趙洪雷，馮媛，白旭婷，徐永霞*，儀淑敏，勵(lì)建榮，謝晶，郭曉華

1(渤海大學(xué) 實(shí)驗(yàn)中心，遼寧 錦州， 121013)2(渤海大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建 協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 錦州， 121013)3(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海， 201306)4(山東美佳集團(tuán)有限公司，山東 日照， 276800)

海鱸魚(Percafluviatilis)又名日本真鱸、七星鱸、鱸鮫等，其體型粗而長，下頜長于上頜，魚嘴較尖，體側(cè)上部及背鰭有黑色斑點(diǎn)[1]。海鱸魚是我國沿海地區(qū)常見的經(jīng)濟(jì)魚類之一，主要分布于太平洋西部，我國沿海及通海的淡水水域中均產(chǎn)，其中渤海、黃海和東海海域產(chǎn)量較多[2]。海鱸魚肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美，骨刺較少，肌肉中蛋白質(zhì)含量豐富，氨基酸種類全面且比例合適，同時(shí)富含二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸，深受消費(fèi)者的喜愛[3-4]。

近年來，隨著人們生活水平的提高，食品的營養(yǎng)價(jià)值愈發(fā)受到關(guān)注。蛋白消化率主要反映了食物中的蛋白質(zhì)在消化道內(nèi)被消化酶分解的程度，是評(píng)價(jià)食物蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)[5]。目前關(guān)于食品蛋白消化率的研究主要采用胃蛋白酶-胰蛋白酶體外模擬消化的方法，利用體外仿生模擬消化系統(tǒng)能有效模擬人體或動(dòng)物的消化道及其消化環(huán)境、消化道內(nèi)的流體動(dòng)態(tài)行為等[6]。肉類一般需經(jīng)加熱熟化后再食用，而熟化的溫度和時(shí)間對(duì)最終產(chǎn)品的品質(zhì)、風(fēng)味和營養(yǎng)價(jià)值都具有重要影響。加熱處理會(huì)使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而影響蛋白酶的作用位點(diǎn)及蛋白質(zhì)的消化吸收率。已有研究表明，不同的熱處理溫度對(duì)肉類蛋白質(zhì)的消化率有一定的影響。韋婕妤等[7]采用胃蛋白酶-胰蛋白酶體外模擬消化法研究了不同熱加工方法對(duì)羊肉制品蛋白消化性的影響，發(fā)現(xiàn)不同的熱加工方式及加熱終點(diǎn)溫度對(duì)蛋白質(zhì)體外消化率的影響不同，研究結(jié)果為家庭烹飪選擇合理的加熱方式和溫度提供理論依據(jù)。楊萬君等[8]研究了3種品牌醬排骨中蛋白質(zhì)的體外模擬消化情況，結(jié)果表明不同的加工工藝對(duì)醬排骨的蛋白體外消化率、酶解粒徑及消化產(chǎn)物均存在顯著影響。蒸制和炸制是常見的2種熟化方式，其加熱溫度不同，對(duì)產(chǎn)品的品質(zhì)及營養(yǎng)特性具有重要影響。本文以海鱸魚為研究對(duì)象，選取背部肌肉，采用體外模擬胃腸消化模型，研究蒸制和炸制2種常見的熟化方法對(duì)海鱸魚肉體外消化特性的影響，旨在為海鱸魚食品化菜品的開發(fā)提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮海鱸魚購于錦州市林西街水產(chǎn)市場，每尾長(20±5) cm，尾重約1 kg。色拉油購于錦州市萬達(dá)超市。甲醛,天津市大茂化學(xué)試劑廠；尼羅藍(lán)、α-淀粉酶,上海阿拉丁試劑公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶,上海Sigma-Aldrich公司；膽鹽,北京沃凱生物科技有限公司；NaOH、無水乙醇、CuSO4、K2SO4、三氯乙酸、濃H2SO4(均為分析純),國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；FeCl2,上海薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司；菲洛嗪,上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DIVHS-I體外仿生動(dòng)態(tài)人胃模擬消化系統(tǒng),蘇州曉東宜健儀器設(shè)備有限公司；Biofuge stratos臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),美國Thermo Fisher Scientific公司；FOSS 8400型全自動(dòng)定氮儀,丹麥FOSS公司；NanoBrook 90 Plus激光粒度儀,美國布魯克海文儀器公司；LSM 510激光掃描共聚焦顯微鏡,德國卡爾·蔡司股份公司；XE-70原子力顯微鏡,韓國Park Systems公司；UV-2550紫外可見光分光光度計(jì),島津儀器(蘇州)有限公司；ZB-20型數(shù)顯恒溫水浴鍋,諸城市瑞恒食品機(jī)械廠；MS105DU分析天平,梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

