楊靜涵 張智超 張丹參

河北科技大學(xué)化學(xué)與制藥工程學(xué)院，石家莊，050000，中國(guó)

神經(jīng)遞質(zhì)（neurotransmitters，NTs）廣泛分布在哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)和體液中，對(duì)人和動(dòng)物的情緒、覺(jué)醒和認(rèn)知都起重要作用。NTs 主要分為氨基酸、單胺、多肽類(lèi)神經(jīng)活性物質(zhì)。NTs 濃度失衡會(huì)導(dǎo)致多種疾病，如抑郁癥、帕金森病、阿爾茨海默癥（Alzheimer’s disease，AD）等［1］。學(xué)習(xí)記憶能力下降是AD 等癡呆性疾病的主要表現(xiàn)，與腦內(nèi)氨基酸關(guān)系密切。氨基酸是含氨基和羧基的一類(lèi)有機(jī)化合物的統(tǒng)稱，是蛋白質(zhì)的構(gòu)件分子。氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)是腦內(nèi)重要的一類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)，分為興奮性和抑制性兩類(lèi)，人腦的功能取決于興奮性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)和抑制性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)之間的平衡［2］。許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病與氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)密切相關(guān)，測(cè)定它們的含量變化是研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要指標(biāo)［3］。

1 氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)

根據(jù)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）作用的不同，哺乳動(dòng)物氨基酸類(lèi)遞質(zhì)分為兩類(lèi)：①興奮性氨基酸遞質(zhì)：谷氨酸（glutamic acid，Glu）、天冬氨酸（aspartic acid，Asp）等；②抑制性氨基酸遞質(zhì)：γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、甘氨酸（glycine，Gly）等。

1.1 興奮性氨基酸對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的作用

腦內(nèi)興奮性氨基酸（excitatory amino acids，EAA）通過(guò)位于神經(jīng)元細(xì)胞膜上的受體發(fā)揮多種生理效應(yīng)，EAA 受體幾乎存在于所有神經(jīng)細(xì)胞上，在興奮性突觸傳遞、神經(jīng)元可塑性（發(fā)育、學(xué)習(xí)記憶）等方面起重要作用。

關(guān)于興奮性氨基酸興奮毒性的機(jī)理，涉及神經(jīng)元去極化，神經(jīng)元腫脹，Ca2+內(nèi)流和第二信使等一系列復(fù)雜的過(guò)程［4］。研究發(fā)現(xiàn)，EAA 對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞具有強(qiáng)烈的興奮性，直接將一定量的Glu 或Asp 注入動(dòng)物大腦，會(huì)引起驚厥。生理?xiàng)l件下，Glu 主要是作為興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，同時(shí)又是GABA 的前體物質(zhì)，其濃度過(guò)高會(huì)產(chǎn)生神經(jīng)毒性。此外N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-Daspartic acid，NMDA）和α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionicacid，AMPA）受 體激活導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流以及Ca2+在線粒體內(nèi)快速的堆積，使得線粒體功能喪失。NMDA 受體的興奮還可增加一氧化氮合酶的活性，使一氧化氮合成增加導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用。Glu 作用于G 蛋白偶聯(lián)受體，抑制超極化電流，使神經(jīng)元興奮性增高，還可通過(guò)突觸調(diào)制改變Glu 自身及GABA 的釋放及突觸的可塑性，間接改變神經(jīng)元的電活動(dòng)。

1.2 抑制性氨基酸對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的作用

中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)是GABA，GABA 在腦內(nèi)廣泛分布，對(duì)GABA 敏感的神經(jīng)元主要集中于下丘腦、丘腦、大腦皮層，具有興奮抑制、抗癲癇、神經(jīng)保護(hù)的作用，臨床上許多的鎮(zhèn)靜催眠藥都是通過(guò)結(jié)合GABA 受體增強(qiáng)GABAA受體突觸后作用的。Gly 在調(diào)控神經(jīng)元興奮性方面也發(fā)揮重要的作用，Gly 能神經(jīng)元主要集中在脊髓和腦干，而且在間腦和中腦也有表達(dá)。Gly 的受體和GABAA受體屬同一家族，作用與GABA 類(lèi)似，主要功能是對(duì)運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)抑制性調(diào)控。

