左曉佳， 馮盡意， 葉麗霖， 邢 苗， 鄧之奎， 劉定勝，

(1. 貴州醫(yī)科大學(xué)，貴陽 550004; 2. 上海健康醫(yī)學(xué)院附屬周浦醫(yī)院腫瘤血液科，上海 201318; 3. 江蘇省淮安市第一人民醫(yī)院血液科，江蘇 淮安 223000)

近年來，越來越多的證據(jù)表明多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)的緩解深度與患者的無進(jìn)展生存(progression free survival, PFS)及總生存(overall survival, OS)有著密切關(guān)系[1-3]。微小殘留病(minimal residual disease, MRD)作為判斷MM緩解深度的重要標(biāo)志也受到更多的關(guān)注[4-9]。多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)(multiparameter flow cytometry，MFC)具有檢測敏感性高、方便快捷、費(fèi)用適中等優(yōu)勢，現(xiàn)已成為MM臨床應(yīng)用最廣泛的MRD檢測手段[5,8,10]。本課題組先前的研究表明[11]，經(jīng)CD38、CD138和CD45設(shè)門，對CD19、CD20、CD28、CD45、CD56和CD117的進(jìn)行檢測可有效判別MM的MRD。后續(xù)的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)[12]，CD44、CD49d和CD184在MM細(xì)胞中高表達(dá)，流式細(xì)胞儀檢測的敏感性高，但它們是否具有MM特異性免疫標(biāo)志的特征以及是否可進(jìn)一步幫助判別MM的MRD目前還不清楚。本研究利用MFC檢測以上免疫標(biāo)志組合，以了解這些新的免疫標(biāo)志組合在MM的MRD檢測中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

以2012年4月—2020年4月江蘇省淮安市第一人民醫(yī)院和上海健康醫(yī)學(xué)院附屬周浦醫(yī)院收治的44例治療后的MM患者為研究組，經(jīng)過化療、蛋白酶體抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑、單克隆抗體或自體造血干細(xì)胞移植至少一種治療，存在MRD且有足夠的漿細(xì)胞可用于流式細(xì)胞儀分析。每例患者均進(jìn)行骨髓涂片檢查，經(jīng)形態(tài)學(xué)確定其漿細(xì)胞小于5%。所有患者都通過免疫固定電泳檢測單克隆免疫球蛋白(M蛋白)和輕鏈，其中33例為陽性。以43例江蘇省淮安市第一人民醫(yī)院和上海健康醫(yī)學(xué)院附屬周浦醫(yī)院收治的非漿細(xì)胞腫瘤的造血系統(tǒng)惡性腫瘤為對照組，進(jìn)一步分為兩個(gè)亞組，對照A組為12例未經(jīng)治療的非漿細(xì)胞腫瘤患者，包括2例新診斷的霍奇金淋巴瘤和10例非霍奇金淋巴瘤。對照B組31例為經(jīng)化療、靶向治療或去甲基化治療等各種抗腫瘤治療達(dá)完全緩解的非漿細(xì)胞腫瘤患者，其中非霍奇金淋巴瘤8例、骨髓增生異常綜合癥8例、急性髓系白血病7例、急性淋巴細(xì)胞白血病3例、慢性粒細(xì)胞白血病3例、Ph染色體陰性的骨髓增殖性腫瘤1例和霍奇金淋巴瘤1例?；颊呦嚓P(guān)信息以及骨髓涂片中漿細(xì)胞計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)見表1。研究獲得所有MM患者和對照者的知情同意。

1.2 試劑與儀器

Navios流式細(xì)胞儀購自美國Beckman Coulter公司；主要試劑： CD19-PC5、CD19-FITC、CD20-PC5、CD45-KO、CD56-A700、CD117-A750、CD38-PC7、CD138-PB、κ輕鏈-FITC和λ輕鏈-PE購自Beckman Coulter公司；CD28-APC、CD44-APC和CD49d-APC購自美國BD公司；CD184-PC7購自美國Invitrogen公司。