取海鱸魚背部肌肉，切成大小均勻的魚塊(5 cm×5 cm×1.5 cm)，洗凈瀝干后，分別進(jìn)行蒸制和炸制處理，并以未經(jīng)處理的新鮮魚塊為對(duì)照組。將魚塊擺放在帶孔不銹鋼盤中，置于蒸鍋中加熱12 min，取出用濾紙吸去表面水分得到蒸制樣品；將魚塊浸沒于預(yù)先加熱至180 ℃的油中油炸4 min，取出用吸油紙充分吸去樣品表面油分得到炸制樣品。

1.3.2 體外模擬消化模型

參考MINEKUS等[9]的方法，按照表1分別配制唾液模擬液(simulated saliva fluid，SSF)、胃液模擬液(simulated intestinal fluid,SGF)及腸液模擬液(simulated intestinal fluid,SIF)的原液。最終的SSF中α-淀粉酶的濃度為150 U/mL，SGF中胃蛋白酶的濃度為4 000 U/mL，SIF中胰蛋白酶和膽鹽的濃度分別為200 U/mL和20 mmol/L。

取210 g魚肉樣品放入食品料理機(jī)中，加入80 mL唾液模擬液，在8檔攪拌30 s，模擬口腔消化。然后取攪拌后的樣品200 g放入模擬消化系統(tǒng)中的胃模型內(nèi)，進(jìn)行胃、十二指腸消化120 min，模型中空腹胃液為20 mL，累計(jì)流加胃液280 mL，腸液552 mL。設(shè)備運(yùn)行參數(shù)[10]：胃部滾輪轉(zhuǎn)速12 r/min；擠壓板擠壓頻率和深度為5 次/min和25 mm；傾斜角0～30 min右傾斜30°，30～60 min右傾斜22.5°，60～90 min傾斜15°，60～120 min傾斜7.5°；幽門擠壓頻率為2次/min，擠壓末端位置25 mm，擠壓張開位置10 mm；腸部滾輪轉(zhuǎn)速為12 r/min。消化進(jìn)行30、60、90和120 min時(shí)分別于十二指腸處收集相應(yīng)的消化樣品，然后在4 ℃、8 000×g下離心15 min，分離沉淀和上清液，在-80 ℃冰箱貯存，備用。

表1 模擬消化液原液制備表Table 1 Preparation of stock solutions of simulated digestion fluids

1.3.3 蛋白質(zhì)體外消化率的測定

采用凱氏定氮法[11](GB 5009.5—2016)測定樣品中總氮含量，每組3個(gè)平行。參考劉萍等[12]的方法，蛋白體外消化率以消化前樣品中蛋白質(zhì)含量M1與消化后沉淀物中蛋白質(zhì)含量M2來計(jì)算，如公式(1)所示：

(1)

1.3.4 粒徑的測定

參照BELICIU等[13]的方法進(jìn)行粒徑的測定。取不同消化時(shí)間的樣品上清液，稀釋20倍后，采用激光粒度儀測定平均粒徑，每組6個(gè)平行。

