趙仁清 孫龍飛 顧莤

揚(yáng)州大學(xué)體育學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127

骨質(zhì)疏松癥是影響老年人健康的重要問(wèn)題，骨質(zhì)疏松可增加骨折風(fēng)險(xiǎn)，并且骨折后愈合效果不佳[1]。目前我國(guó)有近2億老年人口，因此，預(yù)防骨質(zhì)疏松癥成為迫切的任務(wù)。有研究表明耐力運(yùn)動(dòng)明顯改善骨質(zhì)疏松小鼠骨組織微觀結(jié)構(gòu)、預(yù)防骨量丟失[2-3]。機(jī)械力刺激可通過(guò)促進(jìn)成骨細(xì)胞分化、增加骨合成，抑制破骨細(xì)胞分化，減少骨吸收，維持骨代謝正平衡[4-5]；但其調(diào)節(jié)機(jī)制目前還不完全清楚。Linc-ROR是新近發(fā)現(xiàn)的長(zhǎng)鏈非編碼 RNA，在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后多個(gè)層面修飾基因表達(dá)、調(diào)控成骨細(xì)胞分化[6]；Linc-ROR的表達(dá)受到運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)；張宇等[7]研究發(fā)現(xiàn)耐力運(yùn)動(dòng)可影響小鼠腦組織Linc-ROR的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)組織修復(fù)。最近研究表明，Linc-ROR在多種組織中與Wnt/β-catenin信號(hào)系統(tǒng)協(xié)同調(diào)控細(xì)胞增殖、分化[8-9]。鑒于Linc-ROR和Wnt/β-catenin 信號(hào)系統(tǒng)均是調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化、促進(jìn)骨形成的重要信號(hào)通道。因此，本研究建立小鼠骨質(zhì)疏松運(yùn)動(dòng)干預(yù)模型，探討linc-ROR/Wnt/β-catenin信號(hào)通道參與運(yùn)動(dòng)預(yù)防骨質(zhì)疏松的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與運(yùn)動(dòng)方案

24只三月齡C57BL雌性小鼠購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)動(dòng)物中心，小鼠購(gòu)進(jìn)后隨機(jī)分配每籠8只，25 ℃恒溫喂養(yǎng)，自然光照，自由攝食飲水。小鼠適應(yīng)性一周后，以4%水合氯醛經(jīng)腹腔麻醉，皮膚消毒后在脊柱兩側(cè)1 cm處分別切開皮膚和肌肉層，將脂肪組織、輸卵管和卵巢取出，結(jié)扎輸卵管并去除卵巢，假手術(shù)安靜組去除等量的卵巢周圍脂肪，傷口縫合。術(shù)后將24只小鼠分為3組：(1)假手術(shù)組(Sham)；(2)卵巢切除組(Ovx)；(3)卵巢切運(yùn)動(dòng)組(Ex)。運(yùn)動(dòng)組小鼠于術(shù)后第3周進(jìn)行適應(yīng)性運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，逐漸達(dá)到預(yù)定負(fù)荷(0.8 km/h，45 min/d；坡度：-9 ℃；5 d/周，共8 周)[3]，其余組不進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)，每周記錄各組小鼠體重變化。于最后一次訓(xùn)練結(jié)束24 h后采用4%水合氯醛麻醉小鼠，收集血液并存放在抗凝管，以5 000 r/min離心10 min，取上層血清置-80 ℃冰箱中保存，用于檢測(cè)血清激素及生化因子；取雙側(cè)股骨、脛骨并在-80 ℃冰箱中保存，檢測(cè)microCT、mRNA表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)由揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(YZUDWLL-201905-001)。

1.2 micro-CT檢測(cè)

取小鼠取右側(cè)股骨置于75%酒精中保存用于骨密度檢測(cè)。采用美國(guó)Bruker Skyscan系統(tǒng)檢測(cè)體積骨密度(vBMD)、BV/TV、Tb.Th(trabecular thickness)、Tb.N(trabecular number)和 Tb.Sp，分辨率為10 μm，

