶）的茶多酚提取量最高，達(dá)到79.17 mg/g，其次是種類4（果膠酶、纖維素酶和蛋白酶），茶多酚提取量為67.76 mg/g，說明蛋白酶的存在會(huì)抑制果膠酶與纖維素酶的復(fù)合作用，種類1（果膠酶）和種類2（纖維素酶）的茶多酚提取量分別為35.62 mg/g和45.26 mg/g，因此，確定酶種類3（果膠酶與纖維素酶合成復(fù)合酶）作為提取鐵觀音茶梗中茶多酚的復(fù)合酶。

圖1 不同酶種類對(duì)茶梗中茶多酚提取量的影響Fig.1 Effect of enzyme types on extraction of tea polyphenol in tea stalks

2.1.2 果膠酶與纖維素酶質(zhì)量比的確定

不同果膠酶與纖維素酶質(zhì)量比對(duì)茶梗中茶多酚提取量的影響見圖2。

圖2 果膠酶與纖維素酶質(zhì)量比對(duì)茶梗中茶多酚提取量的影響Fig.2 Effect of pectinase-cellulose mass ratio on extraction of tea polyphenol in tea stalks

由圖2可知，果膠酶與纖維素酶質(zhì)量比在2∶1～2∶3范圍內(nèi)，隨著復(fù)合酶中纖維素酶的用量增加，茶多酚提取量逐漸提高，由62.77 mg/g提高到80.02 mg/g（P＜0.05），原因是提高纖維素酶用量能夠使細(xì)胞壁破裂更充分，促使茶多酚大量浸出。果膠酶與纖維素酶質(zhì)量比為2∶3時(shí)，兩種酶發(fā)揮最大活性，但隨著纖維素用量的繼續(xù)增加，茶多酚提取量呈下降趨勢(shì)，質(zhì)量比為2∶5時(shí)茶多酚提取量為70.56 mg/g，說明復(fù)合酶對(duì)底物濃度呈飽和狀態(tài)[18]。因此，確定復(fù)合酶中果膠酶和纖維素酶質(zhì)量比為2∶3適宜。

2.1.3 復(fù)合酶添加量的確定

不同復(fù)合酶添加量對(duì)茶梗中茶多酚提取量的影響見圖3。

圖3 復(fù)合酶添加量對(duì)茶梗中茶多酚提取量的影響Fig.3 Effect of compound enzymatic addition on extraction of tea polyphenol in tea stalks

由圖3可知，隨著果膠酶與纖維素酶組成的復(fù)合酶添加量的升高，茶多酚提取量顯著增加（P＜0.05），當(dāng)復(fù)合酶添加量為1.0%時(shí)，提取量達(dá)到最大值75.31 mg/g，繼續(xù)增加復(fù)合酶添加量，茶多酚提取量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，其原因是復(fù)合酶添加量達(dá)到一定值時(shí)，與反應(yīng)底物達(dá)到飽和狀態(tài)，繼續(xù)增加復(fù)合酶添加量會(huì)使酶解反應(yīng)受到抑制[19]。因此，確定復(fù)合酶添加量為1.0%最佳。

2.1.4 料液比對(duì)茶梗茶多酚提取量的影響

不同料液比對(duì)茶梗中茶多酚提取量的影響見圖4。

圖4 料液比對(duì)茶梗中茶多酚提取量的影響Fig.4 Effect of ratio of solid to liquid on extraction of tea polyphenol in tea stalks

由圖4可知，茶梗中茶多酚的提取量隨溶劑體積的增大而差異顯著（P＜0.05），當(dāng)料液比 1 ∶20（g/mL）時(shí)達(dá)到最大值，為70.90 mg/g，隨著溶劑體積繼續(xù)增大提取量迅速下降，在料液比1∶30（g/mL）時(shí)得到最小值44.53 mg/g。原因?yàn)槿軇┹^少時(shí)，受到傳質(zhì)阻力影響，茶多酚浸出量小；在一定的料液比范圍內(nèi)，傳質(zhì)阻力減弱，茶多酚溶出量會(huì)升高，但當(dāng)溶劑過量時(shí)，不能再加速茶多酚的浸出率[20]。因此，確定料液比1∶20（g/mL）為最佳。

