鄭光柄，王 欣，于紅松

(遵義醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院貴州省眼疾病特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099)

Behcet病(Behcet's disease,BD)為炎癥性疾病，以反復(fù)發(fā)作的口腔潰瘍、生殖器潰瘍、葡萄膜炎和皮膚損傷為主要臨床表現(xiàn)，并可累及關(guān)節(jié)、消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等[1-2]。該病好發(fā)于地中海沿岸、遠(yuǎn)東及中東地區(qū)，因其分布與古絲綢之路相吻合，故又稱絲綢之路病(Silk road disease)[3]。迄今為止，BD的發(fā)病機(jī)制尚不明確，據(jù)報(bào)道，HLA-B51是與BD相關(guān)性最強(qiáng)的易感基因，但所占風(fēng)險(xiǎn)不到20%[4]。近期研究表明，遺傳、表觀遺傳、免疫及環(huán)境因素與BD的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)[5-6]，尤其是環(huán)境因素引起的表觀遺傳修飾改變?cè)贐D的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用。

表觀遺傳學(xué)研究可遺傳的基因表達(dá)變化，而這些變化并不涉及DNA序列的改變[7]，因而表觀遺傳變化具有可逆性，這種可逆性與可控性已證實(shí)可被諸如特殊飲食、藥物及生活環(huán)境改變等方法予以糾正和逆轉(zhuǎn)[8-9]。近年來大量研究表明表觀遺傳修飾的改變?cè)谌祟惣膊〉陌l(fā)生過程中發(fā)揮重要的作用[10-12]。DNA甲基化、組蛋白修飾及非編碼RNA是表觀遺傳的三大主要調(diào)控機(jī)制，其作用是調(diào)控基因的表達(dá)和參與細(xì)胞的發(fā)育、分化以及活性的維持[13]。本文就表觀遺傳學(xué)因素(DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA)在BD發(fā)病機(jī)制中的研究進(jìn)展作一綜述。

1 DNA甲基化與BD

DNA甲基化是指DNA序列上特定的堿基在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase,DNMT)的催化作用下，以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)作為甲基供體，通過共價(jià)鍵結(jié)合的方式獲得一個(gè)甲基基團(tuán)的化學(xué)過程[14]。DNA甲基化主要發(fā)生在CpG二核苷酸中胞嘧啶上第5位碳原子上，其產(chǎn)物為5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5-mC)，DNA甲基化不改變DNA的序列，但可通過改變DNA與蛋白質(zhì)的相互作用，從而影響基因轉(zhuǎn)錄活性[15]。DNA甲基化是人類基因組中一種常見的修飾方式，在CpG二核苷酸中的發(fā)生率為70%～80%。CpG島與啟動(dòng)子相關(guān)的異常DNA甲基化可導(dǎo)致基因表達(dá)缺失，而基因表達(dá)降低是基因失活的一種關(guān)鍵機(jī)制[16]。通常情況下，啟動(dòng)子區(qū)域DNA甲基化程度與基因表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，高甲基化抑制基因表達(dá)，低甲基化則促進(jìn)基因表達(dá)[17]。