1.3 血清激素、生化因子檢測(cè)

采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血液激素及相關(guān)生化指標(biāo)：血清雌二醇(estradiol，E2)、骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)、RANKL(receptor activator of NF-κB ligand)。試劑盒購(gòu)自江萊生物公司(上海，中國(guó))，檢測(cè)流程按試劑盒生產(chǎn)商提供的說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4 ALP 染色

左側(cè)股骨用10%乙二胺四乙酸脫鈣液脫鈣，石蠟包埋、切片。把切片浸入ALP孵育液(堿性磷酸酶染色液，Solarbio)，置于37 ℃孵育2～12 h。清洗2 min后，浸入硝酸鈷溶液中，37 ℃孵育5 min。流水沖洗5 min，再蒸餾水清洗。配制ALP硫化工作液，切片浸入硫化工作液中，孵育2 min。流水洗10 min，再用蒸餾水清洗，然后核固紅復(fù)染細(xì)胞核，蒸餾水清洗。400倍鏡下 ALP+成骨細(xì)胞(OB)計(jì)數(shù)。

1.5 real time RT-PCR檢測(cè)

小鼠左側(cè)脛骨用PBS清洗后，于研磨機(jī)內(nèi)液氮環(huán)境下研磨成粉，以Trizol法(Trizol試劑盒，CWBIO 康為世紀(jì))提取總RNA(超純RNA提取試劑盒，CWBIO 康為世紀(jì))。采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，并通過(guò)A230 nm、A325 nm和A260 nm/A280 nm的值，觀察樣本被污染的程度及RNA純度。引物序列由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司設(shè)計(jì)并合成(表1)。

表1 目的基因引物序列Table 1 Primer sequences of the target genes

取1 μg總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(生命互聯(lián)公司)進(jìn)行熒光定量PCR測(cè)試。95 ℃ 10 min預(yù)變性后，95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40 cycles。程序運(yùn)行結(jié)束以后，測(cè)得Ct值并觀察溶解曲線，實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定系統(tǒng)自動(dòng)記錄目的基因及內(nèi)參基因β-Actin的Ct值，采用2-△△Ct法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 Western blot檢測(cè)

取右脛骨于研磨機(jī)內(nèi)液氮環(huán)境下研磨成粉，加入含有蛋白酶抑制劑的組織裂解液，于冰上勻速研磨15 min。4 ℃、13 000 r/min、離心15 min，取上清。以BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，按試劑盒(普利萊基因技術(shù)有限公司)說(shuō)明書完成。取各標(biāo)本蛋白140 μg，加5×loading buffer，混勻，100 ℃煮沸15 min。將樣品加入SDS-PAGE膠中，濃縮膠100 V，分離膠120 V，恒壓電泳。采用濕式轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，冰浴中，300 mA恒流轉(zhuǎn)膜160 min。用5%BSA室溫封閉l h后，加入一抗(Wnt3a、β-catenin和β-actin，購(gòu)自中杉金橋公司)，4 ℃冰箱過(guò)夜。第2天從冰箱將PVDF膜拿出，用TBST洗膜(5 min×3次)，加入二抗(購(gòu)自中杉金橋公司)室溫孵育1 h。曝光顯影：60 min，TBST洗膜，取出PVDF膜，將超敏發(fā)光液(RJ239676，賽默飛公司)置于PVDF上以超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影拍照并進(jìn)行分析。將Wnt3a及β-catenin的光密度值分別與相應(yīng)的β-actin比值作為其蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用組平均值±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行報(bào)道，采用 one-way ANOVA方法檢測(cè)各組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所有數(shù)據(jù)采用 STATA15統(tǒng)計(jì)軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況及血清激素、生化因子變化

