慢性熱應(yīng)激對(duì)放牧肉牛血液生化指標(biāo)、抗氧化能力及免疫功能的影響

陳 浩 王純潔 斯木吉德 張 晨 武思同 徐 萍 曹佳明 劉飛鴻 敖日格樂(lè)*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010018)

當(dāng)動(dòng)物產(chǎn)生的熱負(fù)荷超出其散熱能力時(shí)，機(jī)體所做出非特異性反應(yīng)總和被稱(chēng)為熱應(yīng)激[1]。隨著全球氣候變暖和養(yǎng)殖業(yè)集約化程度的加大，熱應(yīng)激給畜牧業(yè)生產(chǎn)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成了巨大的損失。Ferreira等[2]研究指出熱應(yīng)激對(duì)美國(guó)奶牛產(chǎn)業(yè)每年造成了近20億美元的損失；還有學(xué)者報(bào)道高溫高濕環(huán)境所引發(fā)的熱應(yīng)激導(dǎo)致發(fā)展中國(guó)家養(yǎng)殖業(yè)的生產(chǎn)效率下降25%[3]。根據(jù)應(yīng)激的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間可分為急性和慢性熱應(yīng)激，急性熱應(yīng)激通常強(qiáng)度較大，持續(xù)時(shí)間為3～24 h；而慢性熱應(yīng)激的應(yīng)激強(qiáng)度較為溫和，且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)；通常由季節(jié)變化所引起的較溫和的熱應(yīng)激屬于慢性熱應(yīng)激，持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)且在畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中普遍發(fā)生。大量學(xué)者通過(guò)比較不同季節(jié)家畜生產(chǎn)性能的差異研究發(fā)現(xiàn)，與冬、春兩季相比，夏季高溫高濕環(huán)境可造成奶牛乳品質(zhì)顯著下降、繁殖性能降低以及疾病發(fā)生率升高等危害[4-5]。

當(dāng)動(dòng)物遭受應(yīng)激時(shí)，其機(jī)體內(nèi)分泌系統(tǒng)可通過(guò)多種激素調(diào)控機(jī)體的生理功能以維持內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定。有研究發(fā)現(xiàn)處于熱應(yīng)激狀態(tài)下的奶牛甲狀腺機(jī)能減退以減少機(jī)體產(chǎn)熱[6]。黃牛遭受熱應(yīng)激侵襲時(shí)，其甲狀腺激素分泌量顯著降低[7]。當(dāng)環(huán)境溫度達(dá)到35 ℃時(shí)，奶牛血清中的甲狀腺激素含量顯著降低65%，極大降低了用以維持機(jī)體正常生理活動(dòng)的甲狀腺機(jī)能[8]。此外，熱應(yīng)激還可引起動(dòng)物機(jī)體內(nèi)自由基增多，破壞體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)平衡，進(jìn)而導(dǎo)致抗病力下降引發(fā)各種病理癥狀。據(jù)研究報(bào)道熱應(yīng)激可導(dǎo)致山羊的免疫功能和抗氧化能力顯著下降[9]。也有研究表明熱應(yīng)激狀態(tài)下肉雞的抗氧化能力和平均日增重均顯著下降[10]。目前，國(guó)內(nèi)有關(guān)家畜熱應(yīng)激的研究主要集中于南方高溫高濕環(huán)境所造成的嚴(yán)重?zé)釕?yīng)激。董曉霞等[11]研究發(fā)現(xiàn)北京地區(qū)的奶牛每年有130 d以上處于熱應(yīng)激狀態(tài)；徐明等[12]通過(guò)研究呼和浩特地區(qū)奶牛舍內(nèi)溫濕度年度變化規(guī)律，結(jié)果顯示全年內(nèi)奶牛共有144 d處于熱應(yīng)激期。

