包悅琳 陳 鴿 王婷婷 張 偉 金東淳*

(1.延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉133000；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 大豆研究所，長(zhǎng)春 130000)

鐵是植物生長(zhǎng)發(fā)育中所必需的微量營(yíng)養(yǎng)元素。雖然土壤中鐵的豐度很高，但其生物有效性非常低，特別是在堿性石灰性土壤中，其高pH和高重碳酸鹽含量嚴(yán)重降低了土壤中鐵的有效性。據(jù)報(bào)道，全世界大約40% 的耕地面積潛在性缺鐵[1-3]。由于缺鐵導(dǎo)致葉綠素生物合成受阻，造成植物缺鐵黃化癥(IDC)，進(jìn)而造成幼嫩葉片黃化、減少葉片面積、莖和根的干重[4]，最終造成作物的產(chǎn)量減少。

植物缺鐵失綠是一個(gè)普遍的植物營(yíng)養(yǎng)失調(diào)問(wèn)題[5]，不同作物對(duì)缺鐵敏感程度存在差異。與水稻和小麥等禾谷類(lèi)作物相比，大豆對(duì)缺鐵反映特別敏感[6-7]，特別是在干旱和半干旱地區(qū)的石灰性土壤中。大豆在苗期對(duì)缺鐵尤為敏感，缺鐵條件下大豆地上部幼葉脈間失綠,葉脈正常,失綠均勻,無(wú)斑,無(wú)畸形,隨著時(shí)間推移,病葉最后干枯；地下部根系發(fā)育較差,生長(zhǎng)不良,根短而細(xì)少,根瘤數(shù)量較少，進(jìn)而導(dǎo)致減產(chǎn)；嚴(yán)重時(shí)植株早期枯萎和死亡[8]。

鐵元素在植物生長(zhǎng)中起著非常重要的作用，是很多抗氧化酶不可或缺的組成部分或輔助因子，如過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物酶(POD)、谷胱甘肽還原酶(GR)和含鐵超氧化物歧化酶(Fe-SOD)[15]。缺鐵或鐵過(guò)量都會(huì)導(dǎo)致植株氧化脅迫，鐵還是固氮酶中鉬蛋白和鐵蛋白的組成部分，是豆科植物固氮所必需的。在高等植物的光合作用中，鐵氧還蛋白是光合電子傳遞鏈上的重要物質(zhì)，也是植物體許多基本代謝過(guò)程中的電子傳遞體，是電子傳遞發(fā)生的重要代謝過(guò)程[9-10]。研究植物鐵吸收機(jī)理在提高植物鐵吸收率和抗低鐵脅迫能力進(jìn)而提高作物產(chǎn)量方面具有重要意義。目前，對(duì)模式作物的鐵吸收生理機(jī)制研究報(bào)道已經(jīng)很多[11-12]，缺鐵對(duì)抗氧化防御體系的影響已經(jīng)得到廣泛關(guān)注[13-14，16]，但是對(duì)于大豆缺鐵脅迫的生理機(jī)制還不明確，特別是在缺鐵條件下大豆抗氧化酶研究，很難反映其普遍性。

石灰性土壤中，噴施葉面肥能改良大豆缺鐵黃化，但成本高。因而從基因型角度，選育鐵高效大豆品種，是解決石灰性土壤中大豆缺鐵的關(guān)鍵措施。目前，針對(duì)不同品種間對(duì)鐵吸收機(jī)理的研究鮮有報(bào)道。本研究以多個(gè)鐵高效與鐵低效大豆品種為試驗(yàn)材料，分析生理指標(biāo)與缺鐵表型之間的關(guān)系，旨在探討不同鐵利用效率大豆品種的抗氧化酶活性的差異，以期為選育抗缺鐵大豆品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)于2019年在延邊大學(xué)溫室內(nèi)進(jìn)行，試驗(yàn)采用盆栽方法，供試材料為已被確定的4個(gè)鐵高效大豆品種(‘吉育99’、‘吉育75’、‘長(zhǎng)農(nóng)15’、‘長(zhǎng)農(nóng)20’)和4個(gè)鐵低效品種(‘吉農(nóng)27’、‘吉育87’、‘吉育92’、‘吉育93’)。分別在塑料桶(頂部直徑為33 cm，底部直徑為23 cm，高度為30 cm的塑料桶)中裝15 kg供試土壤，每盆播種1穴，每穴2粒，3次重復(fù)。盆內(nèi)石灰性土壤施大豆復(fù)合肥，按著干土中施用純氮0.2 g/kg，共施17.6 g/盆，其中含N 2.992 g，P2O52.992 g，K2O 2.992 g。石灰性土壤為缺鐵脅迫，鐵含量為3.34 mg/kg。噴施微量元素葉面肥(噴施硼酸16.1 mmol/L，硫酸錳13.2 mmol/L，硫酸銅0.625 mmol/L，硫酸鋅3.1 mmol/L，鉬酸銨1.02 mmol/L)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

