玉米大斑病菌Septin基因家族的鑒定與表達(dá)模式分析

龍鳳，王擎，朱行，王建霞，申珅，劉寧，郝志敏，董金皋,2

玉米大斑病菌基因家族的鑒定與表達(dá)模式分析

龍鳳1，王擎1，朱行1，王建霞1，申珅1，劉寧1，郝志敏1，董金皋1,2

（1河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/河北省植物生理與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北保定 071001；2河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河北保定 071001）

隔膜蛋白Septin廣泛存在于除植物以外所有真核生物中，是高度保守的GTP結(jié)合蛋白家族，被認(rèn)為是繼微管、微絲和中間纖維之后的第4種細(xì)胞骨架蛋白。病原真菌的Septin蛋白參與細(xì)胞極性的確定、形態(tài)塑造及與致病相關(guān)的形態(tài)轉(zhuǎn)換?！尽胯b定玉米大斑病菌（）基因家族，并進(jìn)一步分析其在不同發(fā)育時期的表達(dá)模式，為明確隔膜蛋白Septin與真菌侵染結(jié)構(gòu)發(fā)育之間的關(guān)系打下基礎(chǔ)。以玉米小斑病菌（）中6個Septin蛋白的氨基酸序列為探針，在玉米大斑病菌數(shù)據(jù)庫在線Blastp比對和關(guān)鍵詞搜索，獲得大斑病菌的候選，對其基因結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)以及跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)等方面進(jìn)行生物信息學(xué)分析。收集人造疏水介質(zhì)誘導(dǎo)下侵染結(jié)構(gòu)發(fā)育不同時期以及侵染感病寄主葉片不同時間的玉米大斑病菌材料，利用實(shí)時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）技術(shù)系統(tǒng)分析基因家族在玉米大斑病菌侵染結(jié)構(gòu)形成不同階段的轉(zhuǎn)錄水平。獲得了玉米大斑病菌6個候選，其中4個核心，均含有G1、G3、G4基序，分別將其命名為、、、。在人造疏水介質(zhì)誘導(dǎo)下，表達(dá)水平均呈上升趨勢。在芽管形成后期表達(dá)最活躍，其表達(dá)量達(dá)到分生孢子時期的25.69倍（＜0.01），的表達(dá)水平在附著胞發(fā)育后期到達(dá)高峰，隨后表達(dá)逐漸下調(diào)。該基因家族在病菌侵染寄主葉片過程中的轉(zhuǎn)錄水平變化趨勢與其在人造疏水介質(zhì)誘導(dǎo)下的表現(xiàn)趨于一致。在接種后6 h轉(zhuǎn)錄水平極顯著上調(diào)（＜0.01），隨著時間延長，表達(dá)水平下降，在附著胞形成階段表達(dá)活躍，表達(dá)量在接種后18 h達(dá)到高峰值，之后表達(dá)下調(diào)，但仍高于萌發(fā)初期。、在接種后18 h和24 h表達(dá)活躍，高于萌發(fā)初期。玉米大斑病菌基因組中含有4個核心，和分別在芽管和附著胞形成時期活躍表達(dá)，結(jié)果可為進(jìn)一步明確 Septin的功能及玉米大斑病菌的侵染調(diào)控機(jī)制提供依據(jù)。

玉米大斑病菌；基因家族；實(shí)時熒光定量PCR；基因表達(dá)

