張敏敏， 王敬華， 葛 平， 王慶忠， 徐 蓉， 劉學(xué)杰， 崔 琳， 錢(qián)誠(chéng)凱， 夏啟航， 陳 蓉

（上海市臨床檢驗(yàn)中心，上海 200126）

近年來(lái)，基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）技術(shù)被廣泛應(yīng)用于臨床常見(jiàn)致病微生物的鑒定工作中，與傳統(tǒng)病原微生物鑒定方法相比，MALDI-TOF MS技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、特異性高、穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確率高、耗能低等優(yōu)點(diǎn)。MALDI-TOF MS可通過(guò)對(duì)病原微生物蛋白指紋圖譜進(jìn)行同源性分析及時(shí)確定致病微生物種屬，對(duì)疾病診斷具有重要意義，有望成為臨床微生物實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作的重要組成部分[1-2]。

上海市臨床檢驗(yàn)中心（Shanghai Center for Clinical Laboratory，SCCL）是上海市臨床檢驗(yàn)質(zhì)量控制組織評(píng)價(jià)機(jī)構(gòu)，2015年開(kāi)始開(kāi)展質(zhì)譜細(xì)菌鑒定室間質(zhì)量評(píng)價(jià)（簡(jiǎn)稱(chēng)室間質(zhì)評(píng)）活動(dòng)。本研究旨在通過(guò)分析2015—2019年質(zhì)譜細(xì)菌鑒定室間質(zhì)評(píng)活動(dòng)反饋結(jié)果，了解上海市及部分其他地區(qū)臨床實(shí)驗(yàn)室（包括獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室）微生物質(zhì)譜檢測(cè)開(kāi)展情況及檢測(cè)質(zhì)量。

1 材料和方法

1.1 室間質(zhì)評(píng)樣本制備

將脫脂牛奶110 ℃條件下15 min高壓蒸汽滅菌，冷卻后分裝0.3 mL到無(wú)菌凍存管中備用。選取美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種庫(kù)（American type culture collection，ATCC）菌株，將其保存到脫脂牛奶保存管內(nèi)，置-80 ℃冰箱冷凍，制備成凍干品，低溫保存。

1.2 方法

1.2.1 室間質(zhì)評(píng)方案設(shè)計(jì) 對(duì)參加SCCL質(zhì)譜細(xì)菌鑒定室間質(zhì)評(píng)活動(dòng)的臨床實(shí)驗(yàn)室發(fā)放室間質(zhì)評(píng)樣本。每年進(jìn)行2次室間質(zhì)評(píng)活動(dòng)，每次發(fā)放5份樣本。要求參評(píng)實(shí)驗(yàn)室根據(jù)臨床標(biāo)本來(lái)源選擇相應(yīng)的培養(yǎng)基，有臨床意義的病原菌菌株采用質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行鑒定，并在規(guī)定日期內(nèi)（樣本接收后10 d內(nèi)）將檢測(cè)結(jié)果上報(bào)至SCCL數(shù)據(jù)庫(kù)，超過(guò)規(guī)定時(shí)間系統(tǒng)將不再接收數(shù)據(jù)。

1.2.2 結(jié)果評(píng)價(jià) 依據(jù)回報(bào)的檢測(cè)結(jié)果與預(yù)期結(jié)果的符合性統(tǒng)計(jì)各實(shí)驗(yàn)室的得分。合格判定原則：菌株正確鑒定到種水平得20分；正確鑒定到屬水平，而種水平錯(cuò)誤，得10分?？偝煽?jī)≥80分為合格。對(duì)成績(jī)進(jìn)行匯總，并對(duì)錯(cuò)誤的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用EXCEL 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以例或率表示。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)室回報(bào)情況

2015—2019年SCCL質(zhì)譜細(xì)菌鑒定室間質(zhì)評(píng)活動(dòng)共發(fā)放樣本50份，菌株涉及27個(gè)屬43個(gè)種。參評(píng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)系統(tǒng)見(jiàn)表1。

表1 參評(píng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)系統(tǒng) 家

2.2 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力評(píng)價(jià)

2015年參加SCCL質(zhì)譜細(xì)菌鑒定室間質(zhì)評(píng)活動(dòng)的臨床實(shí)驗(yàn)室有10家，2019年增加到40家，增加了300%。2015—2019年SCCL共開(kāi)展10次微生物室間質(zhì)評(píng)活動(dòng)，合格率均為100%。其中，2015年第1次室間質(zhì)評(píng)有4家實(shí)驗(yàn)室、2017年第1次和第2次室間質(zhì)評(píng)各有1家實(shí)驗(yàn)室、2018年第2次和2019年第2次室間質(zhì)評(píng)各有3家實(shí)驗(yàn)室未獲得滿(mǎn)分，其余均獲得滿(mǎn)分。發(fā)放的50株菌株中，有45株鑒定結(jié)果符合率為100%，鑒定結(jié)果有誤的菌株有維羅納氣單胞菌、溫和氣單胞菌、中間葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎鏈球菌，符合率分別為60%、94.4%、95.5%、89.7%、92.5%。見(jiàn)表2、表3。

表2 2015—2019年SCCL質(zhì)譜細(xì)菌鑒定室間質(zhì)評(píng)成績(jī)

