一種適用于微生物學(xué)實驗教學(xué)的改良細菌革蘭染色法

王繼璇

摘要微生物學(xué)實驗教學(xué)常規(guī)細菌革蘭染色實驗中，常因細菌培養(yǎng)物被反復(fù)使用而導(dǎo)致染色結(jié)果出現(xiàn)錯誤。為了提高革蘭染色實驗教學(xué)效果，我們建立了基于10%福爾馬林固定菌液的改良革蘭染色法。該法染色結(jié)果顯示，4°C或室溫放置5或30 d的福爾馬林固定金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌菌液不僅具有100%染色正確率，同時還有菌體染色均勻、輪廓清晰、形態(tài)典型等優(yōu)點，不僅提高了革蘭染色實驗教學(xué)效果，同時也明顯減少了實驗準(zhǔn)備工作量及細菌培養(yǎng)基使用量，較好的改進了革蘭染色實驗教學(xué)中存在的問題。

關(guān)鍵詞 微生物實驗教學(xué) 改良革蘭染色法 福爾馬林 細菌固定

中圖分類號：Q246文獻標(biāo)識碼：ADOI：10.16400/j.cnki.kjdk.2021.20.018

A Modified Bacterial Gram-staining Method Suitable for Microbiologic Experimental Teaching

WANG Jixuan

（Zhejiang University， School of Medicine， Hangzhou， Zhejiang 310006）

AbstractIn the routine bacterial Gram-staining assay of microbiologic experimental teaching， the wrong staining results frequently occur due to the repeated use of bacterial cultures. In order to improve the teaching effect of bacterial Gramstaining assay， we established a modified Gram-staining method using 10% formalin-fixing bacterial suspensions. The stainingresultsoftheformalin-fixedsuspensionsstandingat4°Corroomtemperaturefor5or30dofStaphylococcusaureus， Bacillus subtilis and Escherichia coli using this modified method not only showed 100% correct rate， but also had the advantagessuchasuniformstaining，edgesharpnessandtypicalshapeofbacterialbodies，whichimprovedtheteachingeffect of Gram-stainingassay as well as decrease the work load of experimental preparation and usage of bacterial medium.

KeywordsMicrobiologic experimental teaching； modified Gram-staining method； Formalin； bacterial fixation

革蘭染色法是高等院校微生物學(xué)實驗中最為常用的細菌染色法，不僅可以輔助清晰地觀察細菌的形態(tài)，同時也能反映不同細菌細胞壁之間的差異并對臨床上抗生素的選擇具有參考價值。因此，醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、環(huán)境微生物學(xué)實驗教學(xué)中均將細菌革蘭染色法作為本科實驗教學(xué)的基本內(nèi)容之一。然而，現(xiàn)行的革蘭染色法染色效果受到較多因素的干擾，包括細菌菌齡、細菌涂片厚度、乙醇脫色時間等的影響，導(dǎo)致最終染色出現(xiàn)假陰性、假陽性的結(jié)果，影響實驗教學(xué)效果。其中在各種影響染色效果的因素中，菌齡對染色結(jié)果影響最大，對數(shù)生長期的細菌染色結(jié)果正確性較高，幼齡或老齡菌染色后易出現(xiàn)假陰性或假陽性染色結(jié)果。[1]我國現(xiàn)行的實驗教學(xué)體系中，通常實驗班級較多，故對數(shù)生長期細菌往往保存于4°C冰箱貯存?zhèn)溆?。但有文獻報道，細菌在4°C時仍可緩慢生長，故對數(shù)生長期細菌長時間4°C保存并反復(fù)使用后，已非處于對數(shù)生長期，從而影響革蘭染色結(jié)果的正確性。[2，3]

我們在長期的醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實驗教學(xué)中發(fā)現(xiàn)，預(yù)先采用福爾馬林溶液固定待染色的細菌，可有效地消除菌齡對革蘭染色結(jié)果的影響，取得了良好的實驗效果。接下來筆者就改良后的革蘭染色法進行詳細的介紹，以期對同類實驗教學(xué)的開展起到一定的借鑒作用。