三組小鼠體重在實(shí)驗(yàn)前沒(méi)有顯著差異，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后Ovx小鼠體重明顯高于Sham組小鼠，運(yùn)動(dòng)可改善體重增加現(xiàn)象。Ovx小鼠子宮重量明顯低于對(duì)照組，運(yùn)動(dòng)也不能改善Ovx小鼠子宮萎縮現(xiàn)象。運(yùn)動(dòng)可改善Ovx小鼠血清E2、OPG下降及RANKL升高變化趨勢(shì)(表2)。

表2 實(shí)驗(yàn)前后小鼠一般情況變化Table 2 Changes of characteristics of the mice before and after the experiment

2.2 骨密度、骨形態(tài)學(xué)變化

Ovx導(dǎo)致小鼠皮質(zhì)骨、松質(zhì)骨 vBMD明顯下降，運(yùn)動(dòng)可改善骨密度下降現(xiàn)象(圖1)。Ovx小鼠骨體積(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)及數(shù)量(Tb.N)明顯減少，而骨小梁寬度(Tb.Sp)增加；運(yùn)動(dòng)明顯改善卵巢切除導(dǎo)致的這些變化(圖2)。

圖1 各組小鼠骨密度變化Fig.1 Changes of vBMD in mice in each group

圖2 各組小鼠骨形態(tài)學(xué)變化Fig.2 Changes of bone morphology in mice in each group

2.3 骨組織ALP染色

骨組織ALP染色提示，Sham組小鼠ALP+OB細(xì)胞數(shù)量較多(圖3A)，而 Ovx小鼠ALP+OB 細(xì)胞數(shù)量明顯減少(圖3B)，運(yùn)動(dòng)可明顯增加 Ovx小鼠骨組織中ALP+OB 細(xì)胞數(shù)量(圖3C)

圖3 各組小鼠骨組織 ALP+染色Fig.3 Changes of ALP+ in bone tissue in mice in each group

2.4 Linc-ROR、Wnt 3a和β-catenin表達(dá)變化

與 Sham 組小鼠相比，Ovx小鼠骨組織中Linc-ROR以及Wnt 3a、β-catenin mRNA水平下降，而8周運(yùn)動(dòng)干預(yù)可增加Linc-ROR表達(dá)，Wnt 3a和β-

catenin mRNA水平也明顯升高(表3)。Ovx小鼠Wnt 3a[(0.362±0.142)%]和β-catenin[(0.275±0.160)%]蛋白表達(dá)量下降，而運(yùn)動(dòng)干預(yù)可明顯改善Wnt 3a(0.896±0.462)和β-catenin(1.026±0.412)蛋白表達(dá)水平(圖4)。

圖4 各組小鼠蛋白表達(dá)變化Fig.4 Changes of proteins in mice in each group

表3 各組小鼠 Linc-ROR以及Wnt 3a、β-catenin mRNA表達(dá)變化Table 3 Changes of Linc-ROR, and Wnt 3a and β-catenin mRNAs in mice in each group

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)8周耐力運(yùn)動(dòng)能明顯改善卵巢切除小鼠骨量丟失、骨微觀結(jié)構(gòu)破壞現(xiàn)象，并且運(yùn)動(dòng)還增加骨組織中ALP+OB細(xì)胞數(shù)量；運(yùn)動(dòng)上調(diào)Linc-ROR、Wnt 3a和β-catenin mRNA表達(dá)，提示運(yùn)動(dòng)可能通過(guò)調(diào)控Linc-ROR/Wnt 3a/β-catenin信號(hào)通路、增加成骨細(xì)胞合成，從而減少骨量丟失，改善骨微觀結(jié)構(gòu)。

