陳楓楠 郎廷元 吳常裕 俞曉軍 石新木 沈凱 楊海燕

摘 要 目的：體外評價尼可地爾對肺動脈平滑肌細(xì)胞（PASMCs）增殖、遷移能力和Hippo/YAP信號通路的影響。方法：將人原代PASMCs分為正常對照組、模型組和尼可地爾低、中、高濃度組（50、100、200 μmol/L），每組設(shè)3個復(fù)孔。除正常對照組外，其余各組細(xì)胞均接種在凝膠包被的培養(yǎng)板上，模擬肺動脈高壓環(huán)境，以建立肺動脈硬化（AS）細(xì)胞模型;隨后，各藥物組加入相應(yīng)藥物，正常對照組和模型組加入同等體積生理鹽水，培養(yǎng)48 h。采用CCK-8法檢測各組細(xì)胞的增殖能力（以光密度計），Transwell方法檢測細(xì)胞遷移能力，實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)檢測細(xì)胞中YAP靶基因子[結(jié)締組織生長因子（CTGF）、雙向調(diào)節(jié)蛋白（AREG）] mRNA的表達(dá)水平，Western blotting法檢測細(xì)胞中CTGF、AREG蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果：與正常對照組比較，模型組細(xì)胞的光密度顯著升高，每視野遷移細(xì)胞數(shù)顯著增加，細(xì)胞中CTGF、AREG mRNA及蛋白的表達(dá)水平均顯著增強(qiáng)（P<0.01）。與模型組比較，尼可地爾低、中、高濃度組細(xì)胞的光密度、每視野遷移細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞中CTGF、AREG mRNA及蛋白的表達(dá)水平均顯著降低，且成濃度依賴性（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：尼可地爾可抑制AS模型PASMCs的增殖和遷移，其作用機(jī)制可能與抑制Hippo/YAP信號通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞 尼可地爾;肺動脈高壓;肺動脈硬化;肺動脈平滑肌細(xì)胞;Hippo/YAP信號通路

中圖分類號 R361+.3;R965 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）22-2736-05

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To evaluate the effects of nicorandil on the proliferation， migration ability and Hippo/YAP signaling pathway of pulmonary artery smooth muscle cells （PASMCs）. METHODS： Human primary PASMCs were divided into normal control group， model group， nicorandil low， medium and high concentration groups （50， 100， 200 μmol/L）， with 3 holes in each group. In addition to the normal control group， the rest of the cells were inoculated on the gel coated medium to simulate the pulmonary hypertension environment， so as to establish AS cell model. Then， each drug group was added with corresponding drugs， and the normal control group and model group were added with the same volume of normal saline， and cultured for 48 h. CCK-8 assay and Transwell assay were used for the examination of cell proliferation （by light density） and migration ability， respectively. mRNA expression of YAP target factors （CTGF and AREG） were examined by qRT-PCR. Western blotting assay was used to detect the protein expression of CTGF and AREG. RESULTS： Compared with normal control group， light density of cells was increased significantly in model group; the number of migration cells per field of view increased significantly; mRNA and protein expression of CTGF and AREG were significantly increased （P<0.01）. Compared with model group， light density， the number of migration cells per field of view， mRNA and protein expression of CTGF and AREG in nicorandil low， medium and high concentration groups were decreased significantly， in concentration-dependent manner （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Nicorandil can inhibit the proliferation and migration of PASMCs in AS model， the mechanism of which may be associated with the Hippo/YAP signaling pathway.

