軒慧勇 宋強強 劉雪連 宋超慧 徐琦琦 秦 蕾 夏利寧*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學學院，烏魯木齊 830052；2.北京大北農(nóng)科技集團股份有限公司，北京 100192)

鼠傷寒沙門菌是重要的人獸共患腸道致病菌，同時也是臨床常見的非傷寒沙門菌致病血清型[1]，對動物和人的感染率和致病力都很高。在抗菌藥物的選擇壓力下，多重耐藥(Multi-drug resistance，MDR)鼠傷寒沙門菌的檢出率迅速增加并呈全球化擴散，在歐美和亞非等世界各地廣泛傳播[2-3]。Kijima等[4]、Porter等[5]和Wang等[6]均報道鼠傷寒沙門菌的耐藥率有逐年上升趨勢，耐藥問題已成為公共安全衛(wèi)生領域的核心問題之一。耐藥基因的攜帶是耐藥菌株產(chǎn)生耐藥的主要原因之一，耐藥基因可位于細菌的染色體上或質粒上，在人和動物的腸道內(nèi)通過水平方式和垂直方式進行耐藥基因/質粒等的傳遞，造就超級細菌[7]，還可以通過醫(yī)院、養(yǎng)殖場的廢水及動物和人的排泄物排放至環(huán)境造成污染，由此帶來的耐藥問題和食品安全問題也越來越嚴重。而有關新疆動物源鼠傷寒沙門菌的耐藥情況鮮見報道，鼠傷寒沙門菌在新疆多種動物中的分布及基因攜帶情況尚不明確。

本研究以新疆地區(qū)2015—2017年3年內(nèi)分離的寵物源(犬和貓)、雞源、牛源、羊源和豬源鼠傷寒沙門菌為研究對象，分離不同動物源的鼠傷寒沙門菌，旨在了解不同動物源鼠傷寒沙門菌的流行情況、耐藥性以及耐藥基因攜帶情況，對耐藥株的防控具有重要意義，同時為深入了解鼠傷寒沙門菌的多重耐藥機制提供材料和基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 質控菌株和試驗用沙門菌

大腸埃希標準質控菌(ATCC25922)購自天和微生物試劑有限公司(杭州)；試驗用沙門菌來源于新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院藥理實驗室2015—2017年期間分離鑒定并保存的不同動物源沙門菌。菌株背景：2015年烏魯木齊寵物源(犬和貓)沙門菌39株；2016年伊犁地區(qū)豬源沙門菌38株、牛源沙門菌99株和雞源沙門菌62株；2016年焉耆地區(qū)豬源沙門菌27株、牛源沙門菌62株、雞源沙門菌85株和羊源沙門菌17株；2017年石河子地區(qū)采集豬源沙門菌81株。共有不同動物源沙門菌510份，從中鑒定獲得的鼠傷寒沙門菌用于試驗。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

氯化鎂孔雀綠增菌液(Rappaport-Vassiliadis Medium，MM)、MH(Mueller-Hinton)培養(yǎng)基、SS瓊脂和沙門顯色培養(yǎng)基均購自奧博星生物技術有限公司(北京)；甘油和50×TE緩沖液購自生工生物工程(上海)股份有限公司；2 000 DNA Maker購自天根生化科技(北京)有限公司；BstF5I酶購自NEB公司；2×Taq PCR Master Mix、瓊脂糖和核酸染料均購自天根生化科技有限公司(北京)。

1.3 沙門菌的復蘇及模板的制備

對本實驗室通過沙門顯色培養(yǎng)基分離鑒定后得到的菌株進一步通過PCR擴增檢測攜帶invA基因[8]的沙門菌進行復蘇，并進行模板的制備。方法為：挑取沙門菌單菌落于1 mL MH肉湯中，37 ℃ 200 rpm過夜培養(yǎng)，吸取200 μL菌液1 3000 g離心 1 min 棄上清；加500 μL 1×TE緩沖液重懸，13 000 g 離心1 min棄上清；加200 μL 1×TE緩沖液重懸，沸水煮2 min，冰浴2 min；13 000 g離心5 min，取50～60 μL上清即DNA模板，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 沙門菌的血清型鑒定

