趙雪丹 向茜 楊晶晶 葛林虎 曾素娟

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院兒童口腔科/廣州市口腔再生醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510182

腺苷酸激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是由催化亞基α、調(diào)節(jié)亞基β和γ組成的異源三聚體蛋白，負(fù)責(zé)維持細(xì)胞三磷酸腺苷(Adenosine-triphosphate，ATP)產(chǎn)生與消耗之間的平衡[1]，被認(rèn)為是一種代謝應(yīng)激傳感酶，在調(diào)節(jié)細(xì)胞和全身能量穩(wěn)態(tài)中起著重要作用。以往研究[2-5]表明AMPK是代謝性疾病、癌癥和動(dòng)脈粥樣硬化的治療靶點(diǎn)，在抗炎、抗腫瘤、延緩衰老等治療中也起到重要作用。目前骨質(zhì)疏松癥被認(rèn)為可能是類似糖尿病、肥胖癥的另一種能量代謝性疾病，而AMPK可調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化和骨形成[6]，提示AMPK信號(hào)通路有望在骨質(zhì)疏松疾病的骨代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本文擬對(duì)AMPK激動(dòng)劑、抑制劑、AMPK通路在骨代謝中的作用及AMPK成骨的機(jī)制作一綜述。

1 AMPK激動(dòng)劑、抑制劑

1.1 AMPK激動(dòng)劑

目前，已知的AMPK經(jīng)典活性藥物激動(dòng)劑主要有阿卡地新(Acadesine，AICAR)、噻吩吡啶酮(A-769662)和二甲雙胍。其中，前兩者為直接激動(dòng)劑，二甲雙胍為間接激動(dòng)劑。AICAR可被細(xì)胞攝取，在腺苷激酶(Adenosine kinase，AK)的磷酸化作用下形成磷酸衍生物ZMP直接激活A(yù)MPK[7]；A-769662可通過(guò)在Thr-172處的AMPKα1變構(gòu)活化來(lái)刺激AMPK，以劑量響應(yīng)的方式選擇性、可逆性地直接激活從多種組織和物種中提取的AMPK[8]。二甲雙胍則通過(guò)阻斷線粒體呼吸鏈復(fù)合體I的電子傳遞，抑制細(xì)胞的氧化磷酸化來(lái)間接激活A(yù)MPK[1, 9]，其過(guò)程是非特異性的。此三種激動(dòng)劑的作用途徑均不相同。

二甲雙胍是天然植物紫丁香產(chǎn)品的衍生物[10]，一些其他的天然產(chǎn)物也能夠激活A(yù)MPK，例如紅葡萄中的白藜蘆醇、許多水果和蔬菜中存在的槲皮素、雪蓮中的虎杖苷、姜黃中的姜黃素、人參中的人參皂苷、黃連中的小檗堿、綠茶中的姜辣素和桑色素，存在于某些海藻中的天然海洋酸紅藻氨酸、從苦瓜中分離出來(lái)的葫蘆酸三萜類化合物和水楊酸鹽等[11]。此外，關(guān)于AMPK激動(dòng)劑還包括合成的新型3,5-二甲基吡啶-4(1H)-1支架化合物[12]、2- {2-[4-(三氟甲基)苯基氨基]噻唑-4-基}乙酸等[13]。

已有大量研究[14]將AICAR、二甲雙胍等常用的AMPK激動(dòng)劑應(yīng)用于調(diào)節(jié)細(xì)胞的成骨分化以促進(jìn)成骨，AMPK激動(dòng)劑可作為靶向促成骨藥物應(yīng)用于骨缺損修復(fù)。糖尿病可引起體內(nèi)骨組織異常，具體可表現(xiàn)為骨量減少和骨質(zhì)疏松等癥狀[15]。二甲雙胍通過(guò)激活A(yù)MPK和促Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor 2，Runx 2)表達(dá)產(chǎn)生直接促成骨作用，并通過(guò)改善體內(nèi)高血糖環(huán)境間接促進(jìn)成骨[14]，既可以降低糖尿病患者骨折的風(fēng)險(xiǎn)，又能促進(jìn)骨折的愈合。

1.2 AMPK抑制劑

化合物C最初是由Merck從10 K文庫(kù)篩選并鑒定的AMPK抑制劑，可有效阻斷AMPK的代謝作用，已在體內(nèi)外生化實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)，并用作AMPK經(jīng)典抑制劑[16-17]，大量學(xué)者[18]將其作為工具藥應(yīng)用于二甲雙胍及AMPK作用機(jī)制的研究，均得到特異性抑制作用。據(jù)報(bào)道，化合物C可以減弱不同類型細(xì)胞中的AMPK表達(dá)[19]，并抑制細(xì)胞的成骨分化作用[20-21]。作為AMPK高度非特異性的一般細(xì)胞周期抑制劑，腺嘌呤阿拉伯糖苷或Ara-A也在少數(shù)研究中用于抑制AMPK活性[18]。