KEYWORDS? ?Nicorandil; Pulmonary arterial hypertension;AS; Pulmonary arterial smooth muscle cells; Hippo/YAP signaling pathway

肺動脈高壓（Pulmonary arterial hypertension，PAH）是我國臨床常見的重大疾病之一，具有較高的致死、致殘率[1-3]。隨著人們生活水平的提高，PAH的風(fēng)險因素也日益增加[4-6]，給患者家庭和社會帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。PAH發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，從分子病理學(xué)角度看，其是由肺動脈平滑肌細(xì)胞（Pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs）異常增殖和遷移導(dǎo)致肺動脈重建所引起的，目前尚未開發(fā)針對其分子病理進(jìn)展的有效藥物，可見研究PAH的疾病分子機(jī)制并開發(fā)有效的治療方法是生物醫(yī)藥領(lǐng)域的重要工作。

肺動脈重建是PAH的重要過程，PASMCs可通過異常增殖、遷移等方式誘導(dǎo)肺動脈重建，導(dǎo)致肺動脈硬化（Arterial stiffness，AS）和PAH，進(jìn)而使患者產(chǎn)生勞力性呼吸困難、嚴(yán)重供氧不足等癥狀，最終可導(dǎo)致其心力衰竭，甚至死亡[7-9]?？梢?，阻止肺動脈重建是治療PAH的潛在途徑，干預(yù)PASMCs異常的增殖、遷移是阻止肺動脈重建的有效手段。若能成功干預(yù)PASMCs的異常增殖和遷移，將有可能阻止肺動脈重建和患者勞力性呼吸困難、嚴(yán)重供氧不足等癥狀惡化，還有可能達(dá)到治療PAH的目的。

已有研究證明，Hippo/YAP信號通路在PASMCs中異常激活，從而增強(qiáng)了細(xì)胞的增殖、遷移能力，是肺動脈重建的主要因素之一。因此，Hippo/YAP信號通路為抑制肺動脈重建的主要治療靶點之一[10]。尼可地爾是治療PAH的傳統(tǒng)用藥[11]，但該藥是否具有抑制Hippo/YAP信號通路等分子生物學(xué)功效仍少有研究。基于此，筆者研究了尼可地爾對PASMCs增殖、遷移能力和Hippo/YAP信號通路中結(jié)締組織生長因子（CTGF）、雙向調(diào)節(jié)蛋白（AREG）的影響，旨在為闡明藥物作用機(jī)制以及尋找PAH新治療策略提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

BB15型細(xì)胞培養(yǎng)箱、Invitrogen E-Gel Imager型凝膠成像系統(tǒng)、Multiskan Sky型全波長酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）;5702型低速離心機(jī)、5425R型高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）;7500 Fast型實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）系統(tǒng)（美國ABI公司）;DMil型顯微鏡（德國Leica公司）。

1.2 藥品與試劑

尼可地爾對照品（美國Sigma公司，批號：N3539，純度：≥98%）;磷酸鹽緩沖液（PBS，批號：70011069，pH 7.4）、DMEM培養(yǎng)基（批號：12491015）、胎牛血清（FBS，批號：16000044）、Super Script Ⅱ陰性逆轉(zhuǎn)錄酶（批號：18064002）、熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）檢測試劑盒（批號：11781200）、RIPA裂解液（批號：89901）、疏水化試劑Surfasil（批號：TS-42800）、Ⅰ型膠原蛋白（批號：A1048301）、胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）消化液（批號：R001100）均購自美國Thermo Fisher Scientific公司;CCK-8試劑盒（日本Dojindo公司，批號：CK04）;RNeasy Mini Kit（德國Qiagen公司，批號：74104）;兔源CTGF（批號：ab6992）、AREG（批號：ab180722）、β-肌動蛋白（β-actin，批號：ab8227）多克隆抗體和辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（批號：ab7090）、BCA蛋白檢測試劑盒（批號：ab102536）以及ECL顯色液（批號：ab133406）均購自英國Abcam公司;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）相關(guān)試劑[生工生物工程（上海）股份有限公司];細(xì)胞培養(yǎng)板（美國Corning公司）;引物由生工生物工程（上海）股份公司設(shè)計、合成;其余試劑均為分析純，水為滅菌超純水。