GABA 能夠降低大腦興奮性從而抑制突觸傳遞。研究表明Glu/GABA 比值過(guò)高會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，導(dǎo)致神經(jīng)元受損出現(xiàn)認(rèn)知障礙，而比值過(guò)低也會(huì)抑制突觸可塑性形成和記憶的存儲(chǔ)［2］。

2 腦內(nèi)氨基酸含量測(cè)定的方法

目前，腦內(nèi)氨基酸含量測(cè)定的方法有氨基酸分析儀測(cè)定法、高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、毛細(xì)管電泳法、氣相色譜法等，現(xiàn)對(duì)這些方法進(jìn)行歸納總結(jié)，以期為研究者準(zhǔn)確快速測(cè)定腦內(nèi)氨基酸含量提供參考［5］。

2.1 氨基酸分析儀測(cè)定法

基于Moore 和Stein 的工作，專屬性較強(qiáng)的氨基酸分析儀得以問(wèn)世［6］。氨基酸分析儀作為一種專門(mén)用來(lái)分析氨基酸的液相色譜儀，基本結(jié)構(gòu)和普通的高效液相色譜相似，在離子交換色譜的原理指導(dǎo)下制成，通常采用磺酸型陽(yáng)離子樹(shù)脂分離。用于氨基酸分析儀的樣品都需用pH 為2.2 的緩沖液溶解配制，因?yàn)檠褐邪被嵩诘蚿H 的條件下都是帶正電荷的，陽(yáng)離子樹(shù)脂本身帶有負(fù)電荷，兩者正負(fù)相互吸引結(jié)合，且氨基酸所帶正電荷越多，結(jié)合的越緊密。不同氨基酸與離子交換樹(shù)脂親和力由強(qiáng)到弱依次為：堿性氨基酸>芳香族氨基酸>中性氨基酸>酸性及羥基氨基酸，實(shí)現(xiàn)對(duì)氨基酸的分離之后，采用茚三酮衍生，可見(jiàn)光光度檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)氨基酸檢測(cè)的目的。此種基于柱后茚三酮衍生、離子交換色譜原理制成的氨基酸分析儀被認(rèn)為是生物樣品中氨基酸分析的金標(biāo)準(zhǔn)，因此，氨基酸分析儀仍然是目前臨床實(shí)驗(yàn)室中最常用的方法，該方法主要缺點(diǎn)是分析時(shí)間長(zhǎng)和樣品用量大。

氨基酸分析儀也可利用陰離子交換分離后經(jīng)積分脈沖安培法原理檢測(cè)，該檢測(cè)方法無(wú)需將待測(cè)氨基酸進(jìn)行柱前或柱后衍生，穩(wěn)定性、重現(xiàn)性與高效液相色譜法接近，但其易受血液樣品中蛋白、糖類(lèi)、細(xì)菌等的干擾，測(cè)定血液氨基酸含量時(shí)的準(zhǔn)確度稍低［7］。血液中的氨基酸用專屬儀器進(jìn)行檢測(cè)，樣品前處理較為簡(jiǎn)單，在血清中加入6%磺基水楊酸沉淀蛋白，離心（3 000 r·min-1）15 min，取上清液稀釋后即可上機(jī)分析。Smon 等［8］用氨基酸分析儀分析兒童血漿中的14 種氨基酸，該方法重復(fù)性好，分辨率高，可以檢測(cè)具有代謝疾病患者的氨基酸水平。從氨基酸分析儀整體性能來(lái)看，此類(lèi)儀器技術(shù)門(mén)檻較高，多依賴于進(jìn)口，價(jià)格較貴，較長(zhǎng)的分析時(shí)間（2.5 h），靈敏度與高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）柱前衍生方法相比稍低（HPLC：<0.5 pmol；氨基酸分析儀：<10 pmol），但該檢測(cè)方法在操作簡(jiǎn)便性、分離度、重現(xiàn)性、運(yùn)行成本等方面都優(yōu)于其他分析方法。