1.3.5 激光共聚焦顯微鏡觀察

采用激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscopy，CLSM)觀察魚肉蛋白消化液的微觀結(jié)構(gòu)，參考楊小斌等[14]和LIU等[15]的方法略有修改。用無水乙醇配制0.1%的尼羅藍(lán)染色劑，在4 ℃下避光保存。取1 mL消化液樣品，添加40 μL尼羅藍(lán)染色劑，充分混勻后取1滴置于載玻片中央，然后用LSCM觀察其微觀結(jié)構(gòu)。激發(fā)波長為633 nm，接收波長為680 nm。

1.3.6 硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)值的測定

參考張?jiān)婗10]的方法進(jìn)行測定。準(zhǔn)確量取5 mL消化樣品上清液，加入15 mL三氯乙酸(75 g/L)和乙二胺四乙酸二鈉(10 g/L)的混合液，混勻后靜置過濾，取濾液2.5 mL，加入0.02 mol/L的10 g/L溶液2.5 mL，搖勻后在90 ℃水浴中反應(yīng)50 min，取出冷卻至室溫，在532 nm處測定樣品吸光值。TBA值用每升樣品中丙二醛(malondialdehyde,MAD)的毫克數(shù)表示。

1.3.7 Fe2+螯合能力的測定

參考XING等[16]的方法略有修改。準(zhǔn)確量取3.7 mL消化樣品上清液，加入0.2 mL 5 mmol/L菲洛嗪和0.1 mL 2 mmol/L FeCl2，充分混勻后在室溫下靜置10 min，然后在562 nm處測定樣品吸光值。以去離子水替代消化液作為空白組。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2013軟件、Origin 8.5軟件和SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、作圖及顯著性分析；采用Gwyddion 2.53對(duì)圖片進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白消化率的變化

蛋白質(zhì)的消化率是衡量肉品蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)之一，它反映了食物中蛋白質(zhì)在消化道內(nèi)被蛋白酶酶解的程度，蛋白質(zhì)的消化率越高，表示其被機(jī)體的消化吸收率越大[17]。由圖1可知，隨著消化時(shí)間的延長，各組魚肉的蛋白體外消化率均顯著上升。和新鮮魚肉樣品相比，蒸制和炸制處理顯著提高了蛋白質(zhì)的消化率(P<0.05)，這是由于魚肉蛋白對(duì)消化酶的敏感性取決于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，經(jīng)熟化處理后魚肉蛋白發(fā)生適度熱變性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)部分展開，使更多的水解位點(diǎn)暴露，有利于蛋白酶的水解作用而被人體消化吸收。當(dāng)消化進(jìn)行到終點(diǎn)時(shí)，炸制樣品的蛋白消化率顯著高于其他2組(P<0.05)，由于胃蛋白酶和胰蛋白酶專一性的差異，后期模擬腸液消化階段胰蛋白酶對(duì)炸制樣品的蛋白消化速率明顯增大，而蒸制樣品和新鮮樣品之間無顯著差異(P>0.05)，說明未經(jīng)熟化的魚肉同樣能夠被人體充分消化吸收，但消化速率相對(duì)較慢。這與韋婕妤[18]關(guān)于熱處理對(duì)羊肉蛋白消化率的影響結(jié)果相類似。

圖1 蒸制和炸制對(duì)魚肉體外模擬消化后蛋白消化率的影響Fig.1 Effects of steaming and frying on protein digestibility of fish muscle after simulated digestion in vitro注：不同的小寫字母表示組間的差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 粒徑的變化

