李凱，商佳胤，田淑芬，黃建全，張娜，王丹，蘇宏，王超霞

1(天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，天津，300384)2(天津農(nóng)學(xué)院園藝園林學(xué)院，天津，300384)

香氣是葡萄果實(shí)風(fēng)味、品種特性的重要組成部分，按照香氣類型可將葡萄品種劃分為玫瑰香型、草莓香型和中性香型[1]。香氣成分由多種揮發(fā)性物質(zhì)組成，主要包括醛類、醇類、酯類、酮類和萜烯類等[2]，只有濃度超過呈香閾值的少數(shù)物質(zhì)對(duì)香味起決定作用。目前葡萄果實(shí)香氣研究主要集中在生長發(fā)育期香氣積累規(guī)律[2-5]、品種特征香氣[6-9]、產(chǎn)地對(duì)香氣影響[10-11]、栽培管理方式對(duì)香氣影響[12-13]等方面，結(jié)果表明生長期、品種、產(chǎn)地及栽培管理方式等均影響香氣積累。然而，將香氣成分實(shí)際濃度與呈香閾值相結(jié)合，研究特定產(chǎn)區(qū)內(nèi)多種香型葡萄果實(shí)的呈香成分及香氣描述的報(bào)道較少。

天津是環(huán)渤海優(yōu)勢葡萄產(chǎn)區(qū)，代表性品種玫瑰香的種植面積超過13 km2，主栽品種還包括維多利亞等中性香型品種和巨峰等草莓香型品種，產(chǎn)區(qū)內(nèi)各香型葡萄果實(shí)的呈香成分尚不明確。本研究以天津產(chǎn)區(qū)中性香型、玫瑰香型和草莓香型主栽葡萄品種為對(duì)象，采用頂空固相微萃取(headspace-solid phase microextraction, HS-SPME)及氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)技術(shù)，內(nèi)標(biāo)-標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量并結(jié)合氣味活度值(odor activity value, OAV)和香氣輪廓分析等方法，分析葡萄成熟期果實(shí)香氣成分，為天津產(chǎn)區(qū)優(yōu)良品種選育、高品質(zhì)葡萄生產(chǎn)以及葡萄深加工產(chǎn)業(yè)發(fā)展等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 果實(shí)及取樣

葡萄果實(shí)樣品包括中性香型品種紅巴拉多和維多利亞，玫瑰香型品種玫瑰香、碧香無核、貴妃玫瑰、亞歷山大和香妃，草莓香型品種巨峰、黑色甜菜、戶太八號(hào)和夏黑。根據(jù)歷年物候期和可溶性固形物含量綜合判斷不同品種的成熟期，葡萄果實(shí)于2017年7～8月成熟期采自天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院武清試驗(yàn)基地和北辰雙街示范基地，該年度平均降水量521.5 mm、年平均氣溫13.8 ℃，接近常年平均降水量550.0 mm及常年平均氣溫13.1 ℃，無極端氣候條件發(fā)生，且樣品主要采集于日光溫室內(nèi)，受氣候因素影響較小，因此該年度采樣數(shù)據(jù)具有一定代表性。采樣時(shí)兼顧果穗的上中下部位和陰陽面，隨機(jī)采集30粒，重復(fù)3次，用液氮速凍，置于-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.1.2 試劑與設(shè)備

無水乙醇、NaCl(均為色譜純)，國藥集團(tuán)；表1中所列54種標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純)和內(nèi)標(biāo)2-辛醇(色譜純)，美國Sigma-Aldrich公司；5977A-7890B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、CTC自動(dòng)進(jìn)樣裝置、色譜柱(HP-5MS, 30 m×0.25 mm×0.25 μm)，美國Agilent公司；萃取頭(50/30 μm DVB/CAR/PDMS型)，美國Supelco公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

樣品置于室溫下解凍，除梗后破碎榨汁，按60 mg/L加入SO2(抗氧化)，取混合液8 mL加入頂空瓶中，加入2.4 g NaCl和8 μL內(nèi)標(biāo)物2-辛醇(180 mg/L，無水乙醇稀釋)，頂空瓶加蓋密封后待測。

1.2.2 色譜條件

載氣為高純氦氣，純度≥99.999%，流速1.0 mL/min，分流比為5∶1；升溫程序?yàn)?5 ℃保持2 min，以4 ℃/min 升至200 ℃，以30 ℃/min升至250 ℃，保持 5 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃。