0 引言

【研究意義】玉米大斑病是嚴(yán)重威脅玉米安全生產(chǎn)的真菌性病害之一[1]，其病原玉米大斑病菌（）主要侵害玉米葉片、葉鞘和苞葉，以葉片受害最重，嚴(yán)重影響玉米的產(chǎn)量和質(zhì)量。但由于該病菌具有明顯的生理分化現(xiàn)象，且變異頻繁，使主要依賴抗病品種的病害防控工作面臨極大威脅，因此，充分解析病原菌致病性的調(diào)控機(jī)制將成為尋找病害防控新策略的重要突破口[2]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】隔膜蛋白Septin廣泛存在于除植物以外所有真核生物中，是高度保守的GTP結(jié)合蛋白家族[3]，Septin被認(rèn)為是繼微管、微絲和中間纖維之后的第4種細(xì)胞骨架蛋白[4]。迄今為止，已鑒定了釀酒酵母（）中基因家族具有7個成員，其中5個（、、、和）在有絲分裂期間表達(dá)并參與胞質(zhì)分裂，在芽頸處形成環(huán)形結(jié)構(gòu)[5]。它們參與芽位置的選擇、有絲分裂紡錘體的定位、極化生長和胞質(zhì)分裂[6]，而和是孢子形成時期所特有的[7]。值得注意的是，Septin環(huán)結(jié)構(gòu)是伴隨細(xì)胞周期的發(fā)生而出現(xiàn)的，只有在G2/M轉(zhuǎn)變期子芽形成到細(xì)胞分裂結(jié)束時，Septin環(huán)結(jié)構(gòu)才能被檢測到，在其他時期，Septin以一種無序狀態(tài)存在，在細(xì)胞中很難被檢測到[8-9]。Septin以蛋白復(fù)合體的形式參與Septin環(huán)的構(gòu)建，任何主要的基因、、或的突變都會阻止Septin環(huán)的發(fā)育，從而導(dǎo)致有絲分裂延遲和芽伸長[10]。動植物真菌病原體存在釀酒酵母中未發(fā)現(xiàn)的Septin形式，并在動力學(xué)和功能上表現(xiàn)出復(fù)雜性，使真菌病原體成為揭示Septin行為多樣性的重要模型。稻瘟病菌（）中，位于附著胞孔內(nèi)環(huán)形的F-肌動蛋白網(wǎng)絡(luò)由4個Septin鳥苷三磷酸酶（Sep3、Sep4、Sep5和Sep6）組裝，并聚合成一個動態(tài)的異寡聚環(huán)，從而支撐F-肌動蛋白形成細(xì)胞骨架，以形成侵入釘破壞葉片表面[11-12]。因此，Septin對依賴附著胞侵染寄主的病原微生物至關(guān)重要。在大多數(shù)病原真菌中，的缺失導(dǎo)致極性生長的增加和毒力的降低。在構(gòu)巢曲霉（）中，Δ突變體形成多個異常、發(fā)育不良的菌絲分支以及多個胚芽管，而野生型菌株只形成一個胚芽管[13]。在灰葡萄孢（）中，Δ突變體芽管增長，不能形成附著胞和侵染墊，致病力完全喪失[14]。在棉阿舒囊霉（）中，或缺失菌株其菌絲具有額外極性生長一個彎曲菌絲[15]。Septin蛋白以細(xì)胞周期蛋白/Cdk依賴性方式直接控制菌絲形態(tài)發(fā)生，在白色念珠菌（）中，Cdk Cdc28通過調(diào)控細(xì)胞周期蛋白Ccn1和Hgc1，從而快速建立并維持細(xì)胞骨架蛋白Cdc11的磷酸化，以促進(jìn)菌絲發(fā)育，這些磷酸化位點(diǎn)的誘變會導(dǎo)致異常的菌絲形態(tài)[16]，其中Δ和Δ突變體與野生型白色念珠菌相比，其生長速度正常但產(chǎn)生彎曲菌絲的頻率更高，細(xì)胞壁沉積的輕微不一致，并且在感染小鼠模型中毒力減弱[17-18]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】大量研究表明，Septin蛋白缺失嚴(yán)重影響對宿主的致病力，特定Septin蛋白的功能喪失伴隨的后果在不同物種間有較大差異。目前，對于玉米大斑病菌Septin蛋白功能，尤其是在病菌侵染結(jié)構(gòu)發(fā)育過程中發(fā)揮的作用尚未進(jìn)行過系統(tǒng)研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用生物信息學(xué)手段明確玉米大斑病菌家族的組成，及其成員基因和編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特征、理化性質(zhì)；分別將病原菌接種于人造疏水介質(zhì)及感病寄主葉片，檢測家族各基因的表達(dá)水平，揭示在病菌侵染結(jié)構(gòu)發(fā)育過程中的表達(dá)模式，為深入闡明家族不同成員在病菌致病過程中的功能打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2019年在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/河北省植物生理與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 供試菌株及寄主