近期研究表明，全基因組水平的DNA甲基化異常參與了BD的發(fā)生。Yu等[18]采用Infinium Human Methylation 450K芯片技術(shù)分析方法，對(duì)60個(gè)BD患者和60個(gè)正常對(duì)照外周血液樣本開展了全表觀基因組關(guān)聯(lián)研究(Epigenome-wide association studies,EWAS)，鑒定了與BD相關(guān)聯(lián)的4332個(gè)差異DNA甲基化位點(diǎn)，其中547個(gè)位點(diǎn)在BD中呈現(xiàn)高甲基化，3785個(gè)位點(diǎn)在BD中呈現(xiàn)低甲基化，其中Delta-β≥0.14的位點(diǎn)共5個(gè)，包括FKBP5/cg03546163、FKBP5/cg25114611、NFIL3/ cg142905 76、RUNX2/cg23261343和FLJ43663/ cg20228731；課題組進(jìn)一步采用焦磷酸測(cè)序的方法在100例BD患者和100個(gè)正常對(duì)照者中驗(yàn)證候選的5個(gè)差異的甲基化位點(diǎn)，結(jié)果證實(shí)了候選的5個(gè)差異的甲基化位點(diǎn)與BD顯著相關(guān)，均在BD中呈現(xiàn)低甲基化，其中P值最小的位點(diǎn)為FKBP5/cg03546163(P=3.81E-13)；利用100例BD患者和100個(gè)正常對(duì)照的焦磷酸測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BD生物學(xué)標(biāo)記篩選，結(jié)果表明，其中4個(gè)差異的甲基化位點(diǎn)(cg03546163,cg25114611,cg23261343 and cg14290576)可以作為BD疾病診斷的生物標(biāo)記物(AUC=83.95%)；課題組還初步探索了異常DNA甲基化的功能：其中BD患者中低甲基化的FKBP5基因和FLJ43663基因，相對(duì)于正常對(duì)照，mRNA表達(dá)水平顯著升高；相對(duì)于未用DNA甲基化抑制劑5-氮雜-2’-脫氧胞苷(DAC)處理培養(yǎng)的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)組，DAC處理的PBMC組中FKBP5基因和FLJ43663基因的mRNA表達(dá)水平顯著升高，DAC處理的PBMC組中IL-1β的分泌顯著增加；以上研究結(jié)果均揭示了DNA甲基化異常在BD發(fā)病機(jī)制中起著非常重要的作用。Hughes[19]應(yīng)用Infinium Human Methylation 450K芯片技術(shù)，對(duì)土耳其16例年齡、性別和種族相匹配且未經(jīng)治療的BD患者和16個(gè)健康對(duì)照進(jìn)行研究，評(píng)估了單核細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞中485000個(gè)甲基化位點(diǎn)在全基因組中的甲基化狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照相比，BD患者單核細(xì)胞中有383個(gè)CpG差異表達(dá)的甲基化位點(diǎn)，包括129個(gè)高甲基化CpG位點(diǎn)和254個(gè)低甲基化CpG位點(diǎn)；在BD患者CD4+T細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了125個(gè)CpG差異甲基化位點(diǎn)，其中67個(gè)低甲基化位點(diǎn)和58個(gè)高甲基化位點(diǎn)；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，BD患者接受治療后CD4+T細(xì)胞及單核細(xì)胞的差異甲基化位點(diǎn)發(fā)生了逆轉(zhuǎn)，檢測(cè)到單核細(xì)胞共有1426個(gè)差異甲基化的CpG位點(diǎn)；其中790個(gè)為高甲基化，636個(gè)為低甲基化。在CD4+T細(xì)胞中，共有2044個(gè)CpG位點(diǎn)在治療后發(fā)生差異性甲基化，其中1032個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)高甲基化，1012個(gè)位點(diǎn)發(fā)生低甲基化；研究者還通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)的基因在兩組之間存在異常的DNA甲基化，揭示調(diào)控蛋白的多種細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)基因的異常DNA甲基化與BD的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，是BD的發(fā)病機(jī)制及其治療的基礎(chǔ)。