根據(jù)沙門菌血清型特異性基因進行鼠傷寒沙門菌血清學鑒定，檢出spy基因的沙門菌即為鼠傷寒沙門菌[9]，引物均根據(jù)文獻由生工生物工程(上海)有限公司合成，引物序列見表1。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)測序比對，相似性>96%判定為該菌株的鑒定結果。

表1 本研究所用的引物信息

1.5 藥敏試驗

采用美國臨床實驗室標準化委員會(CLSI)發(fā)布的M100-S26抗微生物抗菌藥物敏感性試驗的執(zhí)行標準[10]，運用瓊脂稀釋法進行12種抗菌藥物最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentrations，MICs)的測定，依照CLSI2017版執(zhí)行標準判定結果。測試藥物包括臨床常用抗菌藥物以及部分備選抗菌藥物：環(huán)丙沙星(CIP)、阿米卡星(AMK)、慶大霉素(GEN)、氨芐西林(AMP)、頭孢噻呋(CEF)、頭孢曲松(CRO)、亞胺培南(IPM)、四環(huán)素(TET)、氟苯尼考(FFC)、多粘菌素(CL)、磺胺異惡唑(SMZ)和磷霉素(FOS)。

1.6 耐藥基因檢測

對分離鑒定的鼠傷寒沙門菌進行β-內(nèi)酰胺酶基因(blaTEM、blaCMY-2和blaSHV)、氟喹諾酮耐藥(Plasmid mediated fluoroquinolone resistant，PMQR)基因(qnrD、qnrS、oqxA、oqxB和aac(6′)-Ib)、四環(huán)素類耐藥基因(tetA和tetB)、氨基糖苷類耐藥基因(rmtB、aadA2和ant(3″)-Ia)、酰胺醇類耐藥基因(floR)、磺胺類耐藥基因(sul1)和多肽類耐藥基因(mcr-1)的檢測[11-14]。用BstF5I酶進行酶切已檢出aac(6′)-Ib基因的PCR產(chǎn)物，如果存在-cr突變，aac(6′)-Ib基因因失去BstF5I酶的限制性位點不能被切開。

2 結果與分析

2.1 不同動物源鼠傷寒沙門菌的分離鑒定

510份不同動物源沙門菌，經(jīng)PCR擴增檢測spy基因后得到162株鼠傷寒沙門菌，分離率為31.8%。圖1為部分spy基因PCR檢測結果。不同動物源鼠傷寒沙門菌的分離率如下：2015年烏魯木齊鼠傷寒沙門菌的分離率為100.0%(39/39)；2016年伊犁地區(qū)豬源、牛源和雞源鼠傷寒沙門菌的分離率依次為0%(0/38)、1.0%(1/99)和1.6%(1/62)；2016年焉耆地區(qū)豬源、牛源、雞源和羊源鼠傷寒沙門菌的分離率依次為40.7%(11/27)、48.4%(30/62)、10.6%(9/85)和47.1%(8/17)；2017年石河子豬源鼠傷寒沙門菌的分離率為77.8%(63/81)(表2)。

1～9：試驗菌株；M：DNA Marker；+：陽性對照；-：陰性對照

對分離結果采用卡方檢驗進行統(tǒng)計學分析，結果顯示，寵物源分離率顯著高于其他動物源(P<0.05)，羊源和豬源分離率無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，雞源分離率最低(表2)。

