陳麗霞，許麗建

(瓊臺師范學院 數(shù)理系，海南 ?？冢?71100)

動物源食品是人體補充蛋白質(zhì)的主要來源，生活中常見的動物源食品包括肉類、蛋類和奶類等[1-2]。近年來動物源食品中各類農(nóng)藥殘留引起的質(zhì)量安全問題被廣泛關注[3]，一方面，農(nóng)藥在農(nóng)作物中使用以后，其殘留可能通過食物鏈進入到動物源食品中[4-5]；另一方面，部分農(nóng)藥可以直接作為動物源食品生產(chǎn)中的殺蟲劑、消毒劑等[6]，引發(fā)殘留風險。因此，為保障動物源食品的質(zhì)量安全，迫切需要開展動物源食品中農(nóng)藥殘留的檢測分析方法相關的研究。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有靈敏度高、分析速度快等優(yōu)點，可同時測定多種農(nóng)藥殘留，近年來被廣泛應用于各類植物源和動物源食品的檢測分析[7-9]。動物源食品通常包括肉類、內(nèi)臟、蛋類和奶類等，其脂肪、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分含量較高，在農(nóng)藥殘留分析時需要凈化處理以減少其干擾。我國國家標準《GB/T 20772—2008 動物肌肉中461種農(nóng)藥及相關化學品殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》等報道中使用凝膠滲透色譜(gel permeation chromatography,GPC)法對樣品進行凈化處理[10-12]，此外，固相萃取(solid phase extraction,SPE)法[13-15]、QuEChERS法[16-18]在動物源食品檢測中也表現(xiàn)出很好的凈化效果。

噻菌靈(thiabendazole)屬苯咪唑類殺菌劑，是一種內(nèi)吸性植物殺菌劑[19]，也是動物生長中的廣譜性抗寄生蟲藥[20-21]。本實驗選擇噻菌靈及其代謝物5-羥基噻菌靈(5-hydroxythiabendazole)，分子結(jié)構(gòu)式見圖1。對比研究GPC、SPE和QuEChERS 3種凈化方法在豬肉、雞蛋、牛奶、豬肝和雞肉中的凈化效果，為動物源食品的前處理方法提供技術(shù)支持。

圖1 噻菌靈和5-羥基噻菌靈的分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular of thiabendazole and 5-hydroxythiabendazole

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與樣品

實驗儀器：超高壓液相色譜系統(tǒng)，Waters公司；AB SCIEX API4000+質(zhì)譜系統(tǒng)，AB公司；ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm×1.7 μm)Waters公司；GPC VARIO凝膠滲透色譜儀,德國LCTech；高速勻漿機,IKA公司；多管旋渦混合器，北京同德創(chuàng)業(yè)科技公司；高速離心機，日本日立公司；旋渦混合儀，上海滬西分析儀器廠。

實驗用水均為超純水，Millipore，USA公司；乙腈、甲醇(色譜純)，F(xiàn)isher Scientific試劑公司；PSA吸附劑(N-丙基乙二胺，分析純)，Biocomma公司；C18吸附劑(40～63 μm)，上海Anpel公司；NaCl、無水MgSO4(分析純)，廣州化學試劑廠。

噻菌靈和5-羥基噻菌靈農(nóng)藥標準品,購自德國Dr.Ehrenstorfer公司。

豬肉(瘦肉)、雞蛋、牛奶、豬肝和雞肉,均購自?？诒镜厥袌觯i肉、豬肝和雞肉使用絞肉機粉碎，雞蛋使用勻漿機攪勻，制成待測樣。

1.2 分析方法

1.2.1 樣品的提取

準確稱取豬肉、雞蛋、牛奶、豬肝或雞肉樣品各5.00 g(精確到0.01 g)放入50 mL離心管中，加入25.0 mL乙腈溶劑進行提取，使用高速勻漿機在15 000 r/min下勻漿1 min。為降低樣品中的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的影響，在樣品中再加入2～3 g NaCl，繼續(xù)在15 000 r/min下勻漿1 min。將離心管在4 000 r/min下離心5 min，使液體和固體相完全分離，同時使有機相與水相分層，取上層乙腈相溶液待凈化。

1.2.2 樣品的凈化

(1)GPC法

取10 mL乙腈提取液在50 ℃減壓蒸干，用乙酸乙酯+環(huán)己烷(體積比1∶1)溶液定容至5 mL，使用GPC凈化。GPC選擇Bio-BeadsS-X3(38～75 μm)作為填料，規(guī)格為400 mm×25 mm；使用乙酸乙酯+環(huán)己烷(體積比1∶1)作為流動相，流速為5 mL/min；淋洗的預沖時間為15 min，收集時間為10 min。GPC樣品在收集后，于50 ℃減壓蒸干，用乙腈溶液定容至10.0 mL溶解后，過0.22 μm微孔有機濾膜后上機測定。