供試大豆在苗期和生殖生長(zhǎng)前期受缺鐵影響較大，測(cè)定時(shí)期為一葉期(V1)、二葉期(V2)、三葉期(V3)、四葉期(V4)、始花期(R1)和盛花期(R2)。取相同部位的新鮮葉片測(cè)定各項(xiàng)目，重復(fù)3次取平均值，在植物生長(zhǎng)期間定時(shí)、定量澆水，常規(guī)栽培管理。取相同部位的新鮮葉片測(cè)定其葉綠素含量(SPAD值)和抗氧化酶活性[17-18]。

1.2.1大豆葉片葉綠素含量測(cè)定

葉綠素含量是用SPAD-502型手持葉綠素儀(日本柯尼卡美能達(dá)公司)測(cè)定相同部位完全展開(kāi)的新鮮葉片的SPAD值，取3次讀數(shù)的平均值供分析。

1.2.2大豆抗氧化酶活性測(cè)定

在大豆不同發(fā)育時(shí)期，分別取0.5 g新鮮葉片測(cè)定抗氧化酶活性。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑法(NBT)[19]；過(guò)氧化物酶(Peroxidase，POD)活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[20]；過(guò)氧化氫酶(Catalase，CAT)活性測(cè)定采用紫外分光光度計(jì)法[21-22]。

1.2.3農(nóng)藝學(xué)性狀測(cè)定

在成熟期，分別隨機(jī)選取3株大豆植株，分析單株莢重、株高、生物量、百粒重和籽粒含鐵量等產(chǎn)量性狀。

1.2.4數(shù)據(jù)分析

用Excel 2007整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鐵效率大豆品種主要農(nóng)藝性狀及籽粒含鐵量差異

由表1可知，不同鐵效率大豆在石灰性土壤中，受到缺鐵脅迫，導(dǎo)致大豆生長(zhǎng)過(guò)程中無(wú)法從環(huán)境中獲取能被吸收利用的Fe2+，進(jìn)而阻礙大豆器官的形成，最終影響大豆產(chǎn)量，如單株粒重、籽粒含鐵量、株高和單株莢重等。鐵高效品種株高、生物量、籽粒含鐵量、百粒重、單株莢重和單株粒重顯著高于鐵低效品種。鐵高效大豆品種鐵含量高于鐵低效品種，在缺鐵的石灰性土壤中，對(duì)鐵的利用率高。在本試驗(yàn)中，鐵高效品種籽粒含鐵量高于鐵低效品種，籽粒含鐵量可以作為石灰性土壤中不同鐵效率大豆的劃分依據(jù)。根據(jù)本試驗(yàn)不同鐵效率大豆品種的農(nóng)藝性狀及籽粒含鐵量，將供試大豆品種對(duì)鐵的利用率由高到低排序?yàn)椤?5’>‘吉育99’>‘長(zhǎng)農(nóng)15’>‘長(zhǎng)農(nóng)20’>‘吉育93’>‘吉育92’>‘吉育87’>‘吉農(nóng)27’。

表1 石灰性土壤中8個(gè)大豆品種農(nóng)藝性狀及籽粒含鐵量差異

2.2 石灰性土壤中不同鐵效率大豆品種的葉綠素含量變化

由表2可知，在石灰性土壤中，通過(guò)6個(gè)時(shí)期的比較分析，鐵高效品種葉片中葉綠素含量高于鐵低效品種，V1～R2時(shí)期差異顯著。隨著生育時(shí)期的延長(zhǎng)，不同鐵效率大豆葉綠素含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，V1～V4時(shí)期鐵高效品種葉綠素含量顯著高于鐵低效品種，在R1時(shí)期，鐵高效品種‘吉育99’與鐵低效品種‘吉育92’葉綠素含量差異不顯著(P>0.05)。R2時(shí)期，鐵高效品種‘吉育75’，‘長(zhǎng)農(nóng)15’，‘長(zhǎng)農(nóng)20’與鐵低效品種‘吉育92’葉綠素含量差異差不顯著(P>0.05)。

表2 不同鐵效率大豆品種不同發(fā)育時(shí)期葉綠素含量(SPAD)變化

2.3 石灰性土壤中不同鐵效率大豆品種的抗氧化酶活性變化

由表3可知，在石灰性土壤中，不同鐵效率大豆葉片中SOD含量呈現(xiàn)先降低再升高的趨勢(shì)，鐵高效品種葉片中SOD酶活性顯著高于鐵低效品種。在V4時(shí)期SOD酶活性最大，整體在R2時(shí)期下降，但鐵高效品種‘吉育75’酶活性上升，石灰性土壤苗期大豆植株SOD酶活性苗期反應(yīng)一致，但進(jìn)入生殖生長(zhǎng)期(R1時(shí)期)，鐵高效品種‘長(zhǎng)農(nóng)20’、‘吉育99’和鐵低效品種‘吉育87’、‘吉育93’、‘吉農(nóng)27’、‘吉育93’呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

