劉祥圣 冀 飛 寧麗麗 趙國(guó)琦*

(1.揚(yáng)州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 江蘇 揚(yáng)州 225009；2.Zinpro Corporation, Eden Prairie, MN 55344, USA)

銅作為生命體的必需元素，是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)細(xì)胞色素氧化酶、酪氨酸酶、超氧化物歧化酶和銅藍(lán)蛋白等多種酶的組成成分，對(duì)動(dòng)物機(jī)體的造血、色素沉積、骨骼發(fā)育和免疫能力具有重要作用[1]。研究表明，飼糧中補(bǔ)充銅能夠提高奶牛的產(chǎn)奶量、抗氧化能力和免疫能力[2-3]，對(duì)促進(jìn)反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵也具有重要作用[4]。然而，成年反芻動(dòng)物對(duì)銅的吸收率較低，僅為5%～10%，大部分飼糧中的銅未被充分利用而被排泄[5]，因而在奶牛生產(chǎn)中存在較為嚴(yán)重的銅污染問(wèn)題。目前在生產(chǎn)中應(yīng)用較為廣泛的是以硫酸銅為代表的無(wú)機(jī)銅，有機(jī)銅包括蛋白鹽銅和氨基酸螯合銅，可提高反芻動(dòng)物的生物利用度引起廣泛關(guān)注[6]。Dezfoulian等[7]研究表明蛋白鹽銅相較于硫酸銅能夠減少羔羊銅的排泄量，李寰旭和王芬[8]的研究同樣表明羥基蛋氨酸銅相較于硫酸銅具備更高的生物利用度。Bampidis等[9]的研究表明賴氨酸銅和谷氨酸銅的1∶1絡(luò)合物相較于硫酸銅可提高雞體內(nèi)銅沉積量，并證實(shí)了賴氨酸銅和谷氨酸銅的1∶1絡(luò)合物是安全有效的銅源。賴氨酸銅和谷氨酸銅的1∶1絡(luò)合物作為新型氨基酸螯合銅，目前僅在雞上有相關(guān)的研究報(bào)道，在其他動(dòng)物中尚未有相關(guān)研究。因此，本研究旨在研究不同水平銅源對(duì)奶牛生產(chǎn)性能、抗氧化能力和銅代謝的影響，以期為奶牛生產(chǎn)中選擇合理銅源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

硫酸銅CuSO4(具體物質(zhì)為五水硫酸銅 CuSO4·5H2O 含銅量為25%)，由揚(yáng)州大學(xué)試驗(yàn)農(nóng)牧場(chǎng)提供。賴氨酸銅和谷氨酸銅的1∶1絡(luò)合物(含銅量為17%)，由美國(guó)金寶公司提供，以下簡(jiǎn)稱LGC。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物和設(shè)計(jì)

本研究采用雙因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，包括2種銅源(硫酸銅、賴氨酸銅和谷氨酸銅的1∶1絡(luò)合物)，銅源的不同添加水平分別為0、3.5和7.0 mg/kg，2種銅源共用對(duì)照組，添加量均以銅元素計(jì)。選擇80頭胎次(1.7±1.0)、泌乳天數(shù)(92±24 d)和產(chǎn)奶量(34.16±2.48 kg)相近的健康荷斯坦奶牛，隨機(jī)分為5組，每組16頭。試驗(yàn)于2019年2—6月在揚(yáng)州大學(xué)試驗(yàn)農(nóng)牧場(chǎng)進(jìn)行，每日飼喂3次，自由飲水，預(yù)試期2周，正試期12周。基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.3 樣品采集與指標(biāo)測(cè)定

1.3.1飼料及糞便樣品

每2周稱量奶牛投料量及剩料量，同時(shí)采集飼料樣品用以測(cè)定常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分，計(jì)算奶牛的平均干物質(zhì)采食量(DMI)。試驗(yàn)期最后3 d每組選取8頭，采用全收糞法和收尿法進(jìn)行銅代謝試驗(yàn)。粗蛋白質(zhì)(CP)按GB/T 6432-1994的方法測(cè)定；鈣(Ca)按GB/T 6436-2002中乙二胺四乙酸二鈉絡(luò)合滴定法測(cè)定；磷(P)按GB/T 6437-2002鉬黃分光光度法測(cè)定；銅含量用Optima 7300 DV電感耦合等離子體光譜儀(PerkinElmer，美國(guó))按JY/T 015-1996的方法進(jìn)行測(cè)定。中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)根據(jù)Van Soest等[10]的方法，用ANKOM-2000I纖維分析儀(ANKOM，美國(guó))進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2產(chǎn)奶量及乳成分測(cè)定