2.2 高效液相色譜法

HPLC 是在20 世紀(jì)60 年代末70 年代初發(fā)展起來(lái)的一種新型現(xiàn)代分離分析測(cè)試技術(shù)，經(jīng)過(guò)不斷改進(jìn)，現(xiàn)如今已成為應(yīng)用廣泛的化學(xué)分離分析技術(shù)手段。它在經(jīng)典液相色譜基礎(chǔ)上，引入氣相色譜理論，采用高壓泵、高效固定相及高靈敏檢測(cè)器，因而具備“四高一廣”的特點(diǎn)，即高壓、高速、高效、高靈敏度和應(yīng)用范圍廣。進(jìn)樣方法也越來(lái)越自動(dòng)化，從之前的手動(dòng)進(jìn)樣到現(xiàn)在全自動(dòng)進(jìn)樣，并且高效液相色譜對(duì)化合物結(jié)構(gòu)的破壞性小，適合有機(jī)分子及生物分子分離分析。

HPLC 或毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis，CE）通常會(huì)結(jié)合各種檢測(cè)方法，如紫外檢測(cè)（ultraviolet，UV），熒光檢測(cè)法（fluorescence detection，F(xiàn)LD），電化學(xué)檢測(cè)（electrochemical detection，ECD），激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)（chemiluminescence，CL）和質(zhì)譜法（mass-spectrography，MS）。然而，UV、FLD 和CL檢測(cè)對(duì)多個(gè)氨基酸和NTs 檢測(cè)靈敏度差，且由于電極污染，ECD 檢測(cè)重現(xiàn)性差。因?yàn)闄z測(cè)基于分子質(zhì)量和化學(xué)結(jié)構(gòu)，質(zhì)譜法在分析選擇性方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。

液相色譜中熒光檢測(cè)器的靈敏度要比紫外檢測(cè)器高，近年來(lái)，越來(lái)越多的研究人員選擇熒光檢測(cè)器確定血液或組織樣品中氨基酸的含量，但是液相色譜能分離檢測(cè)的對(duì)象，多數(shù)沒(méi)有熒光，主要依靠熒光衍生化試劑通過(guò)衍生化反應(yīng)在目標(biāo)化合物上接上能發(fā)出熒光的生色基團(tuán)，達(dá)到熒光檢測(cè)的目的。張夏薇等［9］使用高效液相-紫外檢測(cè)器，結(jié)合柱前衍生的方法檢測(cè)出了腦組織樣品中四種氨基酸的含量，線性關(guān)系良好。白潔等［10］采用柱前衍生-高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定血清中氨基酸類(lèi)及單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的含量，除了單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺（dopamine，DA）的檢測(cè)限未達(dá)到要求，?；撬幔╰aurine，Tau）、Glu、Gly、γ-GABA 各項(xiàng)指標(biāo)均良好。

2.3 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）分析法是通過(guò)將待測(cè)物質(zhì)的原子或分子在高速電子流的沖擊下轉(zhuǎn)變帶正電荷的離子，然后經(jīng)加速運(yùn)動(dòng)形成離子流，離子流在磁場(chǎng)（或同時(shí)在電場(chǎng)和磁場(chǎng)）的作用下，按照各種離子的質(zhì)量與其所帶電荷量的比值，即質(zhì)荷比（m/z）大小順序分離開(kāi)來(lái)，形成有規(guī)律的質(zhì)譜圖，并用檢測(cè)器記錄下來(lái)，進(jìn)行定性、定量、結(jié)構(gòu)分析的方法。質(zhì)譜法幾乎是唯一一種能夠準(zhǔn)確確定有機(jī)化合物分子式的方法。質(zhì)譜法分析靈敏度高，比紫外或熒光檢測(cè)器的靈敏度要高1～2 個(gè)數(shù)量級(jí)以上，檢出限可達(dá)10-14g 數(shù)量級(jí)，適用于痕量分析［11］。此外，質(zhì)譜法可以提供豐富的分子碎片信息，用于分子結(jié)構(gòu)分析［12］。

