魏華恒，黎茂英，李永紅，鄧 艷 ，阮梅蘭 ，邢 巧 ，王 操 ，王 強(qiáng)，謝躍杰

（1重慶第二師范學(xué)院脂質(zhì)資源及兒童日化產(chǎn)品協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶 400067；2重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，重慶 400067）

0 引言

橄欖茶是我國南方民間傳統(tǒng)茶的精品，又被稱為“元寶茶”。中國從1964年開始引種以來，橄欖的種植面積在不斷增加[1]，且油橄欖作為全世界公認(rèn)的重要經(jīng)濟(jì)作物，其產(chǎn)物橄欖油營養(yǎng)豐富、功效甚多。而橄欖葉，作為油橄欖的一種副產(chǎn)物，其主要成分是橄欖苦苷、黃酮和多酚等抗氧化物，且內(nèi)含豐富的抗真菌、抗細(xì)菌和抗病毒化合物，具有廣譜抗菌、增強(qiáng)免疫力、改善心腦血管疾病等多重功效[2]。在地中海沿岸各國，油橄欖葉不僅作為傳統(tǒng)草藥用于多種疾病治療，還作為普通食品日常食用[3]。因此對橄欖葉的研究利用成為開發(fā)的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。油橄欖品種繁多，但目前對不同品種油橄欖葉中營養(yǎng)成分及品質(zhì)探究的報道較少。本研究應(yīng)用灰關(guān)聯(lián)度分析法，通過測定不同品種橄欖茶的各種理化指標(biāo)，對橄欖葉營養(yǎng)成分及其品質(zhì)進(jìn)行分析評價，判斷橄欖茶品質(zhì)的優(yōu)劣，為橄欖茶的開發(fā)與應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗材料：配多靈、豆果、鄂植8 號3 個品種的橄欖茶葉（重慶市永輝超市提供）。

試驗藥劑：硫酸、氫氧化鈉、甲醇、沒食子酸、福林酚、碳酸（均為國產(chǎn)分析純），超純水（電阻為18.25Ω）。

試驗儀器：H2000電磁爐（紅寶電器制造有限公司）；電動茶葉揉捻機(jī)OL190B-4；DHG-9202.2SA型電熱恒溫干燥箱（上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司）；分析天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；SHB-III 循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；渦旋儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；恒溫水浴鍋（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；UV-2550型紫外分光光度計（島津）；DK-98-Ⅱ電子調(diào)溫萬用電爐（天津市泰斯特儀器有限公司）；馬弗爐（重慶新特電爐設(shè)備廠）；Agilent1260高效液相色譜儀。

1.2 方法與測定

1.2.1 茶葉原料預(yù)處理

將3 種橄欖茶配多靈（殺青時間80s、殺青溫度90℃、烘干溫度55℃）、豆果（殺青時間60s、殺青溫度95℃、烘干溫度55℃）、鄂植8號（殺青時間80s、殺青溫度95℃、烘干溫度57℃）打碎備用。

1.2.2 茶葉粗纖維的測定

粗纖維的測定根據(jù)黃惠華等[4]方法改進(jìn)測定：用500mL 燒杯稱取茶樣1.00g，加入1.25%硫酸溶液200mL，電爐上小火微沸30min（期間保證溶液濃度不變），趁熱抽濾，用沸蒸餾水沖洗數(shù)次至中性后加入1.25%的氫氧化鈉溶液200mL，同法微沸30min，趁熱減壓抽濾，再用丙酮洗滌3次，至茶渣變白。將茶渣移入烘干至恒重的坩堝中，置于馬弗爐內(nèi)500℃炭化5h，降溫后置于干燥箱內(nèi)冷卻至室溫，稱重。每種茶葉重復(fù)三次。

1.2.3 茶葉灰分的測定

茶葉中灰分含量的檢測根據(jù)GB 5009.4-2016[5]改進(jìn)執(zhí)行。用干燥至恒重坩堝稱取茶樣2.000g，在小火上加熱熔爐，樣品燒焦至無煙，再放置在馬弗爐中于550℃±25℃下燃燒4h。當(dāng)溫度降至約200℃取出并置于干燥箱中冷卻30min 后稱量，再次置于馬弗爐內(nèi)以550℃±25℃灼燒2h，溫度降至約200℃后取出，放于干燥箱內(nèi)冷卻30min后稱量，再次放置在馬弗爐中，在550℃±25℃下燃燒1h，溫度降至約200℃取出，于干燥箱中冷卻30min 后稱量，直至兩次稱量結(jié)果相差不超過0.5mg為止。每種茶葉重復(fù)三次。