1.2.3 質(zhì)譜條件

離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度250 ℃；電子轟擊源70 eV；掃描范圍30～300 amu。

1.2.4 定性定量分析

數(shù)據(jù)采集采用CTC自動(dòng)進(jìn)樣裝置，45 ℃預(yù)熱5 min，磁力攪拌子轉(zhuǎn)速為250 r/min(攪拌間歇式運(yùn)行，轉(zhuǎn)5 s，停2 s)，45 ℃萃取50 min，然后GC進(jìn)樣，250 ℃解吸2 min，采集數(shù)據(jù)。定性分析利用未知物分析軟件(美國 Agilent 公司)，將未知揮發(fā)性成分的質(zhì)譜圖與NIST 11.L譜庫(美國 Agilent 公司)中的標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行匹配，匹配因子高于80(最高100)時(shí)，通過相同GC-MS條件下標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和質(zhì)譜圖進(jìn)一步比對(duì)確認(rèn)。定量分析采用內(nèi)標(biāo)-標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，54種標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線均由5點(diǎn)繪制，由化學(xué)工作站計(jì)算定量結(jié)果。

1.2.5 氣味活性值

OAV是香氣成分含量與嗅覺閾值的比值[14]。OAV≥1的成分被視為活性呈香成分。

1.2.6 果實(shí)香氣輪廓

參照葡萄酒香氣輪盤[15]及葡萄酒品嘗工具酒鼻子中的香氣分類[16]，同時(shí)結(jié)合本研究涉及揮發(fā)性化合物的氣味描述，將香氣劃分為花卉類、水果類等8個(gè)氣味系列。某個(gè)活性呈香成分可能對(duì)應(yīng)一個(gè)或多個(gè)氣味系列，將其OAV賦予相對(duì)應(yīng)的系列(對(duì)應(yīng)多個(gè)系列時(shí)，視為對(duì)每個(gè)系列的貢獻(xiàn)相同)，利用8個(gè)氣味系列及各自累計(jì)獲得的OAV構(gòu)建果實(shí)香氣輪廓[17-18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 香氣定量分析

葡萄果實(shí)中共定性定量54種香氣成分，香氣成分按照結(jié)構(gòu)和特性分為7類。如圖1所示為濃度最高的四類，中性品種的醇類濃度最高，醛類次之；玫瑰香型品種中除玫瑰香外均為醛類濃度最高，其次為醇類和萜烯類，酯類最低，而玫瑰香則是萜烯類最高，其次為醛類和醇類，值得注意的是，所有玫瑰香型品種果實(shí)的萜烯類濃度均顯著高于其他品種；草莓香型中以酯類香氣為主，并且酯類濃度和香氣成分總濃度均顯著高于其他品種，此外醇類和醛類含量較高，萜烯類含量最低。

由表1可知，參試品種葡萄香氣成分總質(zhì)量濃度在1.23 mg/L(紅巴拉多)～24.46 mg/L(黑色甜菜)，酯類數(shù)量最多，醇類次之。醇類中，從含量和閾值來看，1-己醇和反式-2-己烯-1-醇是2種主要香氣貢獻(xiàn)成分，此外，2-苯乙醇的濃度在草莓香型中顯著高于其他品種，但均低于閾值。酯類中，乙酸乙酯濃度最高，但品種間差異大，草莓香型品種的乙酸乙酯含量均值是其他品種均值的91.78倍，此外，草莓香型品種的酯類數(shù)量、酯類含量與總含量比值也顯著高于其他品種。萜烯類中，里那醇在玫瑰香型品種中濃度最高，濃度均值是其他香型品種的29.67倍，差異顯著。醛類中，反式-2-己烯醛濃度最高，正己醛次之，所有醛類成分在全部品種均能檢測到。

圖1 葡萄果實(shí)中香氣成分比較Fig.1 Comparison of aroma component content in grapes

表1 葡萄果實(shí)的香氣成分濃度Table 1 Concentrations of aroma components determined in grapes