1.3 方法

研究組和對照組患者的骨髓標(biāo)本予EDTA抗凝，24h內(nèi)用10色流式細(xì)胞儀檢測。標(biāo)本在4℃與單克隆抗體孵育15min，在室溫下按標(biāo)準(zhǔn)程序裂解成熟紅細(xì)胞后流式細(xì)胞儀檢測。在檢測胞質(zhì)抗原時(shí)，按程序予破膜處理。每份標(biāo)本分2管檢測，使用的抗體組合如下。第1管： cytoKappa-FITC、cyto-Lambda-PE、CD38-AC7、CD138-PB、CD19-PC5、CD56-A700、CD28-ECD、CD44-APC、CD45-KO；第2管： CD38-AC7、CD138-PB、CD19-FITC、CD20-PC5、CD184-PC7、CD117-A750、CD49d-APC、CD56-A700、CD45-KO。每份標(biāo)本至少分析50萬個(gè)細(xì)胞，一些標(biāo)本漿細(xì)胞較少，分析的細(xì)胞數(shù)達(dá)100萬個(gè)，并且至少獲得100個(gè)以上漿細(xì)胞用于分析。獲得數(shù)據(jù)應(yīng)用Kaluza2.0軟件進(jìn)行分析： 通過FSC/SSC點(diǎn)圖，設(shè)定有核細(xì)胞R1(圖1A)，漿細(xì)胞R2通過CD38/CD138高表達(dá)進(jìn)行識(shí)別(圖1B)，通過FS-INT/SS-INT設(shè)門以排除非特異性結(jié)合，進(jìn)一步純化漿細(xì)胞R3(圖1C)，進(jìn)而分析R3門內(nèi)細(xì)胞。幼紅細(xì)胞可以通過CD45/SSC識(shí)別，并且不表達(dá)CD38/CD138，據(jù)此可作為陰性內(nèi)參照。通過胞質(zhì)輕鏈κ/λ的限制性的方法保證了漿細(xì)胞的克隆性，可以更準(zhǔn)確的限定MM的MRD細(xì)胞。對κ/λ輕鏈表達(dá)的分析在分析全部漿細(xì)胞和CD45dim/-漿細(xì)胞基礎(chǔ)上進(jìn)行，同時(shí)分析CD20陽性、CD45強(qiáng)陽性的淋巴細(xì)胞以確定成熟B淋巴細(xì)胞的克隆性，將B細(xì)胞淋巴瘤或白血病標(biāo)本中伴有單克隆漿細(xì)胞的標(biāo)本予以去除，見圖1。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)的免疫標(biāo)志分析Fig.1 Flow cytometry analysisA～C： 確定R1、R2和R3細(xì)胞；D～F： 分析R3門內(nèi)細(xì)胞；G～I(xiàn)： 1例MM患者的CD19/CD44、CD56/CD20、CD19/CD117散點(diǎn)圖；J～L： CD19/CD184、CD28/CD56和CD49d/CD45散點(diǎn)圖

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用Fisher’s Exact Test分析分類變量的比較；組間比較應(yīng)用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MM的MRD細(xì)胞與非MM漿細(xì)胞的比較

MFC檢測顯示，研究組CD45、CD28、CD117、CD20、CD44和CD184表達(dá)具有較大異質(zhì)性，CD19、CD56和CD49d表達(dá)均一性較好，其中CD19低表達(dá)，而CD56和CD49d高表達(dá)；對照組CD45、CD19、CD44和CD184表達(dá)具有較大異質(zhì)性，CD56、CD28、CD117、CD20和CD49d表達(dá)均一性較好，其中CD56、CD28、CD117和CD20低表達(dá)，而CD49d高表達(dá)，見圖2。與對照組相比，研究組CD45、CD19、CD56、CD28、CD117、CD20和CD44表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。雖然CD49d在研究組中高表達(dá)，但在對照組中也高表達(dá)，而且在研究組和對照組中表達(dá)的均一性良好，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.710)。同樣，CD184也有較高的表達(dá)，雖然與CD49d相比，CD184在研究組和對照組中的表達(dá)有一定異質(zhì)性，但研究組和對照組在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.287)，見表1。

2.2 非MM漿細(xì)胞之間的比較

兩組的漿細(xì)胞大多都表達(dá)CD45、CD19、CD44、CD49d和CD184，除了CD49d均一性高以外，其他的免疫標(biāo)志表達(dá)均具有一定異質(zhì)性。與此相反，CD56、CD28、CD117和CD20在多數(shù)漿細(xì)胞中不表達(dá)，而且均一性較高。總體來說，在非MM漿細(xì)胞中，未經(jīng)治療與經(jīng)抗腫瘤治療后漿細(xì)胞以上免疫標(biāo)志比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。多數(shù)漿細(xì)胞中不表達(dá)CD28，但經(jīng)抗腫瘤治療后，CD28表達(dá)有升高(0～27%，中位數(shù)5%)，且對照A組與對照B組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.041)，見表1。