除了全基因組水平鑒定BD異常甲基化的研究外，最近也有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)單個(gè)CpG位點(diǎn)的 DNA 甲基化異常也參與了BD的發(fā)生。Ali等[20]分析了伊朗51例 BD 患者和63個(gè)健康對(duì)照組的白介素10(Interleukine-10,IL-10)基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平以及IL-10基因mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，BD患者組中IL-10基因mRNA表達(dá)水平顯著降低，血清中IL-10水平也顯著降低，且BD患者組IL-10基因 mRNA表達(dá)水平和血清中IL-10分泌水平均與IL-10基因啟動(dòng)子的甲基化程度呈負(fù)相關(guān)；IL-10是一種免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，研究發(fā)現(xiàn)IL-10的表達(dá)缺失與許多自身免疫性疾病發(fā)病有關(guān)[21]，提示啟動(dòng)子區(qū)高甲基化是BD患者IL-10基因失活的關(guān)鍵機(jī)制之一。Zhu[22]等對(duì)16 名活動(dòng)期BD患者、11例非活動(dòng)期BD患者及19個(gè)健康對(duì)照組CD4+T細(xì)胞中的轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、白介素4(Interleukine-4,IL-4)及GATA 結(jié)合蛋白-3(GATA-3)CpG啟動(dòng)子區(qū)域的DNA甲基化及mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，與健康個(gè)體相比，活動(dòng)期BD患者中GATA3和TGF-β的甲基化水平顯著升高且mRNA表達(dá)顯著降低，非活動(dòng)期BD患者GATA3啟動(dòng)子區(qū)域CG-7.8.9位點(diǎn)較活動(dòng)期BD患者甲基化水平顯著降低；同樣，與活動(dòng)期BD患者相比，非活動(dòng)期BD患者TGF-β中CG-2.3.4.5和CG-10.11位點(diǎn)的甲基化水平也顯著降低；在使用了糖皮質(zhì)激素和環(huán)孢素治療后，非活動(dòng)期BD患者的GATA3和 TGF-β甲基化水平降低，提示GATA3 和TGF-β的異常DNA甲基化與它們的mRNA表達(dá)相關(guān)，且GATA3和TGF-β啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化可能導(dǎo)致其基因轉(zhuǎn)錄沉默，進(jìn)而參與BD的發(fā)病。Abdi等[23]檢測(cè)BD患者和健康對(duì)照組外周血中細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1(Suppressors of cytokine signaling 1,SOCS1)基因的甲基化水平，結(jié)果顯示，與健康對(duì)照組比，BD患者組中SOCS1甲基化水平升高，且BD患者組中SOCS1基因表達(dá)的水平較健康對(duì)照組顯著降低，進(jìn)一步揭示了BD患者SOCS1基因啟動(dòng)子DNA甲基化程度與基因表達(dá)活性程度呈負(fù)相關(guān)，SOCS1 基因甲基化水平增高可能是最終導(dǎo)致BD的發(fā)病原因之一。Qiu等[24]對(duì)BD患者及健康對(duì)照組樹突狀細(xì)胞( Dendritic cell,DC)中干擾素調(diào)節(jié)因子8(Interferon regulatory 8,IRF 8)CpG啟動(dòng)子區(qū)域的DNA甲基化水平進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，活動(dòng)期BD患者IRF 8甲基化水平顯著高于非活動(dòng)BD患者及正常對(duì)照組，且活動(dòng)期BD患者的IRF8基因mRNA表達(dá)健康對(duì)照較顯著降低；研究還發(fā)現(xiàn)，DAC處理能降低IRF8基因CpG位點(diǎn)甲基化水平，進(jìn)而增強(qiáng)IRF8基因的mRNA表達(dá)，提示IRF8的表觀遺傳調(diào)控可能為BD治療的新靶點(diǎn)。

綜上所述，異常DNA甲基化可能通過調(diào)控目標(biāo)基因的表達(dá)，參與BD的發(fā)病。因此，異常DNA甲基化位點(diǎn)可能成為BD診斷的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

2 組蛋白修飾與BD

組蛋白修飾(Histone modification)是指組蛋白在相關(guān)酶作用下發(fā)生甲基化、乙?；?、磷酸化、腺苷酸化、泛素化、ADP核糖基化等修飾的過程。組蛋白修飾是表觀遺傳調(diào)控的重要手段之一，已有研究已經(jīng)證實(shí)，組蛋白乙?；饕c基因激活有關(guān)[25]。近年來，組蛋白修飾在自身免疫性疾病中的作用已被廣泛關(guān)注，且與BD的發(fā)生也有一定關(guān)聯(lián)。