在色譜-質(zhì)譜法中，質(zhì)譜可以和氣相聯(lián)用如GC/MS，也可以和高效液相聯(lián)用如HPLC/MS。并且對(duì)于質(zhì)譜檢測(cè)器，衍生化過(guò)程不是必需的，但為提高血液樣品中氨基酸檢測(cè)的靈敏度和特異性，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法也常采用一些衍生劑。黃鑫等［13］建立了超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法檢測(cè)大鼠海馬和大腦皮層中生物胺類(lèi)及氨基酸類(lèi)神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)含量的方法，電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）在正離子模式下，選擇多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（multiple reaction monitoring，MRM）掃描，對(duì)檢測(cè)的6 種生物胺類(lèi)和11 種氨基酸類(lèi)神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)分別選擇一個(gè)定性離子對(duì)和一個(gè)定量離子對(duì)。測(cè)定wistar 大鼠海馬和大腦皮層中6 種生物胺類(lèi)和11 種氨基酸類(lèi)神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的含量，對(duì)比兩種不同腦組織樣品前處理方法對(duì)神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果的影響。無(wú)需衍生化，17 種神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)在10 min內(nèi)即可完成同時(shí)測(cè)定，檢測(cè)方法線性關(guān)系良好，日內(nèi)和日間精密度、加標(biāo)回收率和重復(fù)性滿足分析要求。由于色譜和質(zhì)譜靈敏度相當(dāng)，另外分離效果很好的色譜可作質(zhì)譜的進(jìn)樣系統(tǒng)，質(zhì)譜作為色譜的鑒定儀器分析速度快，分離好，應(yīng)用廣。高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用成為最好的用于分析微量有機(jī)混合物的儀器。

2.4 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳法（capillary electrophoresis，CE）是以彈性石英毛細(xì)管為分離通道、以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力的新型液相分離技術(shù)，具有分析效率高、分析時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)，其基本原理是根據(jù)帶電物質(zhì)在電場(chǎng)中的電遷移率不同來(lái)對(duì)混合物進(jìn)行分離［14］。由于質(zhì)譜的選擇性和專一性可彌補(bǔ)樣品遷移時(shí)間的不足，同時(shí)提供分子量和結(jié)構(gòu)信息，在毛細(xì)管電泳法對(duì)于生物樣本的分析中，采用質(zhì)譜檢測(cè)比UV 檢測(cè)或電化學(xué)檢測(cè)更通用。毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用法可以為分析體積少的血液樣品（如干燥的血斑）提供氨基酸譜分析的高效微量分離平臺(tái)。相關(guān)研究［15］采用毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用法，對(duì)血漿中的高半胱氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸和谷氨酸的含量進(jìn)行檢測(cè)并定量，采用二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）和乙腈沉淀蛋白，結(jié)果顯示，準(zhǔn)確度重現(xiàn)性均較好。另有研究表明［16］，毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用可在3 min 內(nèi)有效地檢測(cè)血液樣品中的苯丙氨酸，用于篩查新生兒苯丙酮尿癥，僅需采用極少的血液樣本量，即可展現(xiàn)較高的靈敏度和準(zhǔn)確性。采用此種方法，蛋白質(zhì)的去除是關(guān)鍵，血漿中蛋白質(zhì)會(huì)吸附在毛細(xì)管壁上，出現(xiàn)蛋白質(zhì)變性和毛細(xì)管堵塞等問(wèn)題。

2.5 氣相色譜法

氣相色譜法分析氨基酸前首先需要將氨基酸衍生為易于氣化的衍生物。趙楠等［17］探究了氣相色譜結(jié)合負(fù)化學(xué)離子源質(zhì)譜（GC-NCI-MS）法對(duì)脂肪酸、有機(jī)酸、氨基酸的同時(shí)定性、定量方法，并且對(duì)氯甲酸酯類(lèi)和硫酸-甲醇溶液兩種衍生方式做了比較。Hanff 等［18］采用氣相色譜聯(lián)用質(zhì)譜法測(cè)定血漿中的氨基酸，先用酸化的甲醇溶液將氨基酸酯化，再用酸酐進(jìn)行酰胺化，以實(shí)現(xiàn)電子捕獲型負(fù)離子化學(xué)電離，氣相色譜聯(lián)用質(zhì)譜法具有選擇性好、分離時(shí)間短、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，但其衍生步驟復(fù)雜、衍生反應(yīng)干擾多，不適用于不耐熱氨基酸，不能用一根色譜柱實(shí)現(xiàn)全氨基酸測(cè)定，目前在血液氨基酸測(cè)定方面應(yīng)用并不廣泛。