1.3 細(xì)胞系

人原代PASMCs系（編號：ATCC? PCS-100-023TM）購自美國ATCC公司。

2 方法

2.1 AS細(xì)胞模型的建立

2.1.1 凝膠包被培養(yǎng)板的制備 首先將一個15 mm玻璃蓋玻片硅烷化，再在一個玻璃板上制備疏水面。配制含0.075%過硫酸銨、0.015%焦亞硫酸鈉、0.15%四甲基乙二胺的水溶液，并按12 ∶ 0.24（V/V）與丙烯酰胺-雙丙烯酰胺溶液（7.5 ∶ 0.24，V/V）混合，制備成凝膠。將該凝膠覆蓋于玻璃板的疏水面上，再以蓋玻片的烷基化面覆蓋，組合成上、中、下層分別為硅烷化蓋玻片、凝膠、疏水玻璃板的“三明治”結(jié)構(gòu)。待該“三明治”結(jié)構(gòu)凝固后小心剝離蓋玻片和凝膠，棄去玻璃板，將蓋玻片和凝膠置于培養(yǎng)板上，微波滅菌，用PBS清洗后，用0.05 mg/mL Ⅰ型膠原蛋白覆蓋培養(yǎng)板孔底部，室溫孵育20 min，活化后用PBS清洗即得可接種細(xì)胞的凝膠包被培養(yǎng)板。

2.1.2 建模 根據(jù)Dieffenbach P等[10]于2017年發(fā)表的文獻(xiàn)方法，以“2.1.1”項下所得凝膠包被的培養(yǎng)板為載體，通過將人原代PASMCs接種于凝膠上，于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞貼壁，以此模擬PAH環(huán)境，獲得AS細(xì)胞模型。

2.2 分組與給藥

將人原代PASMCs分為5組，分別為正常對照組、模型組和尼可地爾低、中、高濃度組，每組設(shè)3個復(fù)孔。正常對照組細(xì)胞按1×104個/孔接種于24孔培養(yǎng)板上，每孔含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基600 μL，待培養(yǎng)12～24 h至貼壁后，采用同等體積溶劑（生理鹽水）處理。后4組細(xì)胞按1×104個/孔接種于按“2.1.1”項下所制備的24孔凝膠包被培養(yǎng)板上，每孔含有20%FBS的DMEM培養(yǎng)基600 μL，再按“2.1.2”項下方法模擬PAH環(huán)境，獲得AS細(xì)胞模型;待培養(yǎng)12～24 h至貼壁后，模型組細(xì)胞采用同等體積溶劑（生理鹽水）處理，尼可地爾低、中、高濃度組細(xì)胞分別采用50、100、200 μmol/L尼可地爾處理（根據(jù)前期預(yù)試驗結(jié)果，選擇可抑制PASMCs生長且仍可進(jìn)行分子水平研究的尼可地爾濃度，以生理鹽水為溶劑）;所有組別均于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

2.3 細(xì)胞增殖能力檢測

采用CCK-8法檢測。取“2.2”項下分組、處理、繼續(xù)培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗后，每孔加入CCK-8試劑10 μL，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育40 min，使用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處的光密度（OD值），OD值與增殖能力成正相關(guān)。試驗重復(fù)3次。

2.4 細(xì)胞遷移能力檢測

采用Transwell法檢測。取“2.2”項下分組、處理、繼續(xù)培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，經(jīng)消化后，用無血清的DMEM培養(yǎng)基重懸并稀釋成1×105個/mL的細(xì)胞懸液。于Transwell小室上層加入細(xì)胞懸液200 μL，下層中加入含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基500 μL，于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出小室，用PBS洗去培養(yǎng)基，結(jié)晶紫染色10 min，用PBS清洗3次，用棉簽將上層接種側(cè)的細(xì)胞擦除干凈，于顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。試驗重復(fù)3次。

