SOCS1基因沉默增強DC疫苗應(yīng)用于肺癌動物模型中的效果研究

曹瑞萍 王策

【摘要】目的探究SOCSI基因沉默增強DC疫苗應(yīng)用于肺癌動物模型中的效果。方法選取SPF'級的雌性近交鼠系，均進行細胞培養(yǎng)、荷瘤動物的建模與治療。觀察轉(zhuǎn)染siRNA抑制SOCSl表達情況、DC疫苗抑制腫瘤生長情況、DC疫苗對腫瘤的特異殺傷能力。結(jié)果經(jīng)熒光顯微鏡下觀察大部分細胞呈現(xiàn)綠色，證明轉(zhuǎn)染siRNA抑制了socsi表達。經(jīng)治療后，自14 d開始，lvsate-mDC和lvsat elsiRNA-mDC腫瘤生長緩慢，PBS生長依然迅速。DC沉默SOCS1后對TCL的特異性殺傷效果更好，未沉默時對其殺傷效果不好。結(jié)論研究發(fā)現(xiàn)沉默后的DC對肺癌患者治療效果更優(yōu)，在臨床腫瘤治療的應(yīng)用性很廣。

【關(guān)鍵詞】SOCS1基因;DC疫苗;肺癌動物模型

DOI： 10.14163/j.cnki.ll-5547/r.2020.19.095

最新的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，由于吸煙等有害習慣以及其他不可控因素近年來肺癌的發(fā)病人數(shù)直線上升，這種腫瘤的死亡率很高，甚至在所有惡性腫瘤中位居首位。但是對于癌癥的治療仍舊是一大難題，微小的病灶通過手術(shù)的方式很難清除，而小細胞肺癌患者不能耐受化療，因此DC生物疫苗的治療就受到了眾多關(guān)注。DC是通過將腫瘤細胞荷載，然后激活T淋巴細胞的免疫功能，使其清除腫瘤細胞[1]。DC治療比手術(shù)安全性更高，且并發(fā)癥副作用情況相對少。但是在應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，DC激發(fā)出的免疫性能非常有效，不能快速清除腫瘤細胞，因此治療情況一般[2]。因為腫瘤細胞也會靈活躲避免疫系統(tǒng)的攻擊，有很多逃逸機制。因此需要采取其他方法對原有的DC進行改良修飾，提高抗原提呈能力，提高激發(fā)的免疫功能應(yīng)答能力。因此，本文通過肺癌動物模型的案例，對DC進行SOCSI沉默，觀察對比沉默之前與沉默之后的治療效果，為臨床肺癌治療提供指導(dǎo)依據(jù)。

l材料與方法

1.1材料

1.1.1制備細胞株及腫瘤裂解物肺癌細胞株購白美國模式培養(yǎng)物集存庫，將肺癌細胞株放培養(yǎng)在含有10%的FCS、濃度為10 mmol/L的羥乙基哌秦乙硫磺酸、濃度為每毫升酶活為100的青霉素和100 ug/ml的鏈霉素（利君制藥）的RPMI1640完全培養(yǎng)基中。等到肺癌細胞株占據(jù)瓶底的4/5時，將其鏟下再經(jīng)過三次磷酸緩沖鹽溶液洗滌，在-80℃冷凍然后在37℃溶解這個過程重復(fù)5次，裂解方法采用超聲波，最后經(jīng)離心機離心然后對上清收集即可。

1.1.2實驗動物 由于對致癌物近交鼠系有很高的敏感性，因此本實驗選取SPF級的雌性近交鼠系，實驗小鼠的周齡為3-6周，從中科院上海生物科學研究院購買，數(shù)量共36只。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)首先獲取小鼠的骨髓細胞在去除紅細胞后經(jīng)過5-7 d的培養(yǎng)后，將培養(yǎng)板中的懸浮和松散貼壁的細胞取出，這些細胞是極為不成熟的DC細胞。用lvsate-mDC和lvsate/siRNA-mDC分別標記未沉默SOCS1的iDC和沉默SOCSI的iDC，最后檢驗其純度。