2.3 設(shè)定界值后MM的MRD細(xì)胞與非MM漿細(xì)胞比較

為了獲得更好MM的MRD細(xì)胞與非MM漿細(xì)胞比較的敏感性和特異性，本研究通過ROC曲線設(shè)置了每種免疫標(biāo)志的界值。CD45、CD19、CD56、CD44和CD28的最佳界值分別為42%、48%、26%、56%和42%，為了便于臨床應(yīng)用，分別被調(diào)整為≤40%、≤50%、≥25%、≤55%和≥40%。CD20和CD117的最佳界值分別是8%和4%，在這種情況下為了避免高估陽性率，本研究采用了傳統(tǒng)的20%作為界值。研究組與對照組的CD49d與CD184表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對于鑒別MM的MRD細(xì)胞與非MM漿細(xì)胞無特殊價(jià)值，故未設(shè)置界值和進(jìn)一步分析。本研究將超過界值定義為陽性，研究組的漿細(xì)胞在CD45、CD19、CD56、CD44、CD28、CD20和CD117中均與對照組的漿細(xì)胞差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MM的MRD細(xì)胞中位異常免疫標(biāo)志數(shù)為4(2～6)個(gè)，而非MM漿細(xì)胞為0(0～2)個(gè)，見表1。

表1 多發(fā)性骨髓瘤微小殘留病細(xì)胞與非多發(fā)性骨髓瘤漿細(xì)胞的比較

續(xù)表

圖2 多發(fā)性骨髓瘤微小殘留病細(xì)胞與非多發(fā)性 骨髓瘤漿細(xì)胞免疫標(biāo)志表達(dá)情況的比較Fig.2 Immunophenotypic comparisons between MRD of MM patients and plasma cells of non-MM patients

3 討 論

MM治療后MRD的檢測有賴于在非MM漿細(xì)胞背景下對MM漿細(xì)胞的鑒別，而此時(shí)患者骨髓標(biāo)本中，非MM漿細(xì)胞可能占了漿細(xì)胞總數(shù)的99%[13]。因此，MM的MRD細(xì)胞與非MM漿細(xì)胞的鑒別需要高敏感性和特異性的檢測方法。當(dāng)前，MFC是臨床上公認(rèn)的應(yīng)用最廣泛的定量檢測MM的MRD的方法。但在實(shí)際應(yīng)用過程中，也發(fā)現(xiàn)了一些問題，如由于非MM漿細(xì)胞與MM細(xì)胞的異質(zhì)性，導(dǎo)致兩者的免疫標(biāo)志有部分重疊，影響檢測的特異性[14-15]；免疫標(biāo)志物的選擇未能完全統(tǒng)一[8，16]；其標(biāo)準(zhǔn)化問題也較為突出等[6,9]。還有研究表明，MM治療后患者免疫標(biāo)志的表達(dá)發(fā)生變化，而且這些變化使得流式細(xì)胞儀檢測MRD更趨復(fù)雜化[17-20]。因此，尋找新的MM免疫標(biāo)志組合仍是檢測MRD的重要挑戰(zhàn)。

本研究使用10色流式細(xì)胞儀，相對于傳統(tǒng)的4色、6色的流式細(xì)胞儀，能更方便地在同一群漿細(xì)胞中分析更多的免疫標(biāo)志。例如，當(dāng)確認(rèn)有一部分患者的非MM漿細(xì)胞亞群表達(dá)CD56時(shí)，就發(fā)現(xiàn)了CD19+CD56+亞群和CD19-CD56+亞群漿細(xì)胞；通過在全部漿細(xì)胞和CD45dim/-漿細(xì)胞基礎(chǔ)上設(shè)門的方法檢測多發(fā)性骨髓瘤患者κ/λ的克隆性表達(dá)。10色流式細(xì)胞儀技術(shù)可以允許同時(shí)檢測細(xì)胞膜表面免疫標(biāo)志和細(xì)胞漿輕鏈，這種方法增加了克隆性分析的敏感性和微小殘留病檢測的可信度。

本研究發(fā)現(xiàn)，在MM的MRD細(xì)胞中CD44的表達(dá)具有顯著的異質(zhì)性，多數(shù)細(xì)胞為低表達(dá)(0～100%，中位數(shù)20%)，而對照組的CD44為高表達(dá)(43%～100%，中位數(shù)88%)，兩類細(xì)胞的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.007)，尤其是經(jīng)過ROC曲線確定界值后，定義≤55%為異常，可以將MM的MRD細(xì)胞與非MM漿細(xì)胞有效區(qū)分(P=0.001)。以上的檢測和分析提示CD44可作為多發(fā)性骨髓瘤特異性免疫標(biāo)志之一。

研究[12]發(fā)現(xiàn)，CD49d和CD184在MM細(xì)胞中高表達(dá)，而且表達(dá)的均一性好于CD44，同時(shí)在理論上推測有可能成為MM細(xì)胞新的特異性免疫標(biāo)志物。本研究顯示，雖然在研究組中CD49d和CD184仍然高表達(dá)，CD49d均一性良好，CD184顯示一定的異質(zhì)性，但在對照組中CD49d和CD184也同樣高表達(dá)，且差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示CD49d和CD184并不能用于鑒別MM細(xì)胞和非MM漿細(xì)胞。以上結(jié)果說明，CD49d和CD184廣泛存在于漿細(xì)胞中,在MM細(xì)胞的檢測中，雖然有良好的敏感性，但缺乏特異性，不能作為合適的免疫標(biāo)志物。