2.5 細(xì)胞中CTGF和AREG mRNA表達(dá)的檢測

采用qRT-PCR法檢測。取“2.2”項下分組、處理、繼續(xù)培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，用RNeasy Mini Kit提取細(xì)胞總RNA，采用Super Script Ⅱ陰性逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。將cDNA和CTGF、AREG引物與qRT-PCR檢測試劑盒中的Master mix混合，應(yīng)用實時PCR系統(tǒng)進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系（共15 mL）：Master mix（終濃度為1×）7.5 mL，引物混合物0.6 mL（終濃度為0.4 mmol/L，上、下游引物比例為1 ∶ 1），cDNA模板1.5 mL（不超過總體系10%），ddH2O 5.4 mL;擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，循環(huán)40次。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算CTGF、AREG mRNA的表達(dá)量，再以模型組為參照，計算各指標(biāo)表達(dá)水平。試驗重復(fù)3次。引物序列見表1。

2.6 細(xì)胞中CTGF和AREG蛋白表達(dá)的檢測

采用Western blotting法檢測。取“2.2”項下分組、處理、繼續(xù)培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，用RIPA溶液裂解，4 ℃下14 000 r/min離心20 min，提取總蛋白，測定蛋白含量?？偟鞍捉?jīng)沸水煮5 min變性后通過SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，以5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入CTGF、AREG、β-actin一抗（稀釋比例均為1 ∶ 1 000），在4 ℃條件下封閉過夜;TBST清洗10 min×3次，加入二抗（稀釋比例為1 ∶ 1 000），室溫孵育2 h;TBST清洗10 min×3次，ECL顯色后應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)成像并采用Image Lab 5.2.1軟件分析。以β-actin作為內(nèi)參，目標(biāo)蛋白CTGF、AREG與內(nèi)參條帶的灰度值比值作為目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。試驗重復(fù)3次。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料均以x±s表示，兩組間比較采用Students t檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 尼可地爾對PASMCs增殖能力的影響

與正常對照組比較，模型組細(xì)胞OD值顯著升高（P<0.01），表明PASMCs增殖明顯，提示AS模型細(xì)胞建立成功。與模型組比較，尼可地爾低、中、高濃度組細(xì)胞OD值均顯著降低，且尼可地爾中、高濃度組顯著低于低濃度組，高濃度組顯著低于中濃度組（P<0.05或P<0.01），提示尼可地爾可抑制PASMCs的增殖，且抑制能力隨濃度的增加而增強(qiáng)。各組細(xì)胞OD值的檢測結(jié)果見表2。

3.2 尼可地爾對PASMCs遷移能力的影響

與正常對照組比較，模型組每視野遷移細(xì)胞數(shù)顯著增加（P<0.01），表明PASMCs遷移增多，提示AS模型細(xì)胞建立成功。與模型組比較，尼可地爾低、中、高濃度組每視野遷移細(xì)胞數(shù)均顯著減少，且尼可地爾中、高濃度組顯著少于低濃度組，高濃度組顯著少于中濃度組（P<0.01），提示尼可地爾可抑制PASMCs的遷移，且抑制能力隨濃度的增加而增強(qiáng)。各組細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)的檢測結(jié)果見表3。

3.3 尼可地爾對PASMCs中CTGF、AREG mRNA表達(dá)的影響

與正常對照組比較，模型組細(xì)胞中CTGF、AREG mRNA的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01），表明PASMCs中CTGF、AREG mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，提示AS模型細(xì)胞建立成功。與模型組比較，尼可地爾低、中、高濃度組細(xì)胞中CTGF、AREG mRNA的表達(dá)水平均顯著降低，且尼可地爾中、高濃度組顯著低于低濃度組，高濃度組顯著低于中濃度組（P<0.05或P<0.01），提示尼可地爾可抑制PASMCs中CTGF、AREG mRNA的表達(dá)，且抑制能力隨濃度的增加而增強(qiáng)。各組細(xì)胞中CTGF、AREG mRNA表達(dá)水平的檢測結(jié)果見表4。