2 AMPK通路在骨代謝中的作用

AMPK亞基在骨組織和細(xì)胞中廣泛表達(dá)，而AMPK組織亞基在骨中表達(dá)為主要催化同工型[22]。二甲雙胍作為AMPK的經(jīng)典激活劑，已被證實(shí)可促進(jìn)來(lái)自骨髓、胎盤、臍帶血、脂肪和肌肉等多種間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的成骨分化，而阻斷AMPK通路后，成骨受到抑制[23-26]。同時(shí)，Molinuevo等[14]發(fā)現(xiàn)當(dāng)誘導(dǎo)成骨細(xì)胞系時(shí)，與對(duì)照組相比，二甲雙胍處理后大鼠的MSCs中AMPK活性和成骨標(biāo)志物均得到增強(qiáng)。AMPK被抑制后，細(xì)胞成骨效果則大大降低[27-28]。有研究[29-31]證明，AMPK激活是通過(guò)抑制3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP-2)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶的表達(dá)，從而改善成骨細(xì)胞的分化和礦化作用。這些都表明，AMPK可在成骨細(xì)胞的分化和骨形成中發(fā)揮重要的功能。

大量實(shí)驗(yàn)顯示，敲除小鼠的AMPKα或β亞基會(huì)顯著降低骨量，通過(guò)AMPK調(diào)控食物攝取和能量代謝的生長(zhǎng)因子和激素也同樣調(diào)控各種骨細(xì)胞中的AMPK活性[32]。Kanazawa等[33]發(fā)現(xiàn)，與野生型和AMPK+/-小鼠相比，成骨細(xì)胞中缺少AMPK的小鼠(AMPK-/-小鼠)表現(xiàn)為出生后骨骼發(fā)育遲緩，8周齡時(shí)皮質(zhì)骨長(zhǎng)度和密度顯著減少，顱骨發(fā)育缺陷。AMPK-/-成骨細(xì)胞中成骨相關(guān)基因的表達(dá)受到顯著抑制，而破骨相關(guān)因子的表達(dá)顯著增加。成骨細(xì)胞中AMPK的缺失通過(guò)增加核因子κ受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)的表達(dá)抑制成骨細(xì)胞的分化并加劇骨丟失。Shah等[27]的研究發(fā)現(xiàn)敲除AMPK亞基的小鼠表現(xiàn)出骨皮質(zhì)和骨小梁間隔較小。隨后Jeyabalan等[34]發(fā)現(xiàn)AMPK缺陷小鼠受卵巢切除術(shù)引起的負(fù)骨平衡影響較小，但在甲狀旁腺素間歇給藥誘導(dǎo)的骨皮質(zhì)、骨小梁形成增加時(shí)更加顯著，作者認(rèn)為AMPK參與骨重建的激素調(diào)節(jié)。將AMPK激動(dòng)劑二甲雙胍置于實(shí)驗(yàn)性根尖周炎大鼠的根管內(nèi)，可抑制部分成骨細(xì)胞凋亡，減少骨吸收，并抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶表達(dá)和單核細(xì)胞募集，達(dá)到改善根尖周炎的效果[35]。也有報(bào)道[36]表明二甲雙胍可以通過(guò)促成骨細(xì)胞分化來(lái)增加患牙周炎大鼠的骨密度和牙槽骨礦化。這些發(fā)現(xiàn)都提示AMPK在體內(nèi)外骨再生中起著不可忽視的作用。

3 AMPK成骨的機(jī)制

骨骼主要通過(guò)三種細(xì)胞類型(成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和骨細(xì)胞)進(jìn)行吸收和重建，在正常骨骼的吸收和重建過(guò)程之間具有微妙的平衡。AMPK被激活后，一方面可直接抑制破骨細(xì)胞的生成[37]；另一方面可刺激成骨細(xì)胞中骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)的生成、減少RANKL的表達(dá)而間接抑制破骨細(xì)胞的分化[38]。此外，Yokomoto等[22]發(fā)現(xiàn)激活A(yù)MPK可顯著降低小鼠長(zhǎng)骨細(xì)胞中RANKL的表達(dá)，敲除AMPKα1后，RANKL表達(dá)顯著提高。組織蛋白酶K(Cathepsin K，CTSK)和抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)是破骨細(xì)胞產(chǎn)生以及骨吸收的關(guān)鍵因素。用二甲雙胍處理大鼠成骨細(xì)胞后，細(xì)胞分泌的上清液可顯著抑制破骨細(xì)胞的形成及CTSK和TRAP的表達(dá)，增加骨量[38]。也有研究[39]報(bào)道，高糖環(huán)境可促進(jìn)AMPK磷酸化，抑制活化T細(xì)胞1(nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 1，NFATc1)，從而抑制下游因子脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase，SYK)、CTSK和TRAP的表達(dá)，還可影響骨吸收和破骨細(xì)胞的分化。因此，AMPK可能在骨形成和骨吸收中起到關(guān)鍵作用。