1.2.4 茶多酚、氨基酸、總黃酮、咖啡堿的測定

茶多酚：參照國標(biāo)GB/T 8313-2018[6]制備供試液，于紫外可見-分光光度計765nm波長下用10mm比色皿測定試液吸光度。分別吸取10μg·mL-1、20μg·mL-1、30μg·mL-1、40μg·mL-1、50μg·mL-1的各濃度沒食子酸工作溶液，以沒食子酸工作溶液的濃度為橫坐標(biāo)（X），相應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

游離氨基酸：參照國標(biāo)GB/T 8314-2002[7]制備供試液，于紫外可見-分光光度計570nm 波長下用5mm 比色杯測定試液吸光度。稱取50mg 茶氨酸，加水溶解，定容于25mL 容量瓶，濃度為2mg·mL-1，作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液。依次吸取0.0mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10mL容量瓶中，以茶氨酸濃度為橫坐標(biāo)（即標(biāo)準(zhǔn)工作液1mL分別含有 0.000mg、0.200mg、0.300mg、0.400mg、0.500mg、0.600mg 茶氨酸）（X），對應(yīng)吸光度為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計算茶葉中游離氨基酸的總量。

總黃酮：參照SN/T 4592-2016[8]制備試樣，于紫外可見-分光光度計570nm 波長下用1cm 比色杯測定試料溶液吸光度。以50mL 中蘆丁的質(zhì)量（1.000mg、2.000mg、3.000mg、4.000mg、5.000mg）為橫坐標(biāo)（X），對應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸，求得回歸方程。

咖啡因：參照國標(biāo)GB 5009.139-2014[9]制備試液，將不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液分別注入液相色譜儀中，在進(jìn)樣量 10μL，流速 1.0mL·min-1，檢測波長272nm，流動相V（水）：V（甲醇）=76：24 條件下測定。以標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測茶葉中咖啡因的濃度，平行測定次數(shù)不少于兩次。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶葉粗纖維及灰分含量分析

表1 三種茶葉粗纖維及灰分含量Table 1 Three kinds of tea crude fiber and ash content

如表1 所列可知，三種橄欖茶的粗纖維含量表現(xiàn)為：鄂植8 號＞配多靈＞豆果，均達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)，由于茶葉的品質(zhì)與粗纖維含量呈負(fù)相關(guān)，因此三種橄欖茶的品質(zhì)好壞依次為：豆果＞配多靈＞鄂植8號。但實際檢測中觀察到鄂植8號粗纖維含量偏高的原因可能是其葉子葉齡較長比其他兩個品種稍老；原料中鄂植8 號的葉片相比其他兩個品種大且粗糙；在茶葉制作工藝中揉捻鄂植8號不易成型；亦或是在檢驗過程中抽濾時不慎將部分濾紙纖維移入坩堝。

數(shù)據(jù)表明，配多靈、豆果、鄂植8 號的灰分含量均在4.0%～7.5%之間。茶葉灰分不僅是檢驗茶葉品質(zhì)的重要指標(biāo)也對檢驗衛(wèi)生具有重要意義[10]，由此說明三種橄欖茶的茶葉質(zhì)量達(dá)標(biāo)。其中豆果的灰分最小，鄂植8號的灰分最大，其原因可能是鄂植8 號的葉齡較長，積累了較多的礦物質(zhì)元素導(dǎo)致其茶葉較老，當(dāng)然衛(wèi)生條件也會在一定程度上影響灰分的含量。

2.2 線性考察及含量分析

如表2 所列可知：總黃酮、茶多酚、游離氨基酸總量、及咖啡堿含量線性關(guān)系良好。

2.2.1 茶葉中茶多酚和黃酮含量分析

油橄欖葉中黃酮類和多酚類成分是其抗氧化的有效部位[11]。從表3 所列可知，三種橄欖茶的各指標(biāo)成分含量均存在一定差異。其中，配多靈和豆果的茶多酚含量相差不大，均在11%左右，但鄂植8號其含量差異較大且最少。茶多酚的檢測方法較多，比如溶劑提取法、超聲波提取法、超臨界流體萃取法、酶法等，實驗方法不同對設(shè)備及實驗環(huán)境要求也不同。本實驗采用GB/T8313-2018 的測定方法，即福林酚氧化法，用70%的甲醛在70℃中提取10min，時間短，溫度低，有利于茶多酚的穩(wěn)定以減少茶多酚的損耗且重復(fù)性高，顏色深，吸光度大。王麗麗[12]等人研究表明：綠茶中茶多酚含量占茶葉干物質(zhì)的15%～30%。表中數(shù)據(jù)顯示三種橄欖茶中茶多酚的含量均少于15%，初步推測這是由于實驗方法的不同，導(dǎo)致茶多酚的含量有所下降[13-15]，當(dāng)然不排除茶葉本身茶多酚含量較低的情況。根據(jù)文獻(xiàn)[13-15]記載，使用國標(biāo)方法測定茶葉中的茶多酚含量在15%以下，因此三種茶葉的茶多酚含量屬于正常值，可進(jìn)一步開發(fā)和利用。