3.4 尼可地爾對PASMCs中CTGF、AREG蛋白表達(dá)的影響

與正常對照組比較，模型組細(xì)胞中CTGF、AREG蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01），表明PASMCs中CTGF、AREG蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，提示AS模型細(xì)胞建立成功。與模型組比較，尼可地爾低、中、高濃度組細(xì)胞中CTGF、AREG蛋白的表達(dá)水平均顯著降低，且尼可地爾中、高濃度組顯著低于低濃度組，高濃度組顯著低于中濃度組（P<0.01），提示尼可地爾可抑制PASMCs中CTGF、AREG蛋白的表達(dá)，且抑制能力隨濃度的增加而增強(qiáng)。各組細(xì)胞中CTGF、AREG蛋白表達(dá)的電泳圖見圖1，檢測結(jié)果見表5。

4 討論

PAH早期的分子機(jī)制是PASMCs的異常增殖和遷移，該異?？蓪?dǎo)致肺動脈異常重建，從而引發(fā)AS和PAH。PAH早期的分子病理現(xiàn)象與腫瘤早期的分子病理現(xiàn)象非常相似，同為細(xì)胞的增殖和遷移能力異常升高，可見PAH可能與腫瘤擁有相同的治療靶點。

Hippo/YAP信號通路在哺乳動物中具有高度保守的特性，且主要負(fù)責(zé)調(diào)控器官大小、發(fā)育和干細(xì)胞增殖。Hippo信號通路由MST1/2（Mammalian sterile20-like kinase1 and 2）和LATS1/2（Largetumorsuppressor 1 and 2）兩個激酶組成，MST1/2磷酸化LATS1/2并激活LATS1/2，激活后的LATS1/2磷酸化YAP并促進(jìn)YAP降解，從而抑制YAP的轉(zhuǎn)錄活性;YAP的主要功能是作為共轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞核中激活促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移等功能的細(xì)胞生長正向調(diào)控基因。Hippo通路是腫瘤抑制通路，而YAP是癌基因，YAP的活性在多種腫瘤細(xì)胞中被激活，是腫瘤治療的重要靶點[12-14]。已有研究表明，在腫瘤發(fā)生和進(jìn)展過程中，Hippo/YAP信號通路異常激活可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移能力以及細(xì)胞的干性[15-16]。肺動脈重建和腫瘤發(fā)生進(jìn)展的過程非常相似，均由細(xì)胞增殖和遷移能力異常升高引起，且肺動脈重建過程與器官大小的再調(diào)控非常類似，因此Hippo/YAP信號通路可能與PAH病理過程中PASMCs增殖和遷移能力的異常升高密切相關(guān)。CTGF和AREG是YAP的主要下游靶因子，CTGF和AREG的表達(dá)與Hippo/YAP通路的活性成正比，在腫瘤組織中，檢測CTGF和AREG可衡量Hippo/YAP通路的激活程度，從而反映腫瘤的惡性程度;同理，可預(yù)期CTGF和AREG的檢測可預(yù)測肺動脈重建的程度并衡量肺動脈硬化和肺動脈高壓的程度?；诖耍狙芯客ㄟ^檢測CTGF和AREG的mRNA水平和蛋白水平嘗試鑒定Hippo/YAP通路的活性，結(jié)果顯示，尼可地爾可顯著抑制PASMCs的增殖和遷移，下調(diào)細(xì)胞中CTGF和AREG蛋白及mRNA的表達(dá)，且成濃度依賴性，表明尼可地爾具有抑制AS模型PASMCs細(xì)胞Hippo/YAP通路的活性。

綜上所述，尼可地爾可抑制PASMCs的增殖、遷移，其作用可能與抑制Hippo/YAP通路有關(guān)。本研究為建立PAH的新治療策略提供了理論基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2020-08-06 修回日期：2020-09-27）

（編輯：鄒麗娟）