3 衍生化試劑在氨基酸含量測(cè)定中的應(yīng)用

液相色譜中熒光檢測(cè)器的靈敏度要比紫外檢測(cè)器高，但是液相色譜能分離檢測(cè)的對(duì)象，多數(shù)沒(méi)有熒光，主要依靠熒光衍生化試劑通過(guò)衍生化反應(yīng)在目標(biāo)化合物上接上能發(fā)出熒光的生色基團(tuán)，達(dá)到熒光檢測(cè)的目的，常用的衍生劑有異硫氰酸苯酯（phenyl isothiocyanate，PITC）、2，4-二硝基氟苯（2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB）、鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）、9-芴脂（9-fluorenylmethyloxycarbonyl，F(xiàn)MOC）、OPA-FMOC聯(lián)用、丹磺酰氯（Dansyl-Cl）、6-氨基喹啉基-N-羥基-琥珀酰亞氨基甲酸酯（6-aminoquinoline-N-hydroxylsuccinyl carbamate，AQC）等［19］。DNFB 衍生過(guò)程中能夠產(chǎn)生對(duì)測(cè)定結(jié)果有干擾的副產(chǎn)物，PITC 衍生試劑具有揮發(fā)性且具有較大毒性，需真空干燥裝置去過(guò)量衍生劑；FMOC 衍生過(guò)量的反應(yīng)劑必須用戌烷萃取除去［20］；OPA 衍生產(chǎn)物在室溫不穩(wěn)定，分解率高；Dansyl-Cl 反應(yīng)活性較差，反應(yīng)速度慢，且易生成多級(jí)衍生產(chǎn)物干擾測(cè)定。AQC 可與伯胺和仲胺反應(yīng)生成穩(wěn)定的衍生物脲，其衍生物有很強(qiáng)的紫外吸收和熒光吸收，衍生操作簡(jiǎn)單，衍生速度快，過(guò)量的試劑能自然水解，不需要特殊的處理或提??；而且還不受樣品基質(zhì)、大量電解質(zhì)、維生素和微量元素的干擾，特別適用于食品等復(fù)雜基質(zhì)中氨基酸的分析［21］。

傳統(tǒng)衍生化試劑在應(yīng)用中有或多或少地限制，如穩(wěn)定性差、檢測(cè)靈敏度低，操作不便，衍生化試劑的合成困難，色譜分離干擾嚴(yán)重等。繼續(xù)開(kāi)發(fā)新型質(zhì)譜增敏衍生試劑用于復(fù)雜基質(zhì)中痕量物質(zhì)的溫和、快速、靈敏度高、多種成分同時(shí)檢測(cè)分析，具有十分重要的意義。

綜上，血液和組織中的氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)技術(shù)主要有氨基酸分析儀、高效液相色譜儀及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀等。GB 5009.124-2016 采用的是離子交換茚三酮柱后衍生的方法，該方法中使用的氨基酸自動(dòng)分析儀價(jià)格昂貴，用途專一，靈活性差，大大限制了其推廣和使用。而液相色譜分析法，普適性廣，具有分析速度快，靈敏度高，操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，已成為檢測(cè)氨基酸的首選方法。因氨基酸和?；撬釋儆跇O性大且無(wú)紫外吸收的一類(lèi)化合物，故需進(jìn)行衍生化。當(dāng)今，基于質(zhì)譜法的技術(shù)越來(lái)越多的用于生物樣品的多種代謝物分析，以進(jìn)行靶向代謝組學(xué)研究。超高壓液相色譜是一種新型液相色譜技術(shù)，可顯著改善色譜峰的分離度和檢測(cè)靈敏度，同時(shí)大大縮短分析周期。超高壓液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（ultra high pressure liquid chromatography mass spectrometry，UPLC-MS）已經(jīng)成為氨基酸分析的一種很有前景的方法［22］。超高效液相色譜與多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式的串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）結(jié)合，可在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行色譜分離，快速、靈敏和特異性地定量多種分析物。