粒徑大小是衡量消化產(chǎn)物的重要指標(biāo)，可間接反映樣品的消化程度。不同熟化方式對(duì)海鱸魚肉體外模擬消化后蛋白質(zhì)聚集體粒徑的影響如圖2所示。由圖2可知，隨著消化時(shí)間的延長，各組樣品的粒徑均顯著降低(P<0.05)。在消化的前60 min內(nèi)，炸制樣品組消化后蛋白聚集體的粒徑最大，其次是新鮮樣品組，蒸制樣品組最小，這可能是由于較長時(shí)間的高溫炸制促進(jìn)了魚肉蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)或聚集，阻礙了蛋白質(zhì)的水解作用。隨著消化時(shí)間的進(jìn)一步延長，新鮮樣品組的粒徑明顯高于其他2組(P<0.05)，可能是由于蒸制和炸制使蛋白質(zhì)發(fā)生適度變性，有利于蛋白酶的水解作用。在消化達(dá)到120 min時(shí)，炸制樣品組的粒徑最小。由此說明，消化前期主要進(jìn)行的胃消化階段對(duì)蒸制樣品的蛋白消化降解影響較大，促進(jìn)蛋白質(zhì)分解形成粒徑較小的聚集體，而消化后期主要進(jìn)行的腸消化階段對(duì)炸制樣品的消化影響更大,這與蛋白消化率的變化趨勢相類似。

圖2 蒸制和炸制對(duì)魚肉體外模擬消化后粒徑的影響Fig.2 Effects of steaming and frying on particle size of fish muscle after simulated digestion in vitro

2.3 激光共聚焦顯微鏡觀察微觀結(jié)構(gòu)的變化

激光共聚焦顯微鏡技術(shù)因其先進(jìn)的光學(xué)切片和三維重建技術(shù)可直觀獲得樣品清晰的微觀結(jié)構(gòu)，成為現(xiàn)代食品科學(xué)研究中最有效的熒光顯微成像工具之一[19]。蒸制和炸制處理對(duì)海鱸魚肉體外模擬消化后微觀結(jié)構(gòu)的影響如圖3所示，圖中紅色熒光亮點(diǎn)表示被尼羅藍(lán)染色后的蛋白顆粒。由圖3可見，新鮮魚肉樣品消化液中觀察到的紅色熒光亮點(diǎn)較少，可能是因?yàn)樾迈r魚肉的消化率相對(duì)較低，蛋白聚集成團(tuán)后沉積在某處，分散不均勻所致。消化30 min時(shí)，蒸制樣品消化液中含有許多呈碎片狀的蛋白粒子，且分布較為均勻，說明消化初期蛋白質(zhì)消化不夠徹底，存在較多的大顆粒蛋白聚集體，但隨著消化時(shí)間的延長，蒸制樣品中紅色熒光亮點(diǎn)顯著減少，說明蛋白質(zhì)的消化程度明顯提高。炸制樣品消化30 min時(shí)，蛋白粒子被透明圓形包裹，這可能是由于經(jīng)油炸后樣品中的含油量增大，將蛋白顆粒包裹其中，在消化60和90 min時(shí)仍有較多較大的顆粒聚集體，說明蛋白消化仍不夠徹底，而在消化120 min時(shí)樣品中呈現(xiàn)出少量的細(xì)小顆粒。

圖3 蒸制和炸制對(duì)魚肉體外模擬消化后微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.3 Effects of steaming and frying on microstructure of fish muscle after simulated digestion in vitro注：空白組是指未加魚肉樣品的模擬消化液

2.4 TBA值的變化

脂質(zhì)易受自由基的攻擊而分解產(chǎn)生氫過氧化物，氫過氧化物進(jìn)一步分解而產(chǎn)生醛、酮、和醇類等次級(jí)產(chǎn)物[20]，其中TBA測定法是利用TBA試劑與脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的丙二醛類物質(zhì)相結(jié)合，發(fā)生顯色反應(yīng)，從而評(píng)價(jià)魚肉脂質(zhì)的氧化程度。圖4反映的是蒸制和炸制處理對(duì)海鱸魚肉體外模擬消化液硫代巴比妥酸值的影響。由圖4可知，在消化的前90 min內(nèi)，隨著消化時(shí)間的延長，各組樣品消化液的TBA值逐漸升高，這是因?yàn)轸~肉中含有的血紅素、金屬離子等物質(zhì)，在魚肉消化時(shí)可以作為助氧劑與催化劑，促進(jìn)脂質(zhì)氧化[21]。但消化120 min時(shí)，3組樣品消化液的TBA值均又顯著降低，可能是因?yàn)樵谖改c消化過程中魚肉蛋白發(fā)生了強(qiáng)烈的水解作用，產(chǎn)生了很多抗氧化肽類物質(zhì)，從而使脂肪氧化受到抑制[22]。和新鮮魚肉樣品相比，蒸制和炸制處理均顯著提高了消化液的TBA值(P<0.05)，說明這2種熟化方式均促進(jìn)了魚肉脂肪的氧化反應(yīng)，其中炸制處理組的TBA值最大，這是因?yàn)橛驼囟认鄬?duì)較高，使油脂氧化程度增強(qiáng)[23]，此外，由于油炸過程中有少量油脂附著在魚肉表面也可能使炸制樣品組的TBA值增大。