內(nèi)蒙古草原夏季常出現(xiàn)極端高溫天氣，局部地區(qū)最高氣溫可超過(guò)40 ℃，而放牧肉牛在無(wú)遮陰處的草原上，極易遭受熱應(yīng)激的侵襲[13]。但目前關(guān)于內(nèi)蒙古地區(qū)反芻動(dòng)物熱應(yīng)激的研究多數(shù)集中于奶牛和羊，研究表明，熱應(yīng)激導(dǎo)致奶牛和羊的采食量下降，進(jìn)而引起營(yíng)養(yǎng)代謝病發(fā)病率升高并降低其生產(chǎn)性能，尚未有內(nèi)蒙古地區(qū)肉牛熱應(yīng)激的相關(guān)研究。因此，本研究以放牧西門(mén)塔爾母牛為試驗(yàn)對(duì)象，探討慢性熱應(yīng)激對(duì)放牧條件下西門(mén)塔爾母牛血液指標(biāo)、免疫指標(biāo)及抗氧化指標(biāo)的影響，旨在為夏季放牧肉牛熱應(yīng)激相關(guān)研究提供數(shù)據(jù)支持和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)在內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市阿魯科爾沁旗巴彥溫都爾草原的牧戶(hù)家庭牧場(chǎng)進(jìn)行，選取20頭體況相近的健康西門(mén)塔爾母牛，全部試驗(yàn)牛均在同一天然草場(chǎng)自然放牧(牧草營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1)，自由飲水(草場(chǎng)內(nèi)有天然河流)。試驗(yàn)分為熱應(yīng)激期(2019年7月15日—8月5日)和熱應(yīng)激恢復(fù)期(2019年8月6日—8月25日)2個(gè)階段。

表1 放牧草場(chǎng)牧草養(yǎng)分

1.2 綜合指數(shù)(CCI)測(cè)定

本次試驗(yàn)是以在天然草場(chǎng)全年自然放牧的肉牛為研究對(duì)象，所測(cè)的環(huán)境指標(biāo)均為草場(chǎng)自然環(huán)境中的溫度和相對(duì)濕度。試驗(yàn)期間，測(cè)定每天8:00、14：00 以及20:00時(shí)放牧草場(chǎng)的溫度、相對(duì)濕度和風(fēng)速，記錄日照時(shí)間并根據(jù)Mader等[14]提出的綜合指數(shù)(Comprehensive climate index, CCI)計(jì)算公式計(jì)算牧場(chǎng)的CCI：

CCI=T+RH+WS+RAD

式中：T為環(huán)境溫度，RH為環(huán)境濕度校正數(shù)，WS為風(fēng)速校正數(shù)，RAD為輻射校正數(shù)。

1.3 血清制備和血液生化指標(biāo)測(cè)定

分別于試驗(yàn)期的最后一天清晨出牧前，頸靜脈采集所有試驗(yàn)牛非抗凝血10 mL，室溫靜置0.5 h后 3 500 r/min 離心10 min，吸取上清液分裝至 1.5 mL 離心管中，分離出的血清立即置于液氮罐中保存，帶回實(shí)驗(yàn)室于-20 ℃冰箱中保存待測(cè)定。甲狀腺素、三碘甲狀腺原氨酸、生長(zhǎng)激素、胰島素樣生長(zhǎng)因子、尿素氮、葡萄糖、胰島素和胰高血糖素含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京華英生物技術(shù)研究所；總抗氧化能力、超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、丙二醛以及免疫球蛋白測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，測(cè)定過(guò)程均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)由Excel 2010處理后，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行配對(duì)樣本T檢驗(yàn)(Student’s T test)，并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，以P<0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 牧草營(yíng)養(yǎng)成分和綜合指數(shù)測(cè)定結(jié)果

由表2可知，在試驗(yàn)第一階段草場(chǎng)最高溫度達(dá)到39.60 ℃，平均溫度為30.40 ℃，CCI在此期間平均高達(dá)38.77，表明此階段的西門(mén)塔爾牛遭受熱應(yīng)激侵襲；而試驗(yàn)第二階段草場(chǎng)最高溫度為28.60 ℃，平均溫度為20.30 ℃，CCI為23.63，均未達(dá)到肉牛產(chǎn)生熱應(yīng)激的臨界值；且根據(jù)表1顯示試驗(yàn)期間牧草營(yíng)養(yǎng)成分無(wú)顯著變化，符合試驗(yàn)要求，可進(jìn)行西門(mén)塔爾牛免疫及抗氧化功能的比較研究試驗(yàn)。

表2 不同試驗(yàn)期草場(chǎng)溫濕度及CCI

2.2 慢性熱應(yīng)激對(duì)放牧牛血液生化指標(biāo)的影響

慢性熱應(yīng)激對(duì)放牧牛血清激素的影響見(jiàn)表3。由表3可知，慢性熱應(yīng)激導(dǎo)致放牧牛平均日增重顯著降低，且對(duì)放牧牛血清激素含量有顯著影響。與熱應(yīng)激恢復(fù)期相比，熱應(yīng)激期牛血清T3、T4、GLU、INS和IGF-1含量顯著降低(P<0.05)；熱應(yīng)激狀態(tài)下放牧牛血清中BUN含量有升高的趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)；GH和GC含量在熱應(yīng)激和熱應(yīng)激恢復(fù)期差異不顯著(P>0.05)。