表3 不同鐵效率大豆品種不同發(fā)育時(shí)期超氧化歧物酶(SOD)活性變化

由表4可知，在石灰性土壤中，鐵高效大豆品種葉片的POD酶活性顯著高于鐵低效品種，隨著生育時(shí)期的延長(zhǎng)，V2、R1時(shí)期呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但鐵高效品種‘吉育75’在V2時(shí)期酶活性下降；在R1時(shí)期，鐵低效品種‘吉農(nóng)27’與其他品種POD酶活性趨勢(shì)不一致。通過(guò)6個(gè)時(shí)期的比較分析，R1時(shí)期POD酶活性呈上升趨勢(shì)，含量最高，鐵高效品種‘吉育75’酶活性顯著高于其他品種。

表4 不同鐵效率大豆品種不同發(fā)育時(shí)期過(guò)氧化物酶(POD)活性變化

由表5可知，在石灰性土壤中，不同鐵效率大豆CAT活性呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，鐵高效品種CAT酶活性顯著高于鐵低效品種；V2時(shí)期鐵低效品種CAT酶活性上升，鐵高效品種‘長(zhǎng)農(nóng)20’、‘長(zhǎng)農(nóng)15’、‘吉育75’的CAT酶活性下降，‘吉育99’酶活性上升；V3時(shí)期，鐵高效品種‘長(zhǎng)農(nóng)15’酶活性下降，鐵低效品種‘吉育87’與‘吉農(nóng)27’酶活性下降，與其他大豆品種反應(yīng)不一致；V4、R2時(shí)期CAT酶活性，呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，V4時(shí)CAT酶活性高于其他生育時(shí)期，‘長(zhǎng)農(nóng)15’在鐵高效品種中CAT酶活性最高，‘吉育93’在鐵低效品種中CAT酶活性最高。

表5 不同鐵效率大豆品種不同發(fā)育時(shí)期過(guò)氧化氫酶(CAT)活性變化

3 討論與結(jié)論

活性氧在植物體內(nèi)的清除由保護(hù)酶和抗氧化物質(zhì)來(lái)完成。保護(hù)酶主要是超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和過(guò)氧化物酶(POD)等。植物在缺鐵脅迫時(shí)，植物通過(guò)一系列生理過(guò)程變化和植株形態(tài)變化來(lái)躲避或減輕脅迫對(duì)自身的傷害。本研究結(jié)果表明，石灰性土壤中，大豆植株遭受低鐵脅迫，也受到高pH的協(xié)同作用，石灰性土壤中鐵低效大豆株高、生物量、單株莢重和百粒重顯著低于鐵高效品種。Iturbe等[23]研究發(fā)現(xiàn)，豌豆品種在低鐵脅迫下，導(dǎo)致體內(nèi)活性氧增加，葉片的葉綠素含量下降。本研究發(fā)現(xiàn)，在V2與V3時(shí)期，鐵高效與鐵低效大豆品種葉片葉綠素含量差異顯著，鐵低效品種呈上升趨勢(shì)；鐵高效品種在V1～R2時(shí)期葉片葉綠素含量顯著高于鐵低效品種，說(shuō)明在石灰性土壤中，鐵高效大豆品種耐受低鐵脅迫的能力強(qiáng)于鐵低效品種。

在本研究中，鐵高效大豆品種葉片的氧化酶活性和葉綠素含量顯著高于鐵低效品種，由此推測(cè)在石灰性土壤中，鐵低效大豆由于不能激活鐵吸收機(jī)制，將遭受更嚴(yán)重的氧化損傷；而鐵高效大豆品種由于可產(chǎn)生一系列抗氧化生理反應(yīng)，使Fe3+轉(zhuǎn)化為Fe2+可被吸收利用，能適當(dāng)激活ROS清除酶，導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)降低。袁慶華等[23]研究結(jié)果表明，缺鐵脅迫下，紫花苜蓿葉片SOD先升高再降低；Yadavalli等[25]研究結(jié)果表明，在缺鐵脅迫下，水稻葉片SOD活性顯著增加。石灰性土壤中由于缺鐵脅迫，不同鐵效率大豆品種葉片的SOD酶活性均先降低后上升，隨著生育時(shí)期的延長(zhǎng)，鐵高效大豆植株中SOD酶活性增加，原因可能是由于不同作物對(duì)缺鐵反應(yīng)的不同。徐根娣等[26]研究發(fā)現(xiàn)，鐵脅迫條件下大豆POD酶活性增加，與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。在石灰性土壤中，缺鐵脅迫使大豆植株的抗氧化酶活性增強(qiáng)，使細(xì)胞免受外界損傷；不同鐵效率大豆品種間，變化趨勢(shì)不一致，說(shuō)明在缺鐵的石灰性土壤中鐵高效品種耐受性強(qiáng)于鐵低效品種，在缺鐵的石灰性土壤中高鐵的高效利用率也就意味著高產(chǎn)。