1實驗步驟與方法

菌種選擇及細菌培養(yǎng)：選擇金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌分別作為革蘭陽性球菌和桿菌、革蘭陰性桿菌代表。用火焰滅菌接種環(huán)挑取上述菌種接種于瓊脂平板或普通肉湯，37°C培養(yǎng)18 h，其中液體培養(yǎng)物定量OD600=1.0。

菌液制備及福爾馬林固定：上述用生理鹽水洗下的菌苔或細菌培養(yǎng)液2000r/min離心10min，取細菌沉淀懸于適量生理鹽水中，2000r/min離心10min，如此重復(fù)2-3次。部分離心獲得的細菌沉淀中加入適量10%福爾馬林溶液，混勻后室溫固定15min；將未用福爾馬林固定或福爾馬林固定的菌液在4°C或室溫下放置5或30 d，然后進行革蘭染色。

改良革蘭染色法：將適量福爾馬林固定菌液滴加于潔凈載玻片上，用接種環(huán)涂布成直徑約10mm薄而均勻的菌膜，常規(guī)火焰固定；滴加結(jié)晶紫染液覆蓋菌膜，室溫染色1 min，細小水流沖洗數(shù)秒后甩干；滴加盧戈氏碘液覆蓋菌膜，室溫染色1 min，小水流沖洗數(shù)秒后甩干；滴加95%酒精覆蓋菌膜，輕輕旋轉(zhuǎn)或晃動玻片，室溫脫色0.5min，小水流沖洗數(shù)秒后甩干；滴加石碳酸復(fù)紅染色液覆蓋菌膜，室溫染色1 min，小水流沖洗數(shù)秒后甩干，用吸水紙吸盡玻片上水份后用油鏡觀察。[4]

常規(guī)革蘭染色法：采用常規(guī)革蘭染色法染色對數(shù)生長期待染色菌種。[4]

細菌染色性判定：每種細菌與培養(yǎng)條件下均選取樣本數(shù)20，嚴格控制革蘭染色過程一致，染色結(jié)束后每張樣本撥片隨機選取3-5個單層細菌染色區(qū)進行顯微鏡下觀察，藍紫色為革蘭陽性、紅色為革蘭陰性。根據(jù)鏡下染色結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果比對結(jié)果確定染色結(jié)果的正確率。

2結(jié)果與分析

2.1不同溫度及放置時間對常規(guī)革蘭染色結(jié)果的影響

新鮮培養(yǎng)（37°C培養(yǎng)18 h）后行常規(guī)革蘭染色的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌染色結(jié)果正確率均為100%；4°C冰箱放置5天后的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌培養(yǎng)物革蘭染色正確率分別為90%、70%和80%，20°C室溫放置5天后金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌革蘭染色正確率分別僅為60%和50%，枯草芽孢桿菌染色結(jié)果均轉(zhuǎn)為陰性，具體見表1。

在顯微鏡下觀察，革蘭染色結(jié)果錯誤的金黃色葡萄球菌部分紫色紅色菌體參半，部分完全假陰性呈紅色；革蘭染色假陰性枯草芽孢桿菌著色變淺、不著色或呈紅色且菌體形態(tài)發(fā)生明顯變化，大部分菌體已出現(xiàn)芽孢；革蘭染色假陽性大腸埃希菌呈紫色且菌體變小，實驗結(jié)果見圖1。

革蘭染色結(jié)果的差異主要依據(jù)不同細菌細胞壁結(jié)構(gòu)的不同，細菌在對數(shù)生長期細胞壁結(jié)構(gòu)最為穩(wěn)定，呈現(xiàn)典型的革蘭染色性。當(dāng)細菌生長進入靜止期或衰亡期以后，隨著衰亡期細菌大量出現(xiàn)，菌體自溶現(xiàn)象的發(fā)生，細菌的菌體形態(tài)與細胞壁結(jié)構(gòu)都發(fā)生了變化，從而出現(xiàn)假性染色結(jié)果。不同溫度（4°C，20°C貯存條件）下，細菌呈現(xiàn)相對緩慢生長，逐步進入靜止期或衰亡期，所以不同溫度對染色結(jié)果的影響也是通過對細菌生長狀態(tài)的影響進而影響染色結(jié)果。

2.2福爾馬林固定顯著增強染色結(jié)果穩(wěn)定性

采用10%福爾馬林固定細菌的改良革蘭染色法時，新鮮、室溫放置5或30d金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌菌液的染色結(jié)果正確率均為100%且呈現(xiàn)典型的菌體形態(tài)，實驗結(jié)果見圖2。