(2)SPE法

取5 mL乙腈提取液在50 ℃減壓蒸干，用固相萃取小柱進行凈化。分別用100 mg的C18吸附劑和100 mg的PSA吸附劑裝填固相萃取小柱，并在上下方別裝入250 mg無水MgSO4吸水。分別用5 mL超純水和5 mL甲醇活化萃取小柱，用2 mL甲醇溶解樣品后上樣，用10 mL甲醇溶液分3次進行淋洗。收集淋洗液在50 ℃減壓蒸干，用乙腈溶液定容至5.0 mL，過0.22 μm微孔有機濾膜后上機測定。

(3)QuEChERS法

取5 mL乙腈提取液于25 mL離心管中，依次加入500 mg的無水MgSO4去除樣品中的水分，同時加入100 mg的C18吸附劑和100 mg的PSA吸附劑進行協(xié)助凈化。劇烈旋渦振蕩2 min，將離心管在4 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，取乙腈相溶液過0.22 μm微孔有機濾膜后上機測定。

1.2.3 儀器分析條件

色譜條件：超高壓液相色譜柱選擇ACQUITY UPLC?BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，柱溫設置為25 ℃。流動相分別為乙腈(A)和0.05%甲酸水溶液(B)，流速為0.25 mL/min，以梯度洗脫模式對目標物進行洗脫，確保噻菌靈及5-羥基噻菌靈得到良好分離。洗脫程序：0～1 min，10%A變?yōu)?0%A；1～3.5 min，60%A變?yōu)?5%A；3.5～4.0 min，保持75%A；4.0～4.5 min，75%A變?yōu)?0%A；4.5～5.0 min，保持10%A。

質(zhì)譜條件：選擇電噴霧質(zhì)譜的正離子掃描和多反應監(jiān)測模式，儀器的噴霧電壓為5 000 V，霧化氣壓力為379.225 kPa，離子源溫度為550 ℃。同時監(jiān)測噻菌靈和5-羥基噻菌靈，定性、定量離子對及去簇電壓、碰撞電壓見表1。

表1 噻菌靈與5-羥基噻菌靈的主要質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Working parameter of MS for thiabendazole and 5-hydroxythiabendazole

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線及方法檢出限

以質(zhì)量濃度1 000 μg/mL的噻菌靈與5-羥基噻菌靈標準溶液作為母液，使用甲醇逐級稀釋法分別配制0.01、0.05、0.1、0.5、1.0 μg/mL系列標準溶液，以進樣標準溶液中目標物的質(zhì)量濃度(μg/mL)作為橫坐標X，以定量離子的峰面積作為縱坐標Y，繪制標準曲線，外標法進行定量。方法的典型色譜圖見圖2，線性回歸方程等相關數(shù)據(jù)見表2。為保證3種凈化方法的可比性，在相同的提取體積和樣品稀釋倍數(shù)下，噻菌靈與5-羥基噻菌靈的定量限[limit of quantitaion(LOQ)，S/N=10]分別為0.002和0.01 mg/kg。我國食品質(zhì)量安全國家標準GB 2763—2019中規(guī)定動物源性食品中噻菌靈的殘留定義為噻菌靈與5-羥基噻菌靈之和，其中最大殘留限量值的最低值為0.05 mg/kg(禽肉類)，最高值為1 mg/kg(牛腎)，本方法可滿足其檢測分析的需求。

表2 噻菌靈與5-羥基噻菌靈的線性回歸方程和定量限Table 2 Standard curves and LOQs of thiabendazole and 5-hydroxythiabendazole

a-1、a-2、a-3、a-4、a-5：噻菌靈在豬肉、雞蛋、牛奶、豬肝和雞肉樣品中的加標 回收色譜圖，b-1、b-2、b-3、b-4、b-5：5-羥基噻菌靈在豬肉、雞蛋、牛奶、 豬肝和雞肉樣品中的加標回收色譜圖，加標量均為0.01 mg/kg圖2 噻菌靈與5-羥基噻菌靈的典型色譜圖Fig.2 Typical chromatogram of thiabendazole and 5-hydroxythiabendazole