表3 西門(mén)塔爾牛血清激素測(cè)定

2.3 慢性熱應(yīng)激對(duì)放牧牛抗氧化指標(biāo)和免疫指標(biāo)的影響

由表4和表5可知，慢性熱應(yīng)激對(duì)放牧牛血清抗氧化指標(biāo)和免疫指標(biāo)有顯著影響。與熱應(yīng)激恢復(fù)期相比，T-AOC、SOD活性和血清中IgA、IgG、IgM和IL-2含量顯著降低(P<0.05)；熱應(yīng)激期牛血清 IL-1β、IL-6和MDA含量顯著增加(P<0.05)；而 IL-4 含量和GSH-Px活性在熱應(yīng)激和熱應(yīng)激恢復(fù)期差異不顯著(P>0.05)。

表4 西門(mén)塔爾牛血清抗氧化指標(biāo)測(cè)定

表5 西門(mén)塔爾牛血清免疫指標(biāo)測(cè)定

3 討 論

3.1 慢性熱應(yīng)激對(duì)肉牛血液生化指標(biāo)的影響

肉牛熱應(yīng)激是由環(huán)境溫度、濕度、空氣對(duì)流及自身產(chǎn)熱等多種因素引起，其中環(huán)境溫濕度是最主要的影響因素，因此綜合環(huán)境溫濕度、風(fēng)速及日照時(shí)間的CCI是判斷放牧條件下肉牛是否遭受熱應(yīng)激的重要指標(biāo)[15]。一般認(rèn)為當(dāng)CCI>25時(shí)肉牛處于熱應(yīng)激狀態(tài)；奶牛生產(chǎn)的可適應(yīng)溫度范圍為-0.5～20.0 ℃，肉牛生長(zhǎng)適宜溫度是5～25 ℃[16-18]。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，試驗(yàn)前期草場(chǎng)平均溫度為30.40 ℃，CCI達(dá)到28.77，已超出牛產(chǎn)生熱應(yīng)激的臨界值，試驗(yàn)牛處于熱應(yīng)激狀態(tài)；同理放牧牛在試驗(yàn)后期處于非應(yīng)激狀態(tài)。本試驗(yàn)根據(jù)熱應(yīng)激反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間，判定試驗(yàn)前期為慢性熱應(yīng)激期。

T3和 T4在動(dòng)物機(jī)體能量代謝和生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有重要的作用[19]。何欽等[20]研究表明，熱應(yīng)激狀態(tài)下奶牛血清中T3和 T4濃度顯著下降，并導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率和乳品質(zhì)降低；LARA等[21]通過(guò)研究慢性熱應(yīng)激狀態(tài)下肉雞生產(chǎn)性能的變化，發(fā)現(xiàn)慢性熱應(yīng)激顯著降低了肉雞的生產(chǎn)性能和血清中T3和 T4濃度，與本試驗(yàn)結(jié)果一致，這表明慢性熱應(yīng)激可導(dǎo)致放牧肉牛機(jī)體代謝能力降低，減少機(jī)體產(chǎn)熱以適應(yīng)高溫環(huán)境。此外，本研究發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激狀態(tài)下放牧肉牛血清中IGF-1含量顯著降低，這可能由高溫環(huán)境下機(jī)體代謝水平的下降所引起的。血清中BUN是蛋白質(zhì)代謝的終末產(chǎn)物，其含量的高低可反映動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)狀況[22]。Ikuta等[23]研究發(fā)現(xiàn)，奶牛血清中BUN含量和溫度的升高呈顯著正相關(guān)，這可能由高溫環(huán)境下肉牛食欲降低、采食量下降導(dǎo)致其無(wú)法獲取足夠能量，氨基酸代謝加強(qiáng)導(dǎo)致血清中BUN升高。熱應(yīng)激狀態(tài)下放牧肉牛血清BUN含量有升高的趨勢(shì)，但差異不顯著，這可能由動(dòng)物遭受慢性熱應(yīng)激時(shí)，機(jī)體仍以糖類(lèi)和脂肪分解為機(jī)體功供能。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)物血清GLU含量隨環(huán)境溫度的升高而降低[24-25]。血液中的GLU可通過(guò)氧化釋放或轉(zhuǎn)化能量方式為動(dòng)物機(jī)體供能調(diào)節(jié)其生命活動(dòng)；INS是由胰島B細(xì)胞分泌的一類(lèi)可調(diào)節(jié)GLU合成和轉(zhuǎn)化作用的蛋白質(zhì)激素[26]。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示熱應(yīng)激狀態(tài)下肉牛血清中GLU和INS含量均顯著下降，這可能是由于母牛機(jī)體為調(diào)節(jié)血糖濃度而減少了INS的分泌量。