SIRT1 (Sirtuins 1)是一種依賴NAD+輔酶的組蛋白去乙?；?，通過對(duì)組蛋白進(jìn)行去乙?；揎棧{(diào)控基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞功能存活及調(diào)節(jié)炎癥[26]。Gardner等[27]研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1激活物通過下調(diào)STAT5A / B的表達(dá)和抑制對(duì)IL-2的pSTAT5A/B信號(hào)傳導(dǎo)，從而抑制T細(xì)胞增殖。對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎(Experimental autoimmune uveitis,EAU)小鼠進(jìn)行口服SIRT1激活劑治療可抑制疾病的發(fā)展，并伴有視網(wǎng)膜白細(xì)胞浸潤的減少，抑制抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)，降低了包括IL-6、IL-17A和干擾素-γ等促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，進(jìn)而抑制EAU的發(fā)展。前期已有研究發(fā)現(xiàn)，IL-6、IL-17等細(xì)胞因子在BD發(fā)病中發(fā)揮著重要作用[2]。因此，未來對(duì)SIRT1的靶向激活有望成為BD的潛在治療方法。Kubota等[28]通過對(duì)注射脂多糖誘導(dǎo)的葡萄膜炎(Endotoxin induced uveitis,EIU)小鼠喂飼白藜蘆醇，研究白藜蘆醇在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的EIU中的眼部作用，結(jié)果顯示，白藜蘆醇給藥可以顯著降低單核細(xì)胞趨化蛋白1(Monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)和細(xì)胞間黏附分子1(Intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)的蛋白水平以及核因子-κB (Nuclear factor-κB，NF-κB)水平；與對(duì)照組相比，視網(wǎng)膜血管白細(xì)胞黏附能力也顯著降低，抑制眼部炎癥反應(yīng)的發(fā)生；除了具有抗氧化作用外，白藜蘆醇還可作為組蛋白脫乙?；窼irt1的活化劑，白藜蘆醇能夠顯著增強(qiáng)Sirt1基因在EIU小鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和脈絡(luò)膜中的表達(dá)，SIRT1激活物可抑制與BD的發(fā)展，因此SIRT1激活物可能是BD潛在的藥物靶點(diǎn)。

綜上所述，組蛋白修飾參與了BD的發(fā)生發(fā)展，但相關(guān)的研究偏少且不夠深入，其參與BD發(fā)生的具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

3 非編碼RNA與BD

非編碼RNA(Non-coding RNA)是指不編碼蛋白質(zhì)的RNA，包括微小RNA(microRNA，miRNA)、短干擾RNA(Small interfering RNA，siRNA)、piRNA(piwi-interacting RNA)和長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)。人的基因組大概含有32億個(gè)堿基，編碼蛋白的基因僅占全基因組的1%～2%，而剩余的98%都是非編碼DNA。近年研究表明，非編碼RNA在各種復(fù)雜性疾病的調(diào)控中起到非常重要的作用。目前研究最多的是miRNA，其長度約為22個(gè)核苷酸，也是一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，通過對(duì)靶基因的調(diào)控進(jìn)而參與細(xì)胞增殖、分化及凋亡等過程。miRNA自身表達(dá)的調(diào)控機(jī)制尚不明確，單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP )為其調(diào)控機(jī)制之一，其主要通過miRNA基因中的SNPs對(duì)miRNA表達(dá)活性進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而通過調(diào)控靶基因產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)[29]。目前，多項(xiàng)研究表明，miRNA可能成為BD潛在的生物學(xué)診斷標(biāo)志。