血管生成在器官形成和傷口恢復(fù)中起著重要作用，缺血是影響骨愈合的主要危險(xiǎn)因素之一。血管在提供氧氣的同時(shí)充當(dāng)成骨細(xì)胞運(yùn)輸?shù)墓艿繹40]。血管活性腸肽可增加大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達(dá)，通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，在體外促進(jìn)BMSCs成骨和血管生成分化，促進(jìn)體內(nèi)骨修復(fù)[41]。BMSCs來(lái)源的外泌體通過(guò)促進(jìn)成骨和血管生成在大鼠骨折模型的治療中起著關(guān)鍵作用，這種促進(jìn)作用可能與激活BMP-2/SMAD1/RUNX2和HIF-1α/VEGF信號(hào)通路有關(guān)[42]，而AMPK激活可以促進(jìn)成血管-成骨因子VEGFA、BMP-2的產(chǎn)生[43]。有研究[44]報(bào)道在糖尿病患者體內(nèi)觀察到血管內(nèi)皮祖細(xì)胞功能受損，并且伴有AMPK激活減少。促紅細(xì)胞生成素等藥物可以激活A(yù)MPK促進(jìn)小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，并增加缺血肢體的毛細(xì)血管密度[45-46]。以上研究表明，AMPK可以通過(guò)調(diào)節(jié)血管生成促進(jìn)骨再生。

既往研究表明，自噬與MSCs成骨分化、腫瘤、糖尿病以及免疫失調(diào)等疾病密切相關(guān)。一方面，AMPK促成骨的機(jī)制可能與其正調(diào)控細(xì)胞的自噬有關(guān)。有研究[47]表明，AMPK可通過(guò)AMPK/mTOR/UKL通路調(diào)控細(xì)胞自噬。線粒體磷酸烯醇丙酮酸羧增多能夠引起MSCs中AMPK/UNC-51活化并促進(jìn)細(xì)胞自噬，最終促進(jìn)成骨分化[48]。芒果苷可通過(guò)激活A(yù)MPK通路引起軟骨細(xì)胞的自噬，從而促進(jìn)軟骨內(nèi)成骨，改善骨修復(fù)效果[49]。神經(jīng)肽P物質(zhì)可經(jīng)由AMPK和mTOR途徑誘導(dǎo)大鼠來(lái)源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞自噬，減少活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)產(chǎn)生，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[50]。另一方面，抑制AMPK信號(hào)通路后，細(xì)胞的自噬下調(diào)，MSCs的成骨分化也受到抑制[48]。這些研究表明AMPK調(diào)節(jié)骨代謝的作用可能與其影響自噬密切相關(guān)。

盡管有大量研究報(bào)道激活A(yù)MPK可正調(diào)控體內(nèi)外的骨形成，但亦有部分研究報(bào)道得到相反的結(jié)果。Kasai等[51]的研究認(rèn)為，二甲雙胍激活A(yù)MPK后，MC3T3E和大鼠來(lái)源原代成骨細(xì)胞的成骨分化受到明顯抑制。Jeyabalan 等[40]報(bào)道二甲雙胍對(duì)體內(nèi)成骨作用無(wú)影響。Baston等[52]發(fā)現(xiàn)，AMPK的激活劑二甲雙胍對(duì)非糖尿病大鼠鈦植入物的骨愈合產(chǎn)生負(fù)面影響，其主要機(jī)制可能是降低植入物周圍骨、植入物接觸與骨面積的百分比以及增加RANKL的表達(dá)。由此可見，AMPK在骨代謝的具體作用仍存在爭(zhēng)議。

4 展望

作為“代謝調(diào)節(jié)器”，AMPK對(duì)機(jī)體多個(gè)生理過(guò)程具有調(diào)節(jié)作用，近年來(lái)其在調(diào)節(jié)骨代謝中的重要作用也逐漸受到重視。AMPK有望作為治療骨質(zhì)疏松癥和骨缺損的一個(gè)潛在靶點(diǎn)，但是尚無(wú)體內(nèi)研究支持AMPK的直接激活可以促進(jìn)成骨。另外目前研究中使用的AMPK激動(dòng)劑對(duì)骨組織并非具有特異性，且AMPK對(duì)細(xì)胞的廣泛作用使其難以體內(nèi)應(yīng)用。考慮到AMPK在骨組織表達(dá)的亞型與其他組織不同，開發(fā)靶向骨組織的特異性AMPK激動(dòng)劑可克服上述困難。對(duì)于AMPK作用于骨代謝的具體機(jī)制、特異性激活藥物的開發(fā)仍有待研究，需要進(jìn)一步深入探索。