3.2 慢性熱應(yīng)激對(duì)西門(mén)塔爾?？寡趸芰Φ挠绊?/h3>

動(dòng)物機(jī)體自身具有廣泛的抗氧化防御機(jī)制，T-AOC、GSH-Px及SOD均是酶促體系中的主要抗氧化酶[27]。GSH-Px可通過(guò)清除體內(nèi)過(guò)多的自由基以抑制機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化；SOD是機(jī)體內(nèi)一種重要的抗氧化酶，在清除自由基和防止生物大分子損傷等方面具有重要作用；T-AOC代表機(jī)體防御體系的抗氧化能力[28-30]。由于抗氧化酶系統(tǒng)在不斷地清除體內(nèi)產(chǎn)生的自由基，因此自由基的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡中，從而保護(hù)機(jī)體在正常生長(zhǎng)代謝過(guò)程中免受氧化應(yīng)激損傷；若機(jī)體內(nèi)的自由基不能被及時(shí)清除，體內(nèi)積累的大量自由基可通過(guò)破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，使生物膜中的不飽和脂類(lèi)發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化并形成脂質(zhì)過(guò)氧化物，其最終產(chǎn)物即是MDA，因此其含量可間接反映自由基產(chǎn)生的情況和組織細(xì)胞的損傷程度[31]。動(dòng)物機(jī)體生物膜功能一旦遭到破壞，將進(jìn)而損傷蛋白質(zhì)及核酸等生物大分子，導(dǎo)致機(jī)體代謝功能發(fā)生紊亂。當(dāng)動(dòng)物遭受應(yīng)激時(shí)，其抗氧化酶系統(tǒng)平衡被打破，機(jī)體需耗費(fèi)大量的抗氧化酶進(jìn)行消除過(guò)多的自由基[32]。據(jù)研究結(jié)果表明，在遭受慢性熱應(yīng)激侵襲時(shí)，山羊血清SOD和GSH-Px等抗氧化酶活性顯著下降，且MDA含量增加[33]。在肉牛研究中也發(fā)現(xiàn)，夏季肉牛血清中的抗氧化酶活性極顯著低于春季[34]。白丹丹[35]通過(guò)研究季節(jié)變化對(duì)三河牛機(jī)體抗氧化能力的影響，也得出了類(lèi)似的結(jié)果。本研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激狀態(tài)下西門(mén)塔爾牛血清中MDA含量相比于熱應(yīng)激恢復(fù)期顯著升高，T-AOC和SOD活性顯著降低，這與前人的研究結(jié)果一致。由于熱應(yīng)激可以導(dǎo)致誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)自由基的產(chǎn)生量增加，為清除體內(nèi)產(chǎn)生的過(guò)多自由基，西門(mén)塔爾母牛血清中GSH-Px和SOD被大量消耗，進(jìn)而加快機(jī)體組織的脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致其終產(chǎn)物MDA含量顯著升高，西門(mén)塔爾母牛體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)平衡因此被打破，導(dǎo)致其T-AOC顯著下降，這些結(jié)果均表明慢性熱應(yīng)激對(duì)西門(mén)塔爾母牛機(jī)體造成了一定的氧化損傷。因此，在夏季放牧草場(chǎng)中需要為放牧肉牛提供維生素[36]及礦物質(zhì)[37]舔磚供肉牛舔食，以緩解高溫侵襲所導(dǎo)致的肉牛抗氧化能力下降。