續(xù)表1

2.2 活性呈香成分分析

葡萄果實(shí)中香氣成分種類很多，成分間不僅濃度差異大，嗅覺閾值也不同(表1)。風(fēng)味強(qiáng)度取決于濃度和閾值，只有濃度達(dá)到可以被感知時(shí)(OAV≥1)，該成分才被視為活性呈香成分[33]。54種香氣成分中只有22種為活性呈香成分(表2)，包括3種醇類、8種酯類、6種萜烯類和5種醛類。不同品種的活性呈香成分?jǐn)?shù)量存在一定差異，中性品種最少(8和11)；玫瑰香型品種中等(12～15，平均13.4)，但活性萜烯類數(shù)量高于其他香型品種，其中里那醇對(duì)玫瑰香型品種中的花卉類和水果類氣味貢獻(xiàn)最大(OAV>30)；草莓香型品種較多(14～17，平均16.0)，其中酯類數(shù)量高于其他香型品種，異丁酸乙酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯和己酸乙酯雖然濃度不高，但閾值較低，氣味活性值相對(duì)較高，而乙酸乙酯雖然濃度極高，但閾值也極高，因此氣味活性值較低，這些酯類主要為草莓香型品種貢獻(xiàn)水果類氣味。反式-2-己烯-1-醇、1-辛烯-3-醇、己酸乙酯、正己醛、反式-2-己烯醛、正庚醛和苯乙醛在所有品種中的OAV均>1，雖然品種間存在差異，但與香氣類型相關(guān)性不強(qiáng)，其中正己醛和反式-2-己烯醛的氣味活性值較高(除了紅巴拉多，其他品種OAV均>30)，對(duì)植物類氣味貢獻(xiàn)最大。

表2 活性呈香成分的OAVTable 2 Odor activity value of active aroma components

2.3 果實(shí)香氣輪廓分析

由圖2可知，各品種果實(shí)香氣輪廓存在差異。整體來看，11個(gè)品種中有9個(gè)植物類氣味活性值最高，另外2個(gè)品種玫瑰香和黑色甜菜的水果類氣味活性值最高。

紅巴拉多、維多利亞、貴妃玫瑰、亞歷山大和夏黑前4種氣味系列強(qiáng)度均為植物類>脂肪類>水果類>花卉類，香氣輪廓較為相似，均有突出植物類氣味，但也存在差異，紅巴拉多的這4種氣味系列強(qiáng)度均極低，維多利亞的水果類和花卉類氣味強(qiáng)度極低，貴妃玫瑰和亞歷山大的水果類和花卉類氣味強(qiáng)度較高但亞歷山大的整體氣味強(qiáng)度高于貴妃玫瑰，而夏黑的花卉類氣味強(qiáng)度很低。碧香無核和香妃前4種氣味系列強(qiáng)度均為植物類>水果類>花卉類>脂肪類(圖2-a)，但香妃的整體氣味強(qiáng)度高于碧香無核。巨峰和戶太八號(hào)前4種氣味系列強(qiáng)度均為植物類>水果類>脂肪類>花卉類(圖2-b)，但戶太八號(hào)的植物類和水果類氣味強(qiáng)度高于巨峰。玫瑰香(圖2-c)的前4種氣味系列強(qiáng)度為水果類>花卉類>植物類>脂肪類，水果類和花卉類氣味尤其突出。黑色甜菜(圖2-d)的前4種氣味系列強(qiáng)度為水果類>化學(xué)類>植物類>脂肪類，水果類和化學(xué)類氣味最為突出。

a-紅巴拉多、碧香無核、香妃；b-維多利亞、貴妃玫瑰、亞歷山大；c-玫瑰香、巨峰、戶太八號(hào)；d-黑色甜菜、夏黑圖2 不同品種葡萄果實(shí)的香氣輪廓Fig.2 Aroma profiles of grapes from different cultivars

3 討論

葡萄果實(shí)中含有大量揮發(fā)性成分，且大多數(shù)濃度很低，通常在GC-MS分析前采用適宜濃縮富集手段對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理。本研究中采用的SPME技術(shù)集采樣、萃取、濃縮、進(jìn)樣于一體，簡便、快速、無溶劑、選擇性好且靈敏度高[45]，并選取在葡萄或葡萄汁香氣分析中廣泛應(yīng)用的50/30 μm CAR/DVB/PDMS萃取頭[3,17-18,46-48]，在11個(gè)葡萄品種果實(shí)中共定性定量了54種香氣成分，基本涵蓋了醛類、醇類、酯類和萜烯類等葡萄果實(shí)中的主要揮發(fā)性成分，并且通過香氣對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，每種香型都有對(duì)應(yīng)的特征香氣成分。