本研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)改善卵巢切除小鼠骨量丟失、骨微觀結(jié)構(gòu)破壞現(xiàn)象的同時(shí)，增加骨組織中成骨細(xì)胞數(shù)量(ALP+OB)，表明運(yùn)動(dòng)可能通過(guò)促進(jìn)成骨細(xì)胞合成、增加骨量、改善骨微觀結(jié)構(gòu)。運(yùn)動(dòng)對(duì)骨組織產(chǎn)生的機(jī)械力刺激可直接作用于骨細(xì)胞，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞合成、增加骨量積累，抑制破骨細(xì)胞合成、減少骨吸收，預(yù)防骨質(zhì)疏松[10]。機(jī)械力刺激可通過(guò)多種信號(hào)途徑調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化[11-12]，但與Wnt/β-catenin最為密切。過(guò)表達(dá)LPR5(low density lipoprotein receptor-related protein 5)可上調(diào)機(jī)械力刺激促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[13]，而敲除LPR5則下調(diào)機(jī)械力刺激促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的作用[14]，這表明機(jī)械力可通過(guò)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路調(diào)節(jié)骨代謝。Armstrong等[4]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，機(jī)械力刺激增加β-catenin 在成骨細(xì)胞中的表達(dá)，在雌激素受體-β信號(hào)系統(tǒng)參與下促進(jìn)β-catenin向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，增加下游基因表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化、增強(qiáng)活性，增加骨形成。

有研究表明，機(jī)械力刺激還通過(guò)調(diào)控骨細(xì)胞增加OPG表達(dá)、抑制 SOST/sclerostin表達(dá)促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，減少RANKL分泌，從而抑制破骨細(xì)胞合成，維持骨代謝正平衡[15-16]。這與本研究結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)卵巢切除小鼠血清OPG降低、RANKL升高，運(yùn)動(dòng)可降低血清RANKL水平，增加OPG水平，提示OPG、RANKL水平可能是促進(jìn)成骨細(xì)胞合成、抑制破骨細(xì)胞數(shù)量的一個(gè)重要因素。

本研究還發(fā)現(xiàn)卵巢切除導(dǎo)致骨組織中 Linc-ROR和 Wnt 3a、β-catenin mRNA表達(dá)下降，而運(yùn)動(dòng)可明顯上調(diào)這些基因的表達(dá)。鑒于Linc-ROR是調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化的重要長(zhǎng)鏈非編碼 RNA，在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)(如Runx2等)，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化[17]；并且Linc-ROR表達(dá)也受到運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)[7]，因此，本研究結(jié)果提示運(yùn)動(dòng)通過(guò)上調(diào)Linc-ROR表達(dá)，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞化、預(yù)防骨質(zhì)疏松。Feng等[6]報(bào)道Linc-ROR通過(guò)與miRNA138/145競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，促進(jìn)Wnt/β-catenin信號(hào)系統(tǒng)在成骨細(xì)胞中的表達(dá)，調(diào)控成骨細(xì)胞分化。本研究也發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)上調(diào)Linc-ROR表達(dá)的同時(shí)，Wnt 3a/β-catenin信號(hào)通路表達(dá)也升高。鑒于Linc-ROR與Wnt/β-catenin信號(hào)系統(tǒng)關(guān)系密切，協(xié)同調(diào)節(jié)組織代謝[18]；因此，本研究提示運(yùn)動(dòng)可能通過(guò)上調(diào)Linc-ROR/Wnt/β-catenin信號(hào)通路預(yù)防骨質(zhì)疏松。

4 小結(jié)與展望

本研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)可預(yù)防骨質(zhì)疏松小鼠骨量丟失、改善骨微觀結(jié)構(gòu)，并且闡明運(yùn)動(dòng)可通過(guò)Linc-ROR/Wnt/β-catenin信號(hào)通路預(yù)防骨質(zhì)疏松，為尋找安全有效的骨質(zhì)疏松預(yù)防措施提供理論依據(jù)。由于本實(shí)驗(yàn)主要是在體(invivo)實(shí)驗(yàn)研究，尚有不足之處，比如機(jī)械力刺激上調(diào)成骨細(xì)胞內(nèi)Linc-ROR表達(dá)之后，又通過(guò)哪些分子機(jī)制調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)系統(tǒng)，從而調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化，因此，在以后研究中將開展體外(invitro)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)以闡明此分子機(jī)制。