圖4 蒸制和炸制對(duì)魚肉體外模擬消化后TBA的影響Fig.4 Effects of steaming and frying on TBA value of fish muscle after simulated digestion in vitro

2.5 Fe2+螯合能力的變化

Fe2+螯合能力是反映體系抗氧化活力的一個(gè)重要指標(biāo)。Fe2+能與菲洛嗪結(jié)合形成紫色復(fù)合物，在562 nm處具有最大吸收峰，其吸光值越小，說明樣品的抗氧化能力越強(qiáng)[24]。圖5反映的是不同熟化方式對(duì)海鱸魚肉體外模擬消化后Fe2+螯合能力的影響。由圖5可見，隨著消化時(shí)間的延長，各組樣品的Fe2+螯合能力顯著增大，說明魚肉樣品經(jīng)體外模擬消化促使蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生許多的小肽和游離氨基酸，有些具有良好的抗氧化活性[25]。QIAN等[26]研究表明，一些小分子短肽中暴露的中性和酸性氨基酸，其結(jié)構(gòu)中含有的游離羧基能夠抑制金屬離子誘導(dǎo)自由基產(chǎn)生，從而具有較強(qiáng)的Fe2+螯合能力。在消化的前60 min內(nèi)，炸制樣品消化液的Fe2+螯合能力顯著低于蒸制和新鮮海鱸魚肉樣品(P<0.05)，可能是油炸處理促進(jìn)了自由基的產(chǎn)生及脂質(zhì)氧所導(dǎo)致的。當(dāng)消化進(jìn)行到終點(diǎn)時(shí)，蒸制和炸制樣品的Fe2+螯合能力明顯高于對(duì)照組，可能是由于后期消化階段促使肉分解產(chǎn)生大量含有中性和酸性氨基酸的小肽，從而使其抗氧化能力增強(qiáng)。

圖5 蒸制和炸制對(duì)海鱸魚肉體外模擬消化后Fe2+ 螯合能力的影響Fig.5 Effects of steaming and frying on Fe2+ chelating capacity of fish muscle after simulated digestion in vitro

3 結(jié)論

與對(duì)照組相比，蒸制和炸制處理均顯著提高了海鱸魚肉體外模擬消化后的蛋白消化率(P<0.05)，顯著降低了消化液中蛋白質(zhì)聚集體的粒徑(P<0.05)，更有利于人體的消化吸收，其中消化后期模擬腸液階段對(duì)炸制樣品的消化速率明顯增大；隨著體外模擬消化時(shí)間的延長，蛋白質(zhì)聚集體逐漸被分解成細(xì)小的顆粒，分散于消化液中。經(jīng)體外模擬消化后樣品的TBA值隨消化時(shí)間的延長呈先增大后又降低的趨勢，表明體外模擬消化加速了脂質(zhì)氧化，其中炸制樣品組脂肪氧化程度較高；隨消化時(shí)間的延長，樣品的Fe2+螯合能力明顯提高，其中蒸制樣品在消化終點(diǎn)時(shí)的Fe2+螯合能力最大，其抗氧化性較強(qiáng)。