玫瑰香型與萜類物質(zhì)及其含量密切相關(guān)，其中含量最豐富的是單萜，常見單萜醇類包括里那醇、香葉醇、橙花醇、香茅醇和α-萜品醇[49]，F(xiàn)ENOLL等[4]通過對(duì)玫瑰香葡萄果實(shí)發(fā)育過程中單萜化合物種類、含量變化及香氣貢獻(xiàn)值的研究，認(rèn)為里那醇是香氣貢獻(xiàn)最大的單萜化合物；譚偉等[8]和BARBERA等[50]均認(rèn)為里那醇和香葉醇是玫瑰香味的主要貢獻(xiàn)成分。本研究中玫瑰香型品種的里那醇及萜烯類含量均顯著高于其他品種，但所有品種中均可檢測到里那醇，只不過玫瑰香型品種的里那醇OAV均>30，其他品種中只有戶太八號(hào)OAV>1且僅為8.78，因此里那醇是玫瑰香型品種貢獻(xiàn)花卉類和水果類氣味最重要的萜烯類成分但并非特異性成分。香茅醇和香葉醇也是玫瑰香型品種中的重要活性呈香成分，但是和里那醇類似，它們并不是該香型品種獨(dú)有的，所有草莓香型品種中同樣能檢測到且濃度均高于閾值。

草莓香型主要存在于美洲種葡萄及與其他種的雜交品種果實(shí)中，特征香氣物質(zhì)主要是酯類物質(zhì)[51-52]。張文文等[18]認(rèn)為芳樟醇和C13類、2-甲基丁酸乙酯、丁酸乙酯分別是夏黑、藤稔、巨峰的主要香氣貢獻(xiàn)化合物。本研究中草莓香型品種的水果類氣味主要由酯類貢獻(xiàn)，包括丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、異丁酸乙酯、己酸乙酯、異戊酸乙酯、乙酸乙酯和丙酸乙酯，其中乙酸乙酯濃度最高，但閾值也高，因此香氣貢獻(xiàn)較低，丁酸乙酯和己酸乙酯不是草莓香型品種特有的，在其他品種中同樣能檢測到并且濃度高于閾值。

中性品種葡萄果實(shí)中萜類物質(zhì)和酯類物質(zhì)少，而且濃度低或者幾乎沒有，主要是C6化合物占了香氣物質(zhì)的絕大多數(shù)[53]。OLIVEIRA等[54]認(rèn)為己醛、己醇、2-己烯醛等C6化合物是葡萄果實(shí)中一類重要的風(fēng)味化合物，對(duì)于評(píng)價(jià)葡萄品質(zhì)、判定原產(chǎn)地等方面具有重要價(jià)值。本研究中醇類和醛類是中性品種的主要香氣成分，4種C6化合物1-己醇、反式-2-己烯-1-醇、己醛和反式-2-己烯醛的濃度最高，與朱駿馳[53]的觀點(diǎn)一致；己醛和反式-2-己烯醛由于其閾值較低，是最具活性的C6化合物，與WU等[17]結(jié)論一致。此外，1-辛烯-3-醇、正庚醛和苯乙醛也是活性呈香成分。中性品種的上述活性呈香成分在其他香型品種中同樣具有活性，因此屬于基礎(chǔ)香氣成分，主要貢獻(xiàn)植物類的背景香氣。

4 結(jié)論

天津產(chǎn)區(qū)中性香型、玫瑰香型和草莓香型葡萄品種的果實(shí)香氣成分、活性呈香成分和香氣輪廓均存在一定差異。中性品種香氣成分?jǐn)?shù)量最少，以C6醇醛類為主，香氣輪廓也以醇醛類貢獻(xiàn)的植物類背景氣味為主；玫瑰香型品種中萜烯類成分濃度顯著高于其他香型品種，其中里那醇是為玫瑰香型品種貢獻(xiàn)花卉類和水果類氣味最重要的呈香化合物；草莓香型品種中含有大量酯類成分，其中丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、異丁酸乙酯、己酸乙酯、異戊酸乙酯、乙酸乙酯和丙酸乙酯是為草莓香型品種貢獻(xiàn)水果類氣味的重要呈香化合物。