玉米大斑病菌野生型菌株01-23和玉米品種B73自交系均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌毒素與植物分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要培養(yǎng)基及試劑

PDA培養(yǎng)基、1.2% Agar培養(yǎng)基，RNA提取Trizol試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司。Prime Script ? RT reagent Kit試劑盒購自TaKaRa（大連）公司，UEIrisII RT-PCR system for First-Strand cDNASynthesis（with dsDNase）反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Super EvaGreen? qPCR Master Mix試劑盒購自US Everbright? Inc（江蘇），引物在生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 病菌樣本收集

采用氣生菌絲涂斷法收集在PDA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)13 d的玉米大斑病菌分生孢子，配制濃度為20個/μL的玉米大斑病菌孢子懸浮液，用移液槍吸取2 mL孢子懸浮液點(diǎn)在鋪有玻璃紙的水瓊脂平板上，25℃保濕孵育，誘導(dǎo)分生孢子萌發(fā)。參考申珅等的方法分別于接種后6 h（分生孢子萌發(fā)形成芽管）、12 h（芽管末端膨大形成附著胞）、24 h（附著胞基部產(chǎn)生纖細(xì)的侵入釘）[19-20]收集菌體材料，濕重約0.5 g，分別提取其RNA。將相同濃度的玉米大斑病菌孢子懸浮液接種于感病寄主B73玉米葉片表面，于接種后1 h（分生孢子萌發(fā)早期）、6 h（芽管形成后期）、12 h（附著孢發(fā)育早期）、18 h（附著孢形成后期）、24 h（侵入釘形成后期）從葉片上收集病菌材料[19-20]，置于50 mL管中，分別提取其RNA。

1.4 RNA的提取

參考申珅等的方法用Trizol試劑盒分別提取人造疏水介質(zhì)誘導(dǎo)下玉米大斑病菌不同發(fā)育階段菌體和接種感病寄主葉片不同時間后菌體的總RNA[19-20]，采用UEIrisII RT-PCR system for First-Strand cDNA Synthesis（with dsDNase）反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，用于RT-qPCR檢測的轉(zhuǎn)錄水平。所有試驗(yàn)均設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。

1.5 Septin基因及編碼產(chǎn)物的生物信息學(xué)分析

利用MEGA7.0軟件鄰接法對已報(bào)道的其他真菌物種的Septin序列與玉米大斑病菌Septin序列進(jìn)行多重序列比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，重復(fù)次數(shù)設(shè)置為1 000。

利用GSDS2.0（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）分析家族的基因結(jié)構(gòu)[21]。ProtParam（https://web. expasy.org/protparam/）分析Septin蛋白的理化性質(zhì)[19]。NCBI-CDD（conserved domain database）數(shù)據(jù)庫和SMART數(shù)據(jù)庫在線分析Septin保守結(jié)構(gòu)域。Psipred4.0（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）預(yù)測Septin的蛋白二級結(jié)構(gòu)。通過ProtCompv9.0（http://linux1.softberry. com/berry.phtml?group=programs&subgroup=proloc&topic=protcomppl）在線預(yù)測Septin亞細(xì)胞定位[22]。通過Singal IP3.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測信號肽[22]，利用THMM Server v2.0（http://www. cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在線預(yù)測Septin蛋白跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)。

1.6 Septin表達(dá)水平的RT-qRCR分析

利用Primer 5設(shè)計(jì)各基因特異性引物（表1），以為內(nèi)參基因，以各時期cDNA為模板，Super EvaGreen? qPCR Master Mix試劑盒進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增，采用美國Bio-Rad CFX96 TouchTM型熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行試驗(yàn)（表2）。

RT-qPCR程序：95℃ 3 min；95℃ 15 s，60℃ 60 s（收集熒光），45個循環(huán)；每個樣品均設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)。以分生孢子時期的基因表達(dá)水平為對照，采用基因相對表達(dá)量分析方法2-ΔΔCt和Origin軟件，對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，GraphPad Prism6繪制圖表。