2.1.5 酶解溫度的確定

不同酶解溫度對(duì)茶梗中茶多酚提取量的影響見圖5。

圖5 酶解溫度對(duì)茶梗中茶多酚提取量的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on extraction of tea polyphenol in tea stalks

由圖5可知，不同酶解溫度對(duì)茶梗中茶多酚提取量影響顯著（P＜0.05），在 30℃～50℃范圍內(nèi)，茶多酚提取量隨著溫度升高而增加，在50℃時(shí)達(dá)到80.76 mg/g的最大值，復(fù)合酶發(fā)揮最大活性與穩(wěn)定性，達(dá)到了復(fù)合酶的最適反應(yīng)溫度，最大程度地使細(xì)胞壁破裂，使茶多酚充分溶出；隨著溫度逐漸升高，酶蛋白質(zhì)變性失活，酶活性下降，提取量也顯著降低，在70℃時(shí)僅有53.32 mg/g，為最大值的66.02%。因此，確定最適的酶解溫度以50℃最佳。

2.1.6 酶解時(shí)間的確定

不同酶解時(shí)間對(duì)茶梗中茶多酚提取量的影響見圖6。

圖6 酶解時(shí)間對(duì)茶梗中茶多酚提取量的影響Fig.6 Effect of enzymatic hydrolysis time on extraction of tea polyphenol in tea stalks

由圖6可知，在30 min～50 min范圍內(nèi)，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，茶梗中茶多酚提取量顯著提高（P＜0.05），在50 min時(shí)，達(dá)到82.80 mg/g的最大提取量；超過50 min后，茶多酚提取量呈現(xiàn)平穩(wěn)下降趨勢(shì)。原因是提取時(shí)間過短，酶解作用不充分，延長(zhǎng)酶解時(shí)間對(duì)提高茶多酚提取量無(wú)意義，且存在抑制酶活性的現(xiàn)象。因此，確定酶解時(shí)間以50 min適宜。

2.2 響應(yīng)面模型建立與分析

響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)及結(jié)果Table 2 Response surface methodology and analysis results

利用Design-Expert 8.0軟件對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到茶多酚提取量與復(fù)合酶添加量（A）、料液比（B）、酶解溫度（C）的回歸模型方程為：Y=83.74-2.22A+0.48B-5.76C+2.21AB+1.19AC+1.15BC-8.43A2-7.39B2-5.37C2。

方差分析見表3。

由Design-Expert 8.0軟件分析結(jié)果，對(duì)試驗(yàn)方差及擬合程度進(jìn)行綜合分析。該試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷腜<0.000 1，呈極顯著；失擬項(xiàng)P=0.502 0，不顯著，表明該模型真實(shí)可靠具有可信度[21]。3個(gè)因子對(duì)Y（茶多酚提取量）的影響大小為：C（酶解溫度）>A（復(fù)合酶添加量）>B（料液比）。一次項(xiàng)中A、C呈極顯著，B為顯著；二次項(xiàng) A2、B2、C2和交互項(xiàng) AB、AC、BC 均為極顯著。相關(guān)系數(shù)R2=0.998 2，校正相關(guān)系數(shù)R2adj=0.995 9，表明模型可解釋99.59%的響應(yīng)值變化；R2=0.998 2，表明響應(yīng)值的變化有99.82%來(lái)源于所選變量，且信噪比為13.33，證明該模型擬合程度好，可用于分析和預(yù)測(cè)茶梗中茶多酚的提取工藝。