本研究證實(shí)了CD44可作為鑒別MM的MRD細(xì)胞與非MM漿細(xì)胞的新的免疫標(biāo)志，因此，將CD44與先前已確定的CD20、CD28、CD56、CD117、CD19和CD45組合在一起，應(yīng)用ROC曲線確定各自的界值后，確定每例MM患者腫瘤性漿細(xì)胞異常表達(dá)的免疫標(biāo)志的個(gè)數(shù)。研究組有4個(gè)異常表達(dá)(范圍2～6)，而對照組為0個(gè)異常表達(dá)(范圍0～2)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。為了比較先前6個(gè)免疫標(biāo)志物組合與本研究確定的7個(gè)免疫標(biāo)志物組合的檢測效率，研究組為100%具有MM微小殘留病，對照組為100%沒有MM微小殘留病，以2個(gè)標(biāo)記物異常定義為判斷微小殘留病的標(biāo)準(zhǔn)，比較兩組免疫標(biāo)志物組合檢測MRD的敏感性和特異性。結(jié)果顯示： 原免疫標(biāo)志組合靈敏度為93.22%，特異度為92%，新免疫標(biāo)志組合靈敏度為100%，特異度為90.69%。本研究不但再次證實(shí)了課題組先前的工作[11]，即CD20、CD28、CD56、CD117、CD19和CD45等6個(gè)免疫標(biāo)志可有效檢測MM的MRD，而且發(fā)現(xiàn)包括CD44的新的免疫標(biāo)志組合進(jìn)一步提高了MM的MRD的檢測效率。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，先前的工作應(yīng)用ROC曲線確定的界值[11]與本研究應(yīng)用ROC曲線確定的界值基本在相近的范圍，而經(jīng)過適當(dāng)調(diào)整后基本吻合。因此，在今后的工作中可以將CD45、CD19、CD56、CD28、CD117、CD20和CD44的最佳界值定義為≤40%、≤50%、≥25%、≥40%、≥20%、≥20%和≤55%，超過界值可判定為異常。

本研究還發(fā)現(xiàn)與先前研究不完全一致的兩種情況。(1) CD44在2次研究中的表達(dá)不一致。本研究中，以55%為界值，MM的MRD細(xì)胞CD44的表達(dá)多數(shù)低于此界值，非MM漿細(xì)胞絕大多數(shù)病例高于此界值；而在先前的研究中[12]，CD44在MM的細(xì)胞中多數(shù)為高表達(dá)，中位數(shù)76.9%，如果同樣以55%為界值，多數(shù)病例高于此界值。對于2次研究的不同結(jié)果，可能是前后2次研究中MM患者的疾病狀態(tài)的差異造成的。有研究[12,21]認(rèn)為，MM疾病進(jìn)展和耐藥時(shí)CD44高表達(dá)。先前工作[12]認(rèn)為，MM患者疾病狀態(tài)是多樣的，包括初診、維持和難治復(fù)發(fā)的患者，這部分患者中有疾病進(jìn)展或耐藥的患者，因此總體CD44表達(dá)的升高，而本研究中研究組的患者幾乎沒有疾病進(jìn)展和耐藥患者，所以CD44總體表達(dá)比較低。(2) CD28在2次研究中的表達(dá)不完全一致。本研究中，研究組與對照組CD28的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.032)，而且對照A組與對照B組相比差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.041)；先前的研究[11]顯示，對照A組與對照B組的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.01)，提示CD28在經(jīng)過抗腫瘤治療后，表達(dá)可能上調(diào)，但研究組與對照組的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.396)?？赡艿脑蚴潜敬窝芯坎±龜?shù)相對較少，增加病例數(shù)有可能得到一致的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

綜上，本研究的結(jié)果表明： (1) MM的MRD細(xì)胞中CD44為低表達(dá)，而非MM漿細(xì)胞高表達(dá)，兩類細(xì)胞的表達(dá)有顯著性差異，CD44可作為多發(fā)性骨髓瘤特異性免疫標(biāo)志之一；(2) CD49d和CD184廣泛存在于漿細(xì)胞中，但缺乏特異性，不能作為多發(fā)性骨髓瘤特異性免疫標(biāo)志；(3) 利用CD45、CD19、CD56、CD28、CD117、CD20和CD44新的免疫標(biāo)志組合將提高M(jìn)M的MRD的檢測效率。雖然仍然可能存在一定的免疫標(biāo)志的重疊現(xiàn)象，但是應(yīng)用以上新的免疫標(biāo)志組合，MFC能有效地檢測出MM的MRD細(xì)胞。