表1 RT-qPCR試驗(yàn)所用引物

表2 RT-qPCR反應(yīng)體系

2 結(jié)果

2.1 玉米大斑病菌候選Septin的獲取

以玉米小斑病菌（）中的6個Septin（ChCdc3、ChCdc10、ChCdc11、ChCdc12、ChCdc100和ChCdc100）的氨基酸序列為探針，對玉米大斑病菌數(shù)據(jù)庫（https://mycocosm.jgi.doe.gov/ pages/search-for-genes.jsf?organism=Settu3）在線Blastp比對，獲得玉米大斑病菌基因組中6個候選（表3）。6個基因隨機(jī)分布于基因組中，不存在連鎖關(guān)系?；蛑蟹謩e包含2—6個外顯子（圖1）。

2.2 Septin的系統(tǒng)進(jìn)化分析

不同植物病原真菌Septin同源基因在氨基酸水平上呈現(xiàn)高度的相似性，系統(tǒng)發(fā)育樹分成兩個大的進(jìn)化支，玉米大斑病菌的StSep1、StSep2、StSep3、StSep4與不同病原真菌的核心Septin（Cdc3、Cdc10、Cdc11和Cdc12）聚于同一進(jìn)化支，而StSep5、StSep6分別與玉米小斑病菌的Septin同源，構(gòu)成另一個進(jìn)化支（圖2）。玉米大斑病菌中沒有與釀酒酵母SPR3、SHS1、SPR28同源的Septin。

表3 玉米大斑病菌Septin的信息

圖1 玉米大斑病菌Septin基因結(jié)構(gòu)

圖2 Septin的系統(tǒng)發(fā)育分析

2.3 Septin的結(jié)構(gòu)特征分析

NCBI-CDD（conserved domain database）數(shù)據(jù)庫在線比對結(jié)果表明，StSep1、StSep2、StSep3、StSep4為CDC/Septin GTPase家族成員，StSep5、StSep6主要為P-loop-NTPase域的成員，用于結(jié)合核苷酸的-磷酸部分（通常為ATP或GTP）和Mg2+。通過DNAMAN對4個候選Septin的氨基酸序列進(jìn)一步進(jìn)行比對分析，結(jié)果表明，候選Septin均具有GTP-CDC結(jié)合域（G1、G3、G4 motif）[22]，構(gòu)成保守序列PFAxvGs特征的3個殘基vGs已映射到保守域CDC-Septin上的G5 motif。PAN等[23]使用Weblogo程序分析Septin基序發(fā)現(xiàn)序列WgxEV、YexYR中的ExxxxR和基序WG中度保守。在G3 motif與G4 motif之間的氨基酸序列FIxPtGHxL和在G4 motif的氨基酸序列ExDD[22]，尚無功能注釋（圖3），這些保守結(jié)構(gòu)域在希金斯炭疽菌（）的Septin中也存在，但具體的生物學(xué)功能，有待今后進(jìn)一步的探究與解析。

2.4 核心Septin的生物信息學(xué)分析

2.4.1 理化性質(zhì) 總體而言，相對分子質(zhì)量最大的是StSep4，相對分子質(zhì)量最小的是StSep1。StSep1的PI為7.20，屬于中性蛋白質(zhì)；StSep2、StSep4的PI分別為5.07、6.56，屬于酸性蛋白質(zhì)；StSep3的PI為8.54，屬于堿性蛋白質(zhì)（表4）。4個Septin的脂肪族氨基酸指數(shù)范圍為78.87—86.53，總平均親水性均為負(fù)值，因此玉米大斑病菌中的4個核心Septin均屬于親水性蛋白。

圖3 Septin的保守結(jié)構(gòu)域分析

表4 Septin的基本理化性質(zhì)

2.4.2 二級結(jié)構(gòu) Septin二級結(jié)構(gòu)由折疊、螺旋、轉(zhuǎn)角以及無規(guī)則卷曲4種結(jié)構(gòu)組成，以Stsep1所含折疊比例最高，為15.84%；StSep3所含無規(guī)則卷曲的比例最高，為49.87%；StSep4所含螺旋的比例最高為51.16%（圖4）。

2.4.3 亞細(xì)胞定位、跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)測和信號肽預(yù)測Septin均定位于細(xì)胞質(zhì)中，無跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)，不具有信號肽位點(diǎn)，為非分泌蛋白。