2.3 響應(yīng)面圖分析與優(yōu)化

各響應(yīng)因素交互作用對(duì)茶多酚提取量影響的響應(yīng)面和等高線圖見圖7。

表3 茶多酚提取量的回歸方程方差分析Table 3 Analysis and statistical parameters of regression model of tea polyphenols content

由圖7（a）可知，復(fù)合酶添加量與料液比對(duì)茶多酚提取量影響的響應(yīng)曲面坡度較為陡峭，其等高線均呈橢圓形且曲線較為密集，表明復(fù)合酶添加量和料液比的交互效應(yīng)對(duì)茶多酚提取量的影響較為顯著。同時(shí)，茶多酚提取量隨溶劑體積的升高和復(fù)合酶添加量的增加呈現(xiàn)先高后低的變化趨勢(shì)，并且復(fù)合酶添加量的變化曲面較料液比的變化曲面更陡峭，說明復(fù)合酶添加量對(duì)茶梗中茶多酚提取量的影響更明顯。

由圖7（b）可知，復(fù)合酶添加量與酶解溫度對(duì)茶多酚提取量影響的響應(yīng)曲面坡度均較陡峭，其等高線均呈橢圓形且曲線密集，表明復(fù)合酶添加量與酶解溫度的交互效應(yīng)對(duì)茶梗中茶多酚提取量的影響顯著，與方差分析結(jié)果相符。同時(shí)，茶多酚提取量隨復(fù)合酶添加量的增加和酶解溫度的升高呈現(xiàn)先升高后緩慢降低的趨勢(shì)，并且酶解溫度的變化曲面較復(fù)合酶添加量的變化更陡峭，說明酶解溫度對(duì)茶梗中茶多酚提取量的影響更明顯。

由圖7（c）可知，料液比與酶解溫度對(duì)茶多酚提取量影響的響應(yīng)曲面坡度較為陡峭，但其等高線均呈橢圓形且曲線較為密集，表明料液比與酶解溫度的交互效應(yīng)對(duì)茶梗中茶多酚提取量的影響顯著，與方差分析結(jié)果相符。同時(shí)，茶多酚提取量隨酶解溫度的升高和溶劑體積的增大呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，并且酶解溫度的變化曲面較料液比的變化更為陡峭，說明酶解溫度對(duì)茶梗中茶多酚含量的影響更明顯。

圖7 各響應(yīng)因素交互作用對(duì)茶多酚提取量影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.7 The response surface and contour plots of the interaction of each factor to the extraction amount of tea polyphenols

2.4 最佳條件確定與回歸模型的驗(yàn)證

通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)得到酶法提取茶梗中茶多酚最佳工藝條件為：復(fù)合酶添加量1.18%，料液比1∶19.86（g/mL），酶解溫度47.86℃，此條件下得到茶多酚提取量為82.79 mg/g。為便于實(shí)際操作，提取工藝條件調(diào)整為：復(fù)合酶添加量1.2%，料液比1∶20（g/mL），酶解溫度48℃，在此參數(shù)下進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，茶多酚提取量平均值為82.26 mg/g，與理論值接近，表明響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合酶提取茶梗中茶多酚的工藝結(jié)果可靠。

3 結(jié)論

本研究以烏龍茶類鐵觀音茶梗中的茶多酚提取量為考察目標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化茶梗中茶多酚的提取工藝，最終得到茶多酚提取最佳工藝參數(shù)為：復(fù)合酶添加量1.2%，料液比1∶20（g/mL），酶解溫度48℃。在此參數(shù)下，鐵觀音茶梗中茶多酚提取量為82.26 mg/g，接近預(yù)測(cè)提取量82.79 mg/g，較其它提取方法結(jié)果更高，說明此試驗(yàn)?zāi)Ｐ徒Y(jié)果可靠。同時(shí)，獲得鐵觀音茶梗中茶多酚提取的因素影響大小為：酶解溫度>復(fù)合酶添加量>料液比，研究結(jié)果將為烏龍茶類的茶梗附加值開發(fā)利用提供技術(shù)支撐。