10%福爾馬林固定處理后，細菌菌體內(nèi)蛋白變性導(dǎo)致細胞死亡從而保持固有的菌體形態(tài)與結(jié)構(gòu)，行革蘭染色法鏡檢后，細胞形態(tài)與染色結(jié)果均穩(wěn)定，不受貯存溫度與貯存時間的影響，有效的解決了菌齡干擾染色結(jié)果的問題。

另一方面，10%福爾馬林固定處理后細菌菌液涂片相比于常規(guī)使用的斜面固體菌種涂片，更易于涂片均勻，出現(xiàn)單層分散菌體鏡像，對于初次接觸革蘭染色方法的學(xué)生實驗成功率更高。

3討論

不同細菌的細胞壁結(jié)構(gòu)存在顯著差異，一類細菌細胞壁由細菌胞漿膜和大量肽聚糖組成，另一類為細菌胞漿膜（也稱內(nèi)膜）、少量肽聚糖和外膜組成，這也是前者革蘭染色陽性、后者革蘭染色陰性的原因所在。[5]目前我國大多數(shù)高校微生物學(xué)實驗教學(xué)體系中，存在教學(xué)時間集中、學(xué)生人數(shù)龐大、實驗教師編制有限等特點，細菌革蘭染色實驗中通常無法及時培養(yǎng)和制備新鮮菌液，導(dǎo)致一次培養(yǎng)的細菌需在冰箱放置數(shù)天后使用，而不新鮮的菌液直接影響革蘭染色的結(jié)果，學(xué)生染色結(jié)果出現(xiàn)異?；蝈e誤在我們的日常教學(xué)中時有發(fā)生。我們的實驗結(jié)果顯示，4°C放置5天后分別有10%、30%和20%的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌菌液革蘭染色結(jié)果出現(xiàn)錯誤，室溫放置5天后金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌常規(guī)革蘭染色結(jié)果的錯誤率分別高達40%和50%，枯草芽孢桿菌染色結(jié)果甚至全部轉(zhuǎn)為陰性，同時還出現(xiàn)枯草芽孢桿菌和大腸埃希菌出現(xiàn)不典型的菌體形態(tài)，不僅影響了實驗教學(xué)效果，也易使學(xué)生實驗成績評分出現(xiàn)誤判。因此，探索并建立穩(wěn)定可靠的細菌革蘭染色法在微生物實驗教學(xué)中具有較大實際意義。

福爾馬林是組織病理學(xué)檢查技術(shù)中常規(guī)使用的組織固定劑，可與組織及細胞中蛋白分子的氨基結(jié)合并使其固定化，從而有效地保持了組織及細胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。[6]我們將福爾馬林組織固定的方法借鑒應(yīng)用到了細菌學(xué)中，研究結(jié)果顯示，采用10%福爾馬林固定細菌而制備的菌液，可在4°C或室溫放置30 d內(nèi)保持染色結(jié)果的正確性，同時還有菌體染色均勻、輪廓清晰、形態(tài)典型等優(yōu)點，不僅提高了實驗教學(xué)效果，同時大大減輕了實驗準(zhǔn)備的工作量并減少了培養(yǎng)基的使用量。室溫放置30 d是我們實驗測試的放置時間，更久的室溫放置時間可以進一步的進行驗證。此外，阿培脫染色法染色白喉棒狀桿菌實驗也是病原微生物學(xué)教學(xué)實驗中常用染色方法，白喉棒狀桿菌的異染顆粒常因細菌多次傳代或培養(yǎng)物老化而使異染顆粒不明顯甚至消失，[7]從而影響染色結(jié)果。探索福爾馬林固定的白喉棒狀桿菌阿培脫染色能否顯示穩(wěn)定且典型的異染顆粒，值得我們后續(xù)進一步的研究。

參考文獻

[1]洪慶華，遲杰，齊云，等.影響革蘭氏染色結(jié)果的原因分析[J].實驗技術(shù)與管理，2011，28（5）：41-43.

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[3]周智慧，高波，王升智，等.不同保存方法對重組大腸桿菌菌株活性的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（1）：8-9，15.

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