2.5 Septin表達(dá)模式分析

以人造疏水介質(zhì)為誘導(dǎo)，模擬病菌侵染結(jié)構(gòu)的發(fā)育過程，以分生孢子時期的基因表達(dá)水平為對照。在芽管形成后期表達(dá)活躍（＜0.01），其表達(dá)量是分生孢子時期的25.69倍，在附著胞形成后期活躍表達(dá)（＜0.01），其表達(dá)量是分生孢子時期的15.22倍，隨后侵入釘形成，表達(dá)水平下調(diào)，但其表達(dá)量仍高于分生孢子時期。、隨誘導(dǎo)時間延長，表達(dá)水平持續(xù)上調(diào)，在侵染絲時期其表達(dá)量分別達(dá)到分生孢子時期的6.21和7.32倍。由此推測可能主要參與病菌孢子萌發(fā)過程，、可能主要參與病菌侵染結(jié)構(gòu)形成過程，而可能主要在病菌的附著胞發(fā)育及侵染絲的形成中發(fā)揮調(diào)控作用。

分析基因家族在病菌侵染感病寄主葉片過程中的轉(zhuǎn)錄水平，以接種初期1 h的基因表達(dá)水平為對照。結(jié)果表明，和的轉(zhuǎn)錄水平均呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的變化趨勢。在接種后6 h轉(zhuǎn)錄水平極顯著上調(diào)（＜0.01），隨后迅速下降，至接種后18 h和24 h基本下調(diào)至與起始階段相當(dāng)?shù)乃?，在附著胞形成階段表達(dá)活躍，隨著時間延長，繼續(xù)上調(diào)至18 h達(dá)到高峰，之后表達(dá)量下調(diào)，至24 h后仍高于萌發(fā)初期。、在接種后18 h和24 h表達(dá)活躍，表達(dá)量略有上調(diào)，無顯著性差異。

圖4 玉米大斑病菌Septin的二級結(jié)構(gòu)特征

A：疏水介質(zhì)誘導(dǎo)下玉米大斑病菌不同發(fā)育時期的表達(dá)量 Expression at different developmental stages induced on hydrophobic medium；B：接種后不同時間的表達(dá)量 Expression in different times after inoculation of maize leaves。*：0.01＜P＜0.05；**：P＜0.01

3 討論

20世紀(jì)80年代末，由HARTWELL首次在釀酒酵母的胞質(zhì)分裂缺陷（CDC）突變體中發(fā)現(xiàn)Septin，最近在綠藻、褐藻及纖毛蟲中也發(fā)現(xiàn)了Septin，而在高等綠色植物中尚未發(fā)現(xiàn)Septin的存在[24]。在對Septin系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化起源的研究中發(fā)現(xiàn)，Septin家族在進(jìn)化上相對保守，各家族成員之間其N端和C端稍有不同，位于中央的鳥苷三磷酸（GTP）結(jié)合結(jié)構(gòu)域和多堿性氨基酸結(jié)構(gòu)域都是高度保守的[9,25]。大量研究表明，Septin是從酵母到人類高度保守的真核細(xì)胞骨架蛋白家族，所有真菌均具有4種核心Septin：Cdc3、Cdc10、Cdc11及Cdc12[14]。在哺乳動物中Septin家族有很多變異剪接本，翻譯后修飾保守性差，使得該家族基因功能更為復(fù)雜。

相對于其他細(xì)胞骨架GTP酶、真核生物的Tubulin蛋白及細(xì)菌中的FtsZ蛋白，Septin家族的這些保守序列與Ras家族更為相近[26]。典型Septin具有以下結(jié)構(gòu)特征：（1）所編碼的蛋白質(zhì)分子量約30—65 kD；（2）包含GTP酶域所特有的3個保守序列：G1、G3、G4基序（motif）。Septin蛋白G1基序（Gxxxx GK[S/T]）高度保守，G3基序（Dxx G）中度保守，其共有序列為DTPG，G4基序（xKxD）嚴(yán)謹(jǐn)保守[27]；（3）N端為多元區(qū)域，C端為螺旋卷曲結(jié)構(gòu)，這一結(jié)構(gòu)被認(rèn)為可能與Septin家族成員的同源與異源聚合有關(guān)[28]。不同亞型的Septin可聚合形成隔膜絲，隔膜絲進(jìn)一步可形成纖維束、環(huán)狀、網(wǎng)格狀、籠狀和沙漏狀等復(fù)雜的高級結(jié)構(gòu)[27]。