3.3 慢性熱應(yīng)激對(duì)西門(mén)塔爾牛免疫功能的影響

免疫球蛋白是一類(lèi)當(dāng)動(dòng)物受到抗原刺激后產(chǎn)生的用以清除抗原的球蛋白，IgA、IgG和IgM可在機(jī)體特異性免疫中發(fā)揮重要作用[38]。Wu等[39]研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)物機(jī)體內(nèi)免疫球蛋白的含量可能取決于應(yīng)激強(qiáng)度、持續(xù)時(shí)間以及動(dòng)物品種和體況。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，不同持續(xù)時(shí)間的熱應(yīng)激均可導(dǎo)致山羊血清中IgA、IgG和IgM含量顯著降低，這表明在高溫環(huán)境下，山羊機(jī)體的免疫功能受到抑制，嚴(yán)重?fù)p害了其體液免疫[9,33]。此外，熱應(yīng)激可導(dǎo)致肉牛血清中IgG含量顯著下降[40]。本研究表明，西門(mén)塔爾母牛在慢性熱應(yīng)激期間血清中IgA、IgG和IgM含量顯著降低，這與上述研究結(jié)果一致，表明慢性熱應(yīng)激抑制了肉牛的體液免疫功能。

IL-2 是一種主要由活化的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的多效性細(xì)胞因子,具有廣泛的生理與病理效應(yīng)，可促進(jìn)T細(xì)胞增殖分化，增強(qiáng)T細(xì)胞和NK細(xì)胞活性，機(jī)體內(nèi)IL-2含量的多少可以間接反映出機(jī)體的免疫應(yīng)答水平[41]。IL-4可誘導(dǎo)B細(xì)胞成熟并刺激其產(chǎn)生免疫球蛋白，對(duì)體液免疫具有重要調(diào)節(jié)作用[42]。有研究表明，慢性熱應(yīng)激狀態(tài)下，山羊血清中IL-2含量有下降的趨勢(shì)[33]。本研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激狀態(tài)下西門(mén)塔爾母牛血清中IL-2含量顯著低于熱應(yīng)激恢復(fù)期，與馬燕芬等[40]研究結(jié)果一致，表明慢性熱應(yīng)激可能降低了動(dòng)物機(jī)體的免疫應(yīng)答。然而大量關(guān)于急性熱應(yīng)激對(duì)畜禽血清IL-2水平的影響結(jié)果表明，急性熱應(yīng)激可導(dǎo)致血清IL-2含量顯著增加[43-44]。這表明IL-2含量可能與熱應(yīng)激的持續(xù)時(shí)間相關(guān)，有必要設(shè)置不同梯度的熱應(yīng)激持續(xù)時(shí)間進(jìn)行深入研究。Peli等[45]研究表明，肉牛在遭受慢性熱應(yīng)激侵襲時(shí)血清中IL-4含量顯著升高，也有研究發(fā)現(xiàn)，慢性熱應(yīng)激狀態(tài)下肉牛血清IL-4含量無(wú)顯著變化[46]。本研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激狀態(tài)下西門(mén)塔爾牛血清中IL-4含量有下降的趨勢(shì)，與上述結(jié)果熱應(yīng)激狀態(tài)下動(dòng)物血清中IL-4含量變化不一致，這可能與試驗(yàn)動(dòng)物的品種或熱應(yīng)激狀態(tài)下試驗(yàn)動(dòng)物所處環(huán)境不同有關(guān)，有必要進(jìn)行深入研究。促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-6的少量分泌可局部作用于免疫細(xì)胞，增強(qiáng)免疫反應(yīng)，以緩解應(yīng)激對(duì)機(jī)體造成的損傷，但過(guò)量分泌可造成組織損傷進(jìn)而損害機(jī)體的免疫功能[47-48]。本研究表明，在遭受熱應(yīng)激侵襲時(shí)，肉牛血清中IL-1β和IL-6含量均顯著增加，這與前人的研究結(jié)果一致。急性或者慢性熱應(yīng)激均可導(dǎo)致畜禽血清IL-1β和IL-6含量顯著增加，這可能是由于免疫細(xì)胞細(xì)胞膜中的不飽和脂肪酸對(duì)機(jī)體氧化應(yīng)激高度敏感，因此，當(dāng)免疫細(xì)胞受到氧化應(yīng)激后免疫功能下降，進(jìn)而導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體發(fā)生了炎癥反應(yīng)[49-50]。

4 結(jié) 論

慢性熱應(yīng)激降低了放牧肉牛的免疫功能和抗氧化能力，對(duì)肉牛機(jī)體造成了一定的損傷；慢性熱應(yīng)激對(duì)放牧肉牛的內(nèi)分泌激素水平有較大的影響，表明肉?？赏ㄟ^(guò)內(nèi)分泌系統(tǒng)自身調(diào)節(jié)來(lái)提高機(jī)體對(duì)熱應(yīng)激的適應(yīng)能力。