Antonio等[30]使用Affymetrix陣列分析法，全面覆蓋miRNA序列分析BD患者及正常對(duì)照組miRNA的表達(dá)譜，鑒定了BD中47組差異表達(dá)的miRNA，其中miR-4505和miR-149-3p較對(duì)照組表達(dá)顯著升高，其余45組miRNA表達(dá)顯著降低；研究還確定了與活動(dòng)性BD患者相關(guān)的特定miRNA特征，這些失調(diào)的miRNA通過靶向信號(hào)傳導(dǎo)途徑參與BD的發(fā)生，如TNF、IFN-γ、VEGF和VEGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等。Woo等[31]分析了BD患者PBMC中miRNA(miR-638、miR-4488、miR-3591-3p和miR-1915)的表達(dá)水平，分析結(jié)果顯示，與健康對(duì)照組相比，靜止期BD患者的miR-638和miR-4488 的表達(dá)水平降低；相較于靜止期BD患者，活動(dòng)期BD患者的miR-3591-3p表達(dá)顯著增加；在脂多糖刺激下，活動(dòng)期BD 患者PBMC中IL-6表達(dá)顯著上調(diào)； BD患者PBMC中分別轉(zhuǎn)染miR-638和miR-4488抑制劑以及miR-3591-3p模擬物后，可顯著增加IL-6 mRNA表達(dá)水平。該研究探索了BD患者的PBMC中相關(guān)miRNA的差異表達(dá)，并表明miRNA可對(duì)IL-6的產(chǎn)生起到調(diào)節(jié)作用。Zhou等[32]研究發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組相比，BD患者PBMC和DC中miR-155表達(dá)顯著減少，而蛋白激酶結(jié)合蛋白2表達(dá)增加；體外實(shí)驗(yàn)表明可通過改變miR-155水平調(diào)控靶基因TAB2蛋白水平的表達(dá)，發(fā)揮樹突狀細(xì)胞的細(xì)胞因子的作用，進(jìn)而參與BD發(fā)病。Qi等[33]對(duì)miR-196a2的SNP進(jìn)行了兩階段關(guān)聯(lián)研究，第一階段的研究結(jié)果顯示，BD患者miR-196 a2/rs11614913 TT基因型和T等位基因頻率較正常對(duì)照組顯著增高，而CC基因型在BD出現(xiàn)頻率顯著降低；第二階段的研究證實(shí)了rs11614913 TT基因型與CC基因型和C等位基因相比miR-196a表達(dá)減少，且miR-196a靶基因Bach1、炎癥因子IL-1β和MCP-1的表達(dá)增加；該研究揭示，rs11614913的miR-196a2表達(dá)的改變與BD的發(fā)生發(fā)展顯著相關(guān)，其主要通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)與促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，進(jìn)而參與BD的發(fā)病。Qi等[34]采用熒光定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)、流式細(xì)胞術(shù)等探討Notch信號(hào)通路與相關(guān)miRNA在BD中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在BD活動(dòng)期，Notch信號(hào)通路參與反應(yīng)途徑且增強(qiáng)，使用DAPT阻斷Notch信號(hào)通路后能明顯抑制IL-17的產(chǎn)生及Th細(xì)胞的數(shù)量，表明其主要通過激活與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT3)磷酸化相關(guān)的Notch通路，促進(jìn)Th17細(xì)胞反應(yīng)，導(dǎo)致BD的發(fā)病。此外，與Notch1相關(guān)的miRNA中，僅miR-23b在BD患者CD4+T細(xì)胞中表達(dá)降低，揭示miR-23b在活動(dòng)期BD的低表達(dá)是導(dǎo)致Notch信號(hào)通路異常和發(fā)病的主要原因。Zhou等[35]研究發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，BD患者中miR-146ars2910164位點(diǎn)CC基因型和C等位基因的頻率顯著降低，且該GG基因型個(gè)體miR-146a的表達(dá)分別比CC基因型和GC基因型高2.45倍和1.99倍，rs2910164位點(diǎn) CC基因型在PBMC中IL-17和IL-1β的表達(dá)水平顯著低于GG基因型，該研究確定了中國漢族人群中miR-146a的rs2910164多態(tài)性與BD的相關(guān)性，且該SNP可能通過調(diào)節(jié)成熟miR-146a/表達(dá)和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，進(jìn)而參與BD的發(fā)生。

近期研究表明，其它非編碼RNA如lncRNA的異常表達(dá)與自身免疫性疾病的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)[36-37]。lncRNA是炎癥免疫反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子，在各種生理過程中起著重要作用，包括轉(zhuǎn)錄、染色質(zhì)修飾及轉(zhuǎn)錄后的處理[38-39]。已有研究證實(shí)110個(gè)lncRNA的SNPs與Vogt-小柳原田綜合征、強(qiáng)直性脊柱炎等多種自身免疫性疾病的發(fā)病有關(guān)[40-41]，但參與BD發(fā)病的lncRNA及其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

綜上，正確認(rèn)識(shí)非編碼RNA參與BD發(fā)生的作用機(jī)制，將為BD的診斷與治療提供新的策略。

4 展望

本文通過探討異常DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA在BD發(fā)生發(fā)展中的重要作用，這加深了我們對(duì)BD的病因病理學(xué)的理解。然而，目前表觀遺傳因素參與BD發(fā)生的具體作用機(jī)制研究偏少，尚不能完全解決BD缺乏防治和預(yù)后特異性生物學(xué)標(biāo)記物的難題。未來仍須更深入的研究表觀遺傳因素發(fā)生異常的原因及其作用機(jī)制，新的研究結(jié)果將可能為BD的臨床診斷、治療和預(yù)后提供新的途徑或新的靶點(diǎn)。