大量研究表明，Septin在真菌病原體中起著重要的作用。在稻瘟病菌中，MoSEP3-GFP定位于附著胞孔處，缺失后導(dǎo)致侵染釘不能形成，致病力完全喪失，并且囊外復(fù)合體（Exocyst）在附著胞孔處的組裝依賴于隔膜蛋白，表達(dá)和Septin環(huán)形成之前，Exocyst在附著胞孔處不會發(fā)生積累[12,29]。在禾谷鐮孢（）中、或的靶向缺失導(dǎo)致菌絲體生長速度減慢，分生孢子形成減少且形態(tài)異常，其敲除突變體毒力降低，而Δ突變體與野生型的生長形態(tài)和毒性無明顯差別[30]。在禾谷鐮孢中正常的成熟子囊孢子由4個細(xì)胞簇組成，具有4個單核區(qū)室，而Δ和Δ突變體的子囊孢子形態(tài)缺陷，大多為橢圓形的單細(xì)胞，子囊孢子每個隔室包含多個核，表明在子囊孢子發(fā)育過程中，基因的缺失影響細(xì)胞核分裂、分隔[31]。玉米黑粉菌（）中的Septin可以組裝成芽頸環(huán)，生長尖端的帶狀結(jié)構(gòu)以及長的Septin纖維，3種不同結(jié)構(gòu)可在同一細(xì)胞中共存。基因的缺失嚴(yán)重影響玉米黑粉菌的細(xì)胞形態(tài)，并引起熱敏感性和對細(xì)胞壁應(yīng)激源的敏感性增強(qiáng)，突變體毒力減弱，但的缺失似乎對其他Septin定位的影響較小，僅改變了的芽頸定位，表明Septin在玉米黑粉菌中顯示出一定程度的相互獨(dú)立性[32]。而在釀酒酵母中，當(dāng)缺失一個時，通常會破壞Septin環(huán)。在構(gòu)巢曲霉中，野生型菌株具有規(guī)則的梗基、瓶梗以及分生孢子鏈，而Δ和Δ突變體形成不規(guī)則且融合的?；?、瓶梗，產(chǎn)生的分生孢子較少，菌絲中的橫隔減少，并且Δ、Δ突變體的生長發(fā)育似乎比野生型更快，分生孢子萌發(fā)速度更快，芽管早期出現(xiàn)，菌絲分支增加[33]。揭示了在不同病原真菌中Septin行為的多樣性。此外，病原菌效應(yīng)蛋白的分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)同樣也依賴Septin。例如，大麗輪枝菌（）Septin5和F-actin以成環(huán)的形式（Septin環(huán)）定位于菌絲頸環(huán)，其在菌絲頸環(huán)的有序組織是分泌蛋白穿透界面所必需的，缺失導(dǎo)致分泌蛋白滯留在附著枝及菌絲頸環(huán)內(nèi)，病菌的致病力降低[34]，說明Septin參與囊泡運(yùn)輸。

本研究表明，在玉米大斑病菌侵染過程中表達(dá)模式發(fā)生了明顯變化，且4個核心呈現(xiàn)明顯不同的表達(dá)模式，其中在芽管時期表達(dá)最活躍，在附著胞形成階段和侵染絲時期表達(dá)量顯著上調(diào)。、表達(dá)模式相近，均在芽管和附著胞形成時期表達(dá)上調(diào)。因此推測，可能主要參與孢子萌發(fā)早期的芽管形成，、可能與附著胞發(fā)育關(guān)系密切，而可能在病菌侵染過程中附著胞形成、成熟以及侵入釘?shù)男纬砂l(fā)揮重要調(diào)控作用。結(jié)合隔膜蛋白Septin在調(diào)控稻瘟病菌、禾谷鐮孢和玉米黑粉菌致病性中的重要作用及玉米大斑病菌不同發(fā)育時期的表達(dá)規(guī)律，推測玉米大斑病菌Septin與其功能相似，均參與調(diào)控病菌極性生長及致病力。在玉米大斑病菌中Septin是否作為一個復(fù)合體發(fā)揮作用，多個Septin高級結(jié)構(gòu)如何在同一細(xì)胞質(zhì)中以致病形態(tài)共存，再者，隔膜蛋白Septin在病菌中是否顯示出一定程度的相互獨(dú)立性等所涉及的生物學(xué)問題有待于進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

