王 浦 陳 燁

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院消化內(nèi)科(510515)

背景：艱難梭菌感染(CDI)是最常見的機(jī)會(huì)致病菌感染，抗菌藥物是一線治療用藥，但存在治療效果不佳、感染復(fù)發(fā)、再燃等情況，有必要開發(fā)新型的抗感染藥物。目的：探討SR1001對(duì)CDI的干預(yù)作用及其潛在機(jī)制，探尋潛在的干預(yù)靶標(biāo)。方法：培養(yǎng)艱難梭菌(C.difficile)，將結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞分為對(duì)照組、CDI組(感染C.difficile)和SR1001治療組(感染C.difficile+SR1001干預(yù)治療)，觀察HT-29細(xì)胞形態(tài)改變情況，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路表達(dá)情況，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中TcdB含量。結(jié)果：與對(duì)照組相比，CDI組細(xì)胞透亮變圓，凋亡明顯；細(xì)胞增殖受抑制情況隨時(shí)間延長(zhǎng)而加重，且細(xì)胞增殖能力明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，PI3K/AKT/mTOR通路磷酸化蛋白表達(dá)明顯升高，上清液中TcdB含量明顯增高(P<0.05)。給予SR1001治療后，細(xì)胞趨于正常“鋪路石”樣排列，凋亡改善，細(xì)胞增殖能力明顯高于CDI組，PI3K/AKT/mTOR通路磷酸化蛋白表達(dá)明顯降低，上清液中TcdB含量明顯減少。結(jié)論：SR1001可通過干擾PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路磷酸化，逆轉(zhuǎn)C.difficile對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。

艱難梭菌(C.difficile)是一種革蘭陽性厭氧芽孢桿菌，艱難梭菌感染(Clostridiumdifficileinfection, CDI)是目前最常見的醫(yī)院獲得性感染之一[1]。C.difficile定植于腸道，當(dāng)宿主腸道菌群失衡時(shí)，C.difficile大量生長(zhǎng)，釋放毒素TcdB，造成細(xì)胞骨架破壞，凋亡壞死，破壞上皮屏障，引起CDI的發(fā)生。輕癥感染僅引起腹瀉，重癥感染可發(fā)展為偽膜性腸炎，甚至中毒性巨結(jié)腸、腸穿孔等并發(fā)癥。

輔助性T細(xì)胞17(Th17細(xì)胞)參與多種感染性疾病和炎性疾病[2-3]。有研究表明，Th17細(xì)胞通過分泌IL-17誘發(fā)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)CDI的發(fā)生[4-5]。Yu等[6]通過檢測(cè)CDI中的IFNs，發(fā)現(xiàn)重癥CDI患者Th1細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)門h17細(xì)胞。維甲酸相關(guān)孤核受體(RORs)參與Th17炎性細(xì)胞IL-17分泌等功能的調(diào)控[7]。SR1001可非特異性拮抗RORα與RORγt活性，抑制IL-17的產(chǎn)生，從而改善疾病的癥狀，減緩疾病的發(fā)生、發(fā)展。本研究通過建立C.difficile細(xì)胞感染模型并給予SR1001藥物干預(yù)，旨在探討SR1001對(duì)CDI的治療作用及其機(jī)制。

材料與方法

一、細(xì)胞和主要試劑

人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞由南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院消化科保種培養(yǎng)傳代，C.difficile菌株購自ATCC公司，DMEM培養(yǎng)基和胰酶購自Hyclone公司，胎牛血清購自Gibco公司，CCFA和BHI購自北京索萊寶科技有限公司，SR1001購自MedChemExpress公司，PI3K、AKT、mTOR、p-AKT、p-mTOR購于Abcam，p-PI3K購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，CCK-8檢測(cè)試劑盒購于碧云天生物技術(shù)有限公司，人艱難梭菌毒素B(TcdB)ELISA試劑盒購于江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司。

二、研究方法

1.C.difficile培養(yǎng)：將C.difficile菌株接種于CCFA培養(yǎng)皿中。37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h后，接種于BHI液體培養(yǎng)24 h，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)量波長(zhǎng)600 nm處的吸光度值(A值)，將菌懸液濃度調(diào)整至1×108CFU/mL，2 000 r/min 4 ℃離心10 min，取上清液，用于后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

2.細(xì)胞培養(yǎng)和分組：結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞中加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于5% CO2、37 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)。使用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液并接種于96孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%時(shí)，將細(xì)胞分為對(duì)照組、CDI組和SR1001治療組，對(duì)照組不作任何處理，CDI組細(xì)胞加入1×108CFU/mLC.difficile培養(yǎng)上清液，SR1001治療組加入1×108CFU/mLC.difficile培養(yǎng)上清液+5 μmol/L SR1001，孵育48 h。

3.CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖：取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于96孔板上，每孔約2 000個(gè)細(xì)胞。分別于培養(yǎng)0、12、24、48 h時(shí)加入10 μL CCK-8溶液孵育2 h，上酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的A值，繪制生長(zhǎng)曲線。

4.蛋白質(zhì)印跡法：將各組HT-29細(xì)胞鋪于6孔板中，RIPA裂解法提取蛋白，BCA蛋白定量后，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育抗體(PI3K、AKT、mTOR、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR工作濃度均為1∶1 000；GAPDH工作濃度為1∶20 000)，ECL發(fā)光顯色，檢測(cè)PI3K/AKT/mTOR通路磷酸化蛋白表達(dá)情況。