表2 動物源鼠傷寒沙門菌的分離情況

2.2 動物源鼠傷寒沙門菌耐藥及多重耐藥情況

不同動物源鼠傷寒沙門菌對被檢測的抗菌藥物呈現(xiàn)高耐藥和高敏感結果(表3)，耐藥率從高到低依次為寵物源，羊源，豬源，牛源和雞源。不同動物源鼠傷寒沙門菌對磺胺異惡唑的耐藥率均為100.0%，對環(huán)丙沙星、氨芐西林、四環(huán)素和氟苯尼考的耐藥率超過80.0%；其中，以寵物源鼠傷寒沙門菌耐藥譜最寬，對被檢測的12種抗菌藥物中的9種抗菌藥物耐藥，羊源鼠傷寒沙門菌對其中7種抗菌藥物耐藥，其余動物源鼠傷寒沙門菌都對其中5種抗菌藥物耐藥；僅寵物源鼠傷寒沙門菌對頭孢曲松和亞胺培南各檢出1株耐藥菌株，對多粘菌素檢出2株耐藥菌株，其余動物源鼠傷寒沙門菌均對頭孢曲松、亞胺培南和多粘菌素高度敏感，無耐藥菌株檢出；除豬源鼠傷寒沙門菌對慶大霉素檢出3株耐藥菌株外，其余動物源鼠傷寒沙門菌對慶大霉素無耐藥菌株檢出。

表3 動物源鼠傷寒沙門菌對12種抗菌藥物的耐藥率

162株動物源鼠傷寒沙門菌多重耐藥在0～9耐有分布，3耐及3耐以上菌株占98.1%(159/162)。不同動物源鼠傷寒沙門菌多重耐藥均以5耐為主(寵物源5耐占94.8%、牛源5耐占93.6%、羊源5耐占87.4%、雞源5耐占80.0%、豬源5耐占71.5%)(表4)。

表4 動物源鼠傷寒沙門菌多重耐藥率

162株動物源鼠傷寒沙門菌共有12種耐藥譜型，不同動物源鼠傷寒沙門菌耐藥譜型均以5耐譜型CIP-AMP-TET-FFC-SMZ為主，且寵物源(94.8%)、牛源(93.6%)和羊源(87.5%)的5耐譜型菌株數(shù)達85.0%以上；以豬源鼠傷寒沙門菌耐藥譜型最多，共有7種譜型，寵物源鼠傷寒沙門菌和牛源鼠傷寒沙門菌各有3種耐藥譜型，而羊源和雞源鼠傷寒沙門菌各有2種耐藥譜型(表5)。

表5 動物源鼠傷寒沙門菌耐藥譜型

2.3 動物源鼠傷寒沙門菌耐藥基因檢測

不同動物源鼠傷寒沙門菌均檢出β-內(nèi)酰胺酶基因、四環(huán)素基因、氨基糖苷類基因、酰胺醇類基因和磺胺類基因。除豬源菌以攜帶β-內(nèi)酰胺酶基因blaCMY-2(93.2%)為主外，其余動物源菌以攜帶blaTEM基因為主，blaTEM基因檢出率在60.0%以上；不同動物源鼠傷寒沙門菌四環(huán)素耐藥基因均以攜帶tetB基因為主，檢出率高達80.0%以上，僅在豬源鼠傷寒沙門菌中檢出tetA(5.4%)基因；不同動物源鼠傷寒沙門菌PMQR因子均以攜帶oqxA、oqxB和aac(6′)-Ib-cr基因為主，檢出率達50.0%以上，且aac(6)-Ib基因均存在-cr突變，僅在寵物源菌中檢出qnrS(97.4%)基因。此外，不同動物源鼠傷寒沙門菌氨基糖苷類耐藥基因以攜帶aadA2和ant(3″)-Ia為主，檢出率達60.0%以上，對酰胺醇類耐藥基因floR和磺胺類耐藥基因sul1的檢出率也在50.0%以上，不同動物源鼠傷寒沙門菌均未檢出多肽類耐藥基因mcr-1(表6)。