表3 鑒定結(jié)果有誤的菌株

3 討論

MALDI-TOF MS技術(shù)主要用于臨床各種送檢標(biāo)本分離培養(yǎng)后單菌落的檢測(cè)，目前已被廣泛用于分析血清/血漿、唾液和尿液標(biāo)本，以診斷疾病、識(shí)別健康狀況的潛在生物標(biāo)志物，為臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)提供了一個(gè)簡(jiǎn)單方便的診斷模型[3-5]。MALDI-TOF MS技術(shù)在臨床實(shí)驗(yàn)室中的應(yīng)用不斷被拓展，在微生物鑒定和特殊耐藥微生物同源性分析方面具有一定的前景，也是研究和分析蛋白質(zhì)的有力工具[6]。

SCCL通過(guò)開(kāi)展質(zhì)譜細(xì)菌鑒定室間質(zhì)評(píng)活動(dòng)，對(duì)上海和部分其他地區(qū)醫(yī)療機(jī)構(gòu)微生物質(zhì)譜鑒定能力進(jìn)行了評(píng)價(jià)。（1）參評(píng)實(shí)驗(yàn)室由2015年的10家增加到2019年的40家，增加了300%，提示該檢測(cè)方法正逐步被醫(yī)療機(jī)構(gòu)接受，并運(yùn)用到臨床致病菌的鑒定中?？赡苁强紤]到儀器價(jià)格比較昂貴，目前主要是三級(jí)綜合性醫(yī)院在使用；從鑒定系統(tǒng)的分布看，雖然絕大多數(shù)醫(yī)療機(jī)構(gòu)使用的是進(jìn)口質(zhì)譜儀，但是國(guó)產(chǎn)質(zhì)譜儀也開(kāi)始逐步被醫(yī)療機(jī)構(gòu)選用。（2）5年室間質(zhì)評(píng)的合格率均達(dá)到100%，表明該項(xiàng)目整體檢測(cè)質(zhì)量較好。2015年第1次室間質(zhì)評(píng)有4家實(shí)驗(yàn)室、2017年第1次和第2次室間質(zhì)評(píng)各有1家實(shí)驗(yàn)室、2018年第2次和2019年第2次室間質(zhì)評(píng)各有3家實(shí)驗(yàn)室未獲得滿(mǎn)分，其余均獲得滿(mǎn)分。發(fā)放的50株菌株中，有45株鑒定結(jié)果符合率為100%，但氣單胞菌屬、葡萄球菌屬和鏈球菌屬的鑒定結(jié)果各參評(píng)實(shí)驗(yàn)室略有偏差，提示個(gè)別實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)能力有待進(jìn)一步提高。

實(shí)驗(yàn)室回報(bào)結(jié)果發(fā)生錯(cuò)誤的原因可能有培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基、前處理方法、人員操作、儀器設(shè)備的選擇和校正等多方面的因素。細(xì)菌的培養(yǎng)時(shí)間是一個(gè)非常重要的變量，不同生理?xiàng)l件下的細(xì)菌，如處于休眠、細(xì)胞分裂、老化等狀態(tài)的細(xì)菌，其質(zhì)譜圖會(huì)發(fā)生變化。因此，在對(duì)細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，使細(xì)菌處于一個(gè)穩(wěn)定的狀態(tài)是十分必要的。在對(duì)細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，使用不同培養(yǎng)基對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒別具有重要意義，選擇性培養(yǎng)基可以很容易地識(shí)別出致病菌，有效分離純化致病菌。不同的實(shí)驗(yàn)室采用不同的標(biāo)本處理方法，獲得的結(jié)果也不完全相同，因此檢測(cè)細(xì)菌時(shí)，可以將未經(jīng)處理的標(biāo)本直接進(jìn)樣，但缺點(diǎn)是將會(huì)產(chǎn)生較少的質(zhì)譜峰。對(duì)于較干燥、細(xì)胞壁較厚的菌落，破壁效果會(huì)不理想，核蛋白不能完全被釋放出來(lái)。為了獲得較多的生物標(biāo)志物，提高細(xì)菌檢測(cè)的準(zhǔn)確率，建議在檢測(cè)前對(duì)標(biāo)本進(jìn)行處理，尤其是革蘭染色陽(yáng)性菌的檢測(cè)。要規(guī)范操作流程、建立簡(jiǎn)便而重復(fù)性良好的檢測(cè)方法，如靶板涂抹要均勻，過(guò)薄或過(guò)厚都不能形成較好的結(jié)晶。每次進(jìn)行檢測(cè)前都應(yīng)使用標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)儀器。疑難菌株缺乏特異性峰值或峰值數(shù)量不足，無(wú)法形成圖譜錄入數(shù)據(jù)庫(kù)，因此數(shù)據(jù)庫(kù)還需要不斷完善。

質(zhì)譜細(xì)菌鑒定室間質(zhì)評(píng)是保證各臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)質(zhì)量的重要手段，可以考察參評(píng)實(shí)驗(yàn)室對(duì)臨床微生物項(xiàng)目的檢測(cè)水平，可以反映在檢測(cè)中存在的共性問(wèn)題，及某些實(shí)驗(yàn)室存在的特殊問(wèn)題，促進(jìn)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)水平的提高，從而更好地服務(wù)臨床。相信隨著標(biāo)本處理方法的不斷優(yōu)化，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)的不斷擴(kuò)充、室內(nèi)質(zhì)量控制的不斷加強(qiáng)、微生物檢測(cè)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)和理論知識(shí)的不斷豐富、相關(guān)管理制度的不斷落實(shí)，臨床實(shí)驗(yàn)室微生物質(zhì)譜檢測(cè)質(zhì)量會(huì)越來(lái)越高。