表3 油橄欖茶中指標(biāo)成分含量Table 3 The contents of assessment markers

由表3 所列可知，配多靈、豆果、鄂植8 號的黃酮總量分別為0.94%、1.1%和0.88%，三種橄欖茶的黃酮含量較低且相差不大。茶葉中黃酮類物質(zhì)的含量影響因素有很多，如加工工藝、貯藏條件、茶樹品種、生長季節(jié)等[16，17]。

2.2.2 茶葉中游離氨基酸和咖啡堿含量分析

郭桂義[18]等人研究表明氨基酸含量的高低與綠茶品質(zhì)成正相關(guān)，氨基酸的含量越高，茶葉越嫩，品質(zhì)越好。結(jié)果表明，三種油橄欖茶葉的游離氨基酸總量均偏低，配多靈、豆果、鄂植8 號的游離氨基酸含量分別為2.3%、2.3%和2.4%。由此發(fā)現(xiàn)本次試驗的三種茶葉品質(zhì)有所欠缺，可能是部分氨基酸流失所致。

咖啡因是茶葉中的一種生物堿，具有很高的醫(yī)用價值，有刺激心臟，興奮中樞神經(jīng)[19，20]、利尿的作用，而判斷茶葉的優(yōu)劣主要是看咖啡因的含量多少[21]。經(jīng)檢測三種茶葉均未檢出咖啡堿，可能與咖啡堿的穩(wěn)定性有關(guān)[22]，因為咖啡堿會隨著茶葉品種不同、采摘方式及加工條件不同而有所變化。

2.3 最優(yōu)品種的篩選

對三種油橄欖茶葉的理化指標(biāo)進(jìn)行灰關(guān)聯(lián)度分析，選取三個品種中每項指標(biāo)最高值作為基準(zhǔn)點(diǎn)，組成參考數(shù)列，由此計算灰關(guān)聯(lián)系數(shù)、灰關(guān)聯(lián)度，比較其值大小，值愈大，關(guān)聯(lián)度越高。將y1～y5進(jìn)行無量綱化，化成介于0～1 之間的數(shù)據(jù)最佳，處理結(jié)果如表4所列。

根據(jù)無量綱化結(jié)果，依次計算yi（i＝1、2、3）與y0的絕對差值以及極差等；△oi(k)= |y0(k)-yi(k)|（K=1、2、3、4、5），絕對差值具體結(jié)果如表5所列；兩極極差為：△oi(k)min=0,△oi(k)max=0.2746。

表4 無綱量化處理結(jié)果Table 4 The results of dimensionless quantity method

表5 絕對差值結(jié)果Table 5 The results of absolute difference

表6 灰關(guān)聯(lián)系數(shù)及灰關(guān)聯(lián)度Table 6 Gray relational coefficient and relational grade

最后計算灰關(guān)聯(lián)系數(shù)和灰關(guān)聯(lián)度：ζi(k)=△oi(k)min+ζ△oi(k)max/△oi(k)+ζ△oi(k)max =0+0.5×0.2746/△oi(k)+0.5×0.2746，其中ζ 是分辨系數(shù)，一般取0.5?；谊P(guān)聯(lián)度的一般表達(dá)式為：計算結(jié)果如表6所列。

如表6 所列可知，三個品種茶葉的灰關(guān)聯(lián)度大小依次為：鄂植8 號＞豆果＞配多靈，由此得出結(jié)論，三個茶葉品種中，鄂植8 號（0.7748）的品質(zhì)最佳，豆果（0.7304）次之，配多靈（0.6486）最次。但由于試驗批次以及樣品的用量較少，不能準(zhǔn)確系統(tǒng)地反映茶葉的質(zhì)量，需要進(jìn)一步深入研究。

3 結(jié)論

利用多種現(xiàn)代科學(xué)檢測技術(shù)，對3 種不同品種油橄欖葉中的粗纖維、灰分、茶多酚、游離氨基酸總量、總黃酮以及咖啡堿含量進(jìn)行理化分析，獲知橄欖茶的一些共同理化特征：橄欖茶中含較多的茶多酚、粗纖維以及較少的水分、游離氨基酸、相對較低的黃酮，形成了橄欖茶鮮醇、嫩香的獨(dú)特風(fēng)味。結(jié)合灰關(guān)聯(lián)分析法對其進(jìn)行質(zhì)量評價，得出3 個品種中鄂植8號的質(zhì)量最優(yōu)，豆果其次，配多靈最次。本研究結(jié)果可指導(dǎo)相關(guān)從業(yè)人員根據(jù)不同品種油橄欖葉營養(yǎng)及活性成分特點(diǎn)擇優(yōu)育種與應(yīng)用。