4 討 論

沙門菌是人畜共患病和食物中毒的主要食源性病原菌之一，除在自然界中分布極廣外，雞、鴨、豬、牛、羊等家禽和家畜動物腸道也廣泛分布，給養(yǎng)殖業(yè)和食品安全造成潛在危害[15]。鼠傷寒沙門菌是食源性沙門菌的優(yōu)勢血清型，如廣西、河北、河南和廣東等都有報道[16]。本研究分離結果顯示，不同動物源鼠傷寒沙門菌的整體分離率為31.8%，其中，以寵物源鼠傷寒沙門菌的分離率最高，達100.0%，羊源和豬源鼠傷寒沙門菌的分離率也達到47.0%以上。本研究從不同動物源中均分離出鼠傷寒沙門菌，說明鼠傷寒沙門菌在自然界中宿主廣泛，若從蛋肉產(chǎn)品中檢出耐藥鼠傷寒沙門菌，則會存在食品安全隱患。此外，耐藥鼠傷寒沙門菌可在人和動物之間通過食物鏈甚至是與寵物親密接觸時進行傳遞，為保障公共衛(wèi)生安全，應加強耐藥鼠傷寒沙門菌的監(jiān)測。

本研究對新疆地區(qū)不同動物源分離的鼠傷寒沙門菌藥敏試驗結果顯示，新疆地區(qū)鼠傷寒沙門菌耐藥現(xiàn)象十分嚴重，以寵物源鼠傷寒沙門菌耐藥譜最寬，對被檢測的9種抗菌藥物耐藥，但對頭孢噻呋、頭孢曲松和亞胺培南均檢出1株耐藥株，可能是寵物主人擅自對寵物使用人用藥物或不按療程給寵物用藥造成的。不同動物源鼠傷寒沙門菌對被檢測的抗菌藥物磺胺異惡唑的耐藥率高達100.0%，與張增峰[17]報道的上海市零售肉中和環(huán)境中鼠傷寒沙門菌的耐藥結果一致，但耐藥率高于夏宇飛等[18]報道的湖南地區(qū)豬源及雞源對磺胺異惡唑的耐藥率(60.0%～70.0%)，藥敏結果顯示出不同地區(qū)以及不同動物源由于使用抗菌藥物的種類和劑量的差異，其耐藥結果也相差較大[17-18]。此外，不同動物源鼠傷寒沙門菌對環(huán)丙沙星、氨芐西林、四環(huán)素和氟苯尼考的耐藥率高達80.0%以上，耐藥率與羅學輝等[19]報道的河水、食品及食源性疾病患者中鼠傷寒沙門菌耐藥結果一致，分析原因可能是以上幾種藥物性價比高，容易獲得，長期不合理的使用甚至濫用，導致高水平耐藥菌株的出現(xiàn)。鼠傷寒沙門菌對慶大霉素、頭孢噻呋、頭孢曲松和多粘菌素的耐藥率處于較低的水平，耐藥率在2.6%～5.1%，可作為治療細菌性疾病的備選藥物，但由于鼠傷寒沙門菌要較其他血清型的沙門菌更易產(chǎn)生耐藥性[15]，因此在治療時要注意藥物的使用頻率和劑量，降低耐藥菌的產(chǎn)生率。

多重耐藥結果顯示，不同動物源鼠傷寒沙門菌多重耐藥率達98.0%以上，與段瑤等[20]報道的畜禽鼠傷寒沙門菌多重耐藥率(90.44%)基本一致，本研究中以5耐菌株占比最高，達77.8%，8耐及以上耐藥菌株占比達10.4%，多重耐藥結果顯示出新疆不同動物源鼠傷寒沙門菌對臨床使用的很多抗菌藥物已普遍產(chǎn)生耐藥性，不僅耐藥率高，并且對抗菌藥物的交叉耐藥現(xiàn)象嚴重，進而增加多重耐藥菌的感染率。不同動物源鼠傷寒沙門菌共有12種耐藥譜型，以豬源耐藥譜型最多，有7種耐藥譜型，分析原因是相對于其他動物，豬養(yǎng)殖基本趨于規(guī)?；?，養(yǎng)殖過程中豬只更易感染細菌性疾病。此外，養(yǎng)殖場為了避免豬只患病，也可能會飼喂含有抗菌藥物的飼料，故而豬只使用抗菌藥物的頻率和種類較其他動物多，因此豬源鼠傷寒沙門菌具有較寬的耐藥譜型。本研究中不同動物源多重耐藥優(yōu)勢表型為CIP-AMP-TET-FFC-SMZ，耐藥譜寬，多重耐藥嚴重。四環(huán)素、氟苯尼考和磺胺異惡唑都是長期使用在動物養(yǎng)殖過程中的藥物，該耐藥譜型的形成與這些抗菌藥物的使用密切相關。此外，鼠傷寒沙門菌在用藥的環(huán)境中，部分菌株通過染色體的局部抑制基因突變，抑制孔蛋白表達，進而使抗菌藥物無法進入菌體內(nèi)，也是沙門菌在長期進化過程中產(chǎn)生耐藥性的原因[21]。