1.2.2荷瘤動物的建模與治療將滅菌50ug的滅菌PBS、lysate-mDC（I×106細胞/50 ul）、lvaste/siRNA-mDC（lx 106細胞/50 ul）在小鼠接種腫瘤的14 d注射至小鼠的足墊皮下，要想使DC充分成熟，在接種疫苗后的3d內(nèi)對每只小鼠每天注射30 ug/200 uI的LPS。在當天用洗滌重選后的PBS以每細胞/5×lO-4在小鼠腋窩皮下接種。從第8天開始，每2d用游標卡尺測量1次小鼠的腫瘤體積。在接種后的第18天殺死小鼠取其脾細胞分別培養(yǎng)后分別檢測LDH的吸光度、斑點數(shù)、干擾素-r（IFN-r）等。

1.3觀察指標觀察轉(zhuǎn)染siRNA抑制SOCS1表達情況、DC疫苗抑制腫瘤生長情況、DC疫苗對腫瘤的特異殺傷能力。顯微鏡下DC顏色：因為直觀觀察轉(zhuǎn)染的效果，用熒光染料標記siRNA，若轉(zhuǎn)入DC則呈現(xiàn)綠色。

2結(jié)果

2.1轉(zhuǎn)染siRNA抑制SOCS1表達情況 經(jīng)熒光顯微鏡下觀察大部分細胞呈現(xiàn)綠色，證明轉(zhuǎn)染siRNA抑制了SOCSI表達。

2.2 DC疫苗抑制腫瘤生長情況經(jīng)治療后，白14 d開始，lvsate-mDC和Ivsate/siRNA-mDC腫瘤生長緩慢，PBS生長依然迅速。見表1。

2.3 DC疫苗對腫瘤的特異殺傷能力DC沉默SOCSI后對TCL的特異性殺傷效果更好，未沉默時對其殺傷效果不好。

3討論

RNAis是近年來生理學以及生物學領(lǐng)域的一大發(fā)現(xiàn)，對于它的原理可以這樣解析，在它與mRNA重組結(jié)合以后，進而使其降解，達到對基因的轉(zhuǎn)錄并沉默的效果[3]。這一原理的提出為生理學的發(fā)展進步起到重大推動作用，通過這個理論解析使我們更加清楚基因信息控制的基本原理，在生物學中的地位也是不容忽視的，為許多疑惑進行一定程度的解答[4]。這項原理理論的特異以及撼動價值使其在各個領(lǐng)域的應(yīng)用廣泛，在醫(yī)學中的理論指導(dǎo)也有很多涉及。對于DC腫瘤疫苗的預(yù)備性研究也采取了該理論的應(yīng)用技術(shù)[5]。

研究過程中發(fā)現(xiàn)一個有趣的現(xiàn)象，當siRNA沉默在SOCSI調(diào)節(jié)分子后，能夠提高刺激之后的共刺激分子的表達能力。進而能夠提高抗原輸出性能以及使成熟度進一步提升[6]。其他研究者也發(fā)現(xiàn)了類似的情況。研究者對Dil h+單核細胞進行了觀察研究，研究人員發(fā)現(xiàn)，LPS原本是來自于細菌中細胞壁結(jié)構(gòu)中的成分，它的配體是一種叫做Toll-樣受體4（TLR4）的受體[7]，如果對SOCSI的運動進行抑制阻礙，單核細胞以及DC對LPS的反應(yīng)活性也會相應(yīng)升高[8]。這一研究說明，SOCSI對于很多通路的調(diào)節(jié)過程起著非常重要的作用[9]，無論是JAK/STAT還是TLR4參與的通路，SOCSI的參與性不可忽視[10]。

本研究對小鼠進行了肺癌動物模型的模擬實驗，在對小鼠攝入疫苗治療之后，可以得到一個結(jié)論，在SOCSI沒有進行沉默的小鼠治療之后發(fā)現(xiàn)疫苗的效果也有一定成效，但是SOCSI沉默之后的疫苗對于小鼠的治療效果更為顯著。沉默之后的腫瘤細胞的生長繁殖受抑制明顯，CD4+對于體外腫瘤細的清除扼殺力度增強，這個過程分泌產(chǎn)生的免疫性細胞因子增多。結(jié)果表明，SOCSI是對于疫苗的功能反饋控制的重要因素，沉默SOCSI能夠提高患者的免疫能力，對于DC功能是強化作用。對于未來DC疫苗的臨床應(yīng)用治療，SOCSI的作用可以進一步利用，醫(yī)學應(yīng)用性非常顯著，對于肺癌患者的治療也是非常有效的改良手段，為患者帶來希望。