玉米大斑病菌基因組中共有6個基因，隨機(jī)分布，不存在連鎖關(guān)系；其中4個為核心，均具有GTP-CDC結(jié)合域（G1、G3、G4 motif）。、分別在芽管及附著胞形成階段活躍表達(dá)，、在侵入絲形成時期表達(dá)上調(diào)。

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Identification and expression pattern analysis ofgene family of

LONG Feng1, WANG Qing1, ZHU Hang1, WANG Jianxia1, SHEN Shen1, LIU Ning1, HAO Zhimin1, DONG Jingao1,2

(1College of Life Sciences/Key Laboratory of Hebei Province for Plant Physiology and Molecular Pathology, Hebei Agricultural University, Baoding 071001, Hebei;2College of Plant Protection, Hebei Agricultural University, Baoding 071001, Hebei)

【】Septin, which is widely found in all eukaryotes except plants, is a highly conserved GTP binding protein family and is considered to be the fourth cytoskeletal protein after microtubules, microfilaments and intermediate fibers. Septin proteins of pathogenic fungi are involved in cell polarity determination, morphological shaping and morphological transformation associated with pathogenicity.【】The objective of this study is to identifygene family of, analyze its expression pattern at different developmental stages, and to lay a foundation for clarifying the relationship between the membrane protein Septin and fungal infection structure development.【】The amino acid sequences of six Septin proteins inwere used as probe sequences, online Blastp alignment and keyword search were carried out in thedatabase to obtaincandidate. Then bioinformatics analyses including gene structure, physical and chemical properties and transmembrane region structure of the Septins were conducted. The materials ofthat were induced by artificial hydrophobic media at different stages of infective structures development and infected host leaves at different times were collected, and RT-qPCR (real-time fluorescence quantitative PCR) technology was used to analyze the transcription levels ofat different stages of infective structures development.【】Six candidatewere obtained, and among them, four typicalcontained G1, G3, and G4 motifs, were named by,,and,respectively. The expression level ofincreased slowly under the induction on artificial hydrophobic media.was active in the late stage of germ tube formation, and its expression level was 25.69 times of that in the conidia period (＜0.01). The expression level ofreached a peak in appressorium anaphase, and then the expression level was down-regulated. The change trend ofexpression in the process of pathogen infection was basically consistent with that under the induction of artificial hydrophobic material.expression was significantly up-regulated at 6 h after inoculation (＜0.01). As time went on,actively expressed during the period of appressorial formation, and the expression reached a peak at 18 h after inoculation. After that, the expression was down-regulated, but it was still higher than that in the early stage of germination.andwere active at 18 h and 24 h after inoculation, exceeding the initial stage of germination.【】There are 4 corein the genome of.andare actively expressed during the formation of germ tube and appressoria, respectively. The results will provide a theoretical basis for further clarifying the function of Septin and the infection regulation mechanism of.

;gene family; RT-qRCR; gene expression

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.24.005

2020-03-28；

2020-05-10

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFD0200607）、河北省自然科學(xué)基金（C2018204120、C2020204172）、河北省高等學(xué)校青年拔尖人才科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（BJ2014349Y）、國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-02-25）、國家自然科學(xué)基金（31901827）

龍鳳，E-mail：2801351713@qq.com。王擎，E-mail：wangqing9525@126.com。龍鳳和王擎為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者董金皋，Tel：0312-7528166；E-mail：dongjingao@126.com。通信作者郝志敏，Tel：0312-7528142；E-mail：haozhimin@hebau.edu.cn

（責(zé)任編輯 岳梅）