5.ELISA法：根據(jù)試劑盒說明書，取各組孵育48 h后的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，檢測(cè)TcdB含量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、SR1001減輕C.difficile對(duì)HT-29細(xì)胞的毒性作用

與對(duì)照組(圖1A)相比，CDI組細(xì)胞變圓透亮，凋亡明顯，失去正常細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)(圖1B)。SR1001治療組細(xì)胞部分恢復(fù)生長(zhǎng)形態(tài)，呈“鋪路石”樣排列(圖1C)。

A：對(duì)照組；B：CDI組；C：SR1001治療組

二、SR1001可拮抗C.difficile的抑制作用

CCK-8法結(jié)果顯示，CDI組細(xì)胞增殖受到明顯抑制，并隨時(shí)間延長(zhǎng)而加重(P=0.00)，48 h時(shí)細(xì)胞增殖能力明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，而給予SR1001治療后，細(xì)胞增殖能力有所改善(P<0.05；圖2、表1)。證實(shí)SR1001可通過改善細(xì)胞增殖能力來發(fā)揮抑制C.difficile毒性的作用。

圖2 CCK-8實(shí)驗(yàn)測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)HT-29細(xì)胞的增殖能力

三、SR1001可降低C.difficile感染HT-29細(xì)胞后PI3K/AKT/mTOR通路磷酸化蛋白表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，C.difficile感染可使p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表達(dá)較對(duì)照組明顯升高，經(jīng)SR1001治療后，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)明顯降低(圖3、表1)，而三組PI3K、AKT、mTOR總蛋白含量無明顯差異。提示SR1001可通過調(diào)控PI3K/AKT/mTOR通路改善C.difficile感染情況。

1 Da=0.992 1 u

表1 SR1001對(duì)細(xì)胞增殖、PI3K/AKT/mTOR通路磷酸化蛋白表達(dá)以及C.difficile定植的作用

四、SR1001可抑制C.difficile定植

ELISA法結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CDI組細(xì)胞上清液中TcdB含量明顯升高，給予SR1001治療后，上清液中TcdB含量明顯降低(圖4、表1)。說明SR1001可抑制C.difficile在細(xì)胞中的定植。

圖4 ELISA法測(cè)定HT-29細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TcdB含量

討 論

近年來，CDI居高不下的感染率越來越引起關(guān)注[8]。C.difficile毒素TcdB作用于腸上皮細(xì)胞，破壞細(xì)胞骨架，誘導(dǎo)細(xì)胞壞死凋亡，破壞上皮完整性[9]，從而誘導(dǎo)多種病變。多種因素參與CDI的發(fā)生、進(jìn)展，炎癥反應(yīng)是CDI發(fā)生過程中的重要因素，Th17細(xì)胞是促炎細(xì)胞的亞群之一，可促進(jìn)炎癥反應(yīng)，分泌多種促炎因子[10]。IL-17是Th17細(xì)胞分泌的重要的炎癥因子，IL-17失衡可引起過度反應(yīng)，從而導(dǎo)致腸道組織破壞，RORs作為特異性轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)控IL-17分泌。目前，多種研究表明，RORs特異性逆激動(dòng)劑可有效控制與Th17細(xì)胞相關(guān)的自身免疫病[7,11-14]。SR1001是一種高選擇性和特異性RORs逆激動(dòng)劑，可抑制Th17細(xì)胞分化和功能[7]。本研究中，以SR1001干預(yù)C.difficile感染細(xì)胞，可明顯改善細(xì)胞毒性作用，逆轉(zhuǎn)C.difficile對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，并可抑制C.difficile定植。

Th17細(xì)胞產(chǎn)生IL-17作為Th亞群參與上皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的多重免疫反應(yīng)，抵抗外來微生物，并參與各種自身免疫病的發(fā)展。Th17細(xì)胞的分化受細(xì)胞內(nèi)一系列信號(hào)級(jí)聯(lián)和復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)的控制。最近研究表明，PI3K/AKT/mTOR通路參與細(xì)胞代謝、增殖、分化等諸多過程，該通路通過調(diào)節(jié)STAT3磷酸化、調(diào)控HIF-1α表達(dá)以及激活RORγt核移位、下調(diào)Gfi1等多種機(jī)制正向調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞的分化，是Th17細(xì)胞形成的重要經(jīng)典途徑[15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)C.difficile感染細(xì)胞后，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表達(dá)較對(duì)照組明顯升高，而SR1001干預(yù)治療后，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)較CDI組均有所下降，說明SR1001可通過干預(yù)PI3K/AKT/mTOR通路抑制C.difficile感染。

綜上所述，本研究通過建立C.difficile感染的體外模型，并給予SR1001干預(yù)治療，揭示SR1001可通過下調(diào)p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表達(dá)來抑制PI3K/AKT/mTOR通路，從而緩解C.difficile毒素作用，促進(jìn)細(xì)胞增殖，同時(shí)可抑制C.difficile定植，為進(jìn)一步研究CDI的免疫機(jī)制，探尋CDI干預(yù)靶標(biāo)，以及CDI的防治提供了一定的參考和依據(jù)。