細菌攜帶耐藥基因是其耐藥性產(chǎn)生和傳播的主要原因之一。本研究對七大類16種耐藥基因檢測結果顯示，不同動物源鼠傷寒沙門菌除對多肽類耐藥基因未檢出外，對其他六類被檢測的抗菌藥物的耐藥基因均有檢出，除豬源鼠傷寒沙門菌對blaTEM和tetA基因的檢出率為6.8%和5.4%以外，不同動物源鼠傷寒沙門菌對其余檢出的耐藥基因的檢出率高達50.0%以上，本研究耐藥結果顯示出新疆不同動物源鼠傷寒沙門菌耐藥基因攜帶率很高。值得注意的是，鼠傷寒沙門菌對β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥主要是由于產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，并以blaTEM型、blaCTX-M型、blaOXA型和blaSHV型較為常見[21]，本研究結果顯示，寵物源、羊源和雞源鼠傷寒沙門菌均以攜帶blaTEM型為主，該耐藥基因的檢出率在62.5%以上，但豬源鼠傷寒沙門菌卻以攜帶blaCMY-2型為主，雖然都是介導對β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥，但不同動物源主要攜帶的耐藥基因卻不同。此外，blaTEM基因可以在不同菌株間進行水平傳播和垂直傳播，而攜帶blaTEM基因的陽性菌株通常都帶有多重耐藥，給多重耐藥菌的防控造成巨大壓力[22]。此外，本試驗發(fā)現(xiàn)耐藥表型與耐藥基因型不完全正相關，如羊源鼠傷寒沙門菌對酰胺醇類和磺胺類的耐藥率高達100.0%，但相關耐藥基因floR和sul1的檢出率為50.0%～62.5%。耐藥基因的位置、表達情況及不同耐藥基因之間的相互作用會影響細菌對抗菌藥物的耐藥性，具體機制有待進一步研究。新疆地廣人稀，故監(jiān)測范圍有限，且樣本數(shù)量和樣本收集年限有限，不能十分全面反映出新疆近年來不同動物源鼠傷寒沙門菌的耐藥情況。應在全疆范圍內(nèi)加大對鼠傷寒沙門菌菌株的監(jiān)測，進而提供更全面的結果。

綜上，新疆不同動物源耐藥鼠傷寒沙門菌分布廣泛，對環(huán)丙沙星、氨芐西林、四環(huán)素、氟苯尼考和磺胺異惡唑等常用抗菌藥物高度耐藥，可根據(jù)藥敏結果選用頭孢噻呋和慶大霉素等敏感性較高的抗菌藥物來提高療效。不同動物源鼠傷寒沙門菌多重耐藥嚴重，具有相同耐藥譜型，且耐藥基因攜帶率高，存在克隆傳播的風險。為更全面掌握新疆動物源性鼠傷寒沙門菌的耐藥情況，應對鼠傷寒耐藥沙門菌進行長期監(jiān)測，實現(xiàn)實驗室和流行病相結合的監(jiān)測模式，進而更好的保護動物和人類健康。