每周測(cè)定奶牛日產(chǎn)奶量，計(jì)算奶牛的平均日產(chǎn)奶量。按“產(chǎn)奶量×(0.4+15×乳脂率)”計(jì)算4%標(biāo)準(zhǔn)乳(4% FCM)。測(cè)定產(chǎn)奶量當(dāng)天采集奶樣，早中晚按照4∶3∶3的比例共50 ml加入到裝有萬(wàn)分之六苯甲酸的奶樣管中充分搖勻。使用MILKO SCAN 605紅外線測(cè)奶儀(FOSS，丹麥)測(cè)定乳脂率、乳蛋白率、乳糖率和總固形物。

1.3.3血清抗氧化指標(biāo)測(cè)定

正試期第0、4、8和12周于晨飼后3 h，利用真空采血管在奶牛尾根部進(jìn)行尾靜脈采血，靜置 30 min 后3 000 r/min、4 ℃離心15 min，制備血清樣品于-80 ℃冰箱中保存。銅藍(lán)蛋白(CER)、總超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物還原酶(GSH-Px)參照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定，試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程公司。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)使用Excel 2016整理，使用SPSS 25.0中One-Way ANOVA程序?qū)?個(gè)組進(jìn)行單因素方差分析，使用SPSS 25.0中GLM程序進(jìn)行雙因素方差分析，采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著，0.05

2 結(jié)果與分析

2.1 不同水平銅源對(duì)奶牛生產(chǎn)性能的影響

由表2可知，對(duì)照組干物質(zhì)采食量顯著低于其余各試驗(yàn)組(P<0.05)，對(duì)照組產(chǎn)奶量有低于其余各試驗(yàn)組的趨勢(shì)(0.050.05)。銅水平對(duì)干物質(zhì)采食量和產(chǎn)奶量有顯著影響(P<0.05)，銅水平為3.5和7.0 mg/kg組干物質(zhì)采食量和產(chǎn)奶量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，銅水平對(duì)4%標(biāo)準(zhǔn)乳和飼料轉(zhuǎn)化率無(wú)顯著影響(P>0.05)。銅源對(duì)干物質(zhì)采食量、產(chǎn)奶量、4%標(biāo)準(zhǔn)乳和飼料轉(zhuǎn)化率無(wú)顯著影響(P>0.05)。各組間干物質(zhì)采食量、產(chǎn)奶量、4%標(biāo)準(zhǔn)乳和飼料轉(zhuǎn)化率無(wú)銅源和銅水平的交互作用(P>0.05)。此結(jié)果表明，相較于對(duì)照組，添加3.5和7.0 mg/kg的CuSO4或LGC均可提高奶牛的干物質(zhì)采食量和產(chǎn)奶量，但2種銅源對(duì)奶牛干物質(zhì)采食量和產(chǎn)奶量的影響較小。

表2 不同水平銅源對(duì)奶牛生產(chǎn)性能的影響

2.2 不同水平銅源對(duì)奶牛乳成分的影響

由表3可知，各組間乳脂率、乳蛋白率、乳糖率和總固形物差異不顯著(P>0.05)。銅水平對(duì)乳脂率有顯著影響(P<0.05)，銅水平為3.5和7.0 mg/kg組乳脂率顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，銅水平對(duì)乳蛋白率、乳糖率和總固形物無(wú)顯著影響(P>0.05)。銅源對(duì)乳脂率、乳蛋白率、乳糖率和總固形物無(wú)顯著影響(P>0.05)。各組間乳脂率、乳蛋白率、乳糖率和總固形物無(wú)銅源和銅水平的交互作用(P>0.05)。此結(jié)果表明，相較于對(duì)照組，添加3.5和 7.0 mg/kg 的CuSO4或LGC會(huì)降低奶牛乳脂率，不同水平銅源對(duì)奶牛乳蛋白率、乳糖率和總固形物的影響較小。