2.2 不同凈化方法的填料

本實驗選擇GPC法、SPE法和QuEChERS法3種凈化方法，其中GPC按照國家標準(GBT 20772—2008)，使用Bio-BeadsS-X3填料，依靠分子質(zhì)量(400～14 000)排阻層析，可以很好地去除脂肪等雜質(zhì)。在SPE和QuEChERS 2種凈化方法中，本實驗對比了PSA、C18對樣品的凈化效果，實驗結(jié)果見圖3?？梢钥闯觯诰褂脽o水MgSO4的情況下，SPE和QuEChERS兩種凈化方法選擇PSA與C18協(xié)助凈化的效果優(yōu)于單獨使用PSA或C18，且樣品上機液清透明亮，可以很好地保證噻菌靈和代謝物5-羥基噻菌靈的凈化效果，有效避免儀器污染，其原因可能是動物源樣品通常含有大量脂肪、蛋白質(zhì)及非極性磷脂類干擾物等雜質(zhì)，給噻菌靈及其代謝物帶來干擾。C18吸附劑在硅膠上鍵合了十八烷基官能團，對非極性干擾物具有較好去除效果，PSA吸附劑在硅膠上鍵合了乙二胺-N-丙基官能團，可吸附酸性化合物[22]。當只使用PSA或C18，樣品中雜質(zhì)的凈化效果較差，引起目標化合物回收率偏低。將C18和PSA混合使用，在SPE和QuEChERS兩種方法均表現(xiàn)出較好的凈化效果。但是與SPE法相比，QuEChERS法不需要額外裝填萃取小柱，快速、簡捷，回收率達到要求，可用于動物源食品中農(nóng)藥殘留分析的快速凈化處理。

2.3 不同凈化方法的回收率

以不含噻菌靈和5-羥基噻菌靈的豬肉、雞蛋、牛奶、豬肝和雞肉空白樣品，分別在0.01、0.05和1.0 mg/kg 3個質(zhì)量濃度進行添加回收率實驗，測試GPC法、SPE法和QuEChERS法3種凈化方法的準確度，實驗結(jié)果見表3。GPC法在實驗的3個濃度時，5次重復的平均回收率為80%～108%；SPE法在實驗的3個濃度時，5次重復的平均回收率80%～110%；QuEChERS法在實驗的3個濃度時，5次重復的平均回收率82%～107%。我國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T 788—2018農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準則中規(guī)定，添加水平在0.01、0.05和1.0 mg/kg時，回收率應分別為60%～120%、70%～120%和70%～110%。本實驗3種凈化方法對噻菌靈和5-羥基噻菌靈的添加回收率均滿足要求。

a-SPE法;b-QuEChERS法圖3 SPE和QuEChERS使用不同吸附劑對比圖Fig.3 Comparison of Purification between SPE and QuEChERS with different adsorbents

表3 噻菌靈與5-羥基噻菌靈在五種動物源食品中的添加回收率及相對標準偏差(n=5)Table 3 Recoveries and RSDs of thiabendazole and 5-hydroxythiabendazole in 5 food products of animal origin (n=5)

2.4 實際樣品的檢測

為了驗證方法在實際樣品分析中的適用性，本實驗在?？诒镜厥袌龀槿〉呢i肉、雞蛋、牛奶、豬肝和雞肉樣品各30個，使用GPC法、SPE法和QuEChERS法3種凈化方法進行前處理，并分別配制5種樣品的基質(zhì)標準溶液進行檢測，所有樣品中均未檢出噻菌靈和5-羥基噻菌靈。方法具有良好的靈敏度和的重現(xiàn)性，可滿足市場樣品檢測需求。

3 結(jié)論

動物源食品含有大量的脂肪等雜質(zhì)，尤其是對于豬背膘、豬腩等部位，其脂肪含量可達50%以上，在前處理的凈化過程需要進行脫脂及去除其他干擾雜質(zhì)[23]。本實驗中主要測試的樣品為豬瘦肉、雞蛋、牛奶、豬肝和雞肉，脂肪含量較低，PSA與C18協(xié)助凈化可以達到較好的效果，因此在提取后直接使用GPC法、SPE法和QuEChERS法3種凈化方法處理。同時，在保證分析方法靈敏度滿足需求的情況下，上機液的定容使用較大體積的溶劑，避免因濃縮帶來的雜質(zhì)干擾，大大簡化了前處理過程，提高了分析效率。此外，當遇到豬背膘等脂肪含量高的動物源樣品，可在提取時加入正己烷進行除油，其對本實驗中的非脂溶性農(nóng)藥噻菌靈的提取率影響較小，但對于其它脂溶性農(nóng)藥可能會造成回收率偏低，其影響有待進一步研究。

本實驗對比研究GPC法、SPE法和QuEChERS法3種凈化方法在豬肉、雞蛋、牛奶、豬肝和雞肉等動物源食品中噻菌靈及其代謝物殘留測定的凈化效果。其中GPC法使用Bio-BeadsS-X3填料，SPE法和QuEChERS使用PSA與C18吸附劑協(xié)助凈化，3種凈化方法在樣品分析時的回收率均滿足要求?？紤]到GPC法和SPE法需要特定的儀器或固相萃取柱，耗時費力，推薦使用快速、簡捷的QuEChERS方法進行處理，可用作噻菌靈在動物源食品中的檢測分析。