表3 不同水平銅源對(duì)奶牛乳成分的影響

2.3 不同水平銅源對(duì)奶?？寡趸芰Φ挠绊?/h3>

由表4可知，對(duì)照組CER活性顯著低于其余各試驗(yàn)組(P<0.05)，對(duì)照組SOD和GSH-Px活性顯著低于添加7.0 mg/kg的CuSO4和LGC組(P<0.05)。銅水平對(duì)CER、SOD和GSH-Px活性有顯著影響(P<0.05)，銅水平為3.5和7.0 mg/kg組CER活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，銅水平為7.0 mg/kg組CER和SOD活性顯著高于3.5 mg/kg組(P<0.05)，銅水平為7.0 mg/kg組GSH-Px活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。銅源對(duì)CER、SOD和GSH-Px活性無(wú)顯著影響(P>0.05)。各組間CER、SOD和GSH-Px活性無(wú)銅源和銅水平的交互作用(P>0.05)。此結(jié)果表明，隨著CuSO4和LGC添加量的提高，奶牛CER、SOD和GSH-Px活性也隨之提高，但2種銅源對(duì)奶牛CER、SOD和 GSH-Px 活性的影響較小。

表4 不同水平銅源對(duì)奶?？寡趸芰Φ挠绊?/p>

2.4 不同水平銅源對(duì)奶牛銅代謝的影響

由表5可知，對(duì)照組糞銅最低(P<0.05)，添加7.0 mg/kg的CuSO4組糞銅顯著高于添加7.0 mg/kg的LGC組，各組間尿銅無(wú)顯著差異(P>0.05)，添加7.0 mg/kg的LGC組銅沉積量和銅沉積率最高(P<0.05)。銅水平對(duì)銅采食量、糞銅、銅沉積量和沉積率有顯著影響(P<0.05)，銅水平為3.5 mg/kg組銅采食量、糞銅、銅沉積量和沉積率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，銅水平為7.0 mg/kg組銅采食量、糞銅、銅沉積量和銅沉積率顯著高于3.5 mg/kg組(P<0.05)，銅水平對(duì)尿銅無(wú)顯著影響(P>0.05)。銅源對(duì)糞銅、銅沉積量和銅沉積率有顯著影響(P<0.05)，LGC組糞銅顯著低于CuSO4組(P<0.05)，LGC組銅沉積量和銅沉積率顯著高于CuSO4組(P<0.05)。各組間銅采食量、糞銅和尿銅無(wú)銅源和銅水平的交互作用(P>0.05)，銅沉積量和銅沉積率各組間存在交互作用(P<0.05)。此結(jié)果表明，在相同水平銅添加量下，LGC組的銅沉積量和銅沉積率高于CuSO4組。

表5 不同水平銅源對(duì)奶牛銅代謝的影響

3 討 論

3.1 不同水平銅源對(duì)奶牛生產(chǎn)性能的影響

Hansen 等[11]在飼糧中添加不同水平CuSO4或甘氨酸銅(5和10 mg/kg)相較于未添加銅組可提高公牛的干物質(zhì)采食量(DMI)，但銅水平為5和 10 mg/kg 組間DMI的差異較小，這與本研究結(jié)果一致，補(bǔ)充銅可以提高反芻動(dòng)物瘤胃微生物對(duì)飼糧蛋白質(zhì)的利用效率和纖維降解能力，提高了干物質(zhì)消化率進(jìn)而提高了DMI[7]，但不同銅水平對(duì)DMI的影響較小。然而付輯光等[2]研究表明，飼料中添加銅對(duì)奶牛DMI影響較小，研究結(jié)果的差異性可能與奶牛品種、飼糧組成和奶牛對(duì)銅的缺乏程度有關(guān)。常新耀等[12]的研究表明，添加不同水平CuSO4(6、10和12 mg/kg)可以提高奶牛產(chǎn)奶量和4%標(biāo)準(zhǔn)乳(4% FCM)，并且產(chǎn)奶量和4% FCM與銅添加量呈正相關(guān)關(guān)系，補(bǔ)充銅可以促進(jìn)奶牛對(duì)飼糧中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的獲取從而提高產(chǎn)奶量和4% FCM，本研究中補(bǔ)充銅有提高產(chǎn)奶量的趨勢(shì)，略微提高了4% FCM，并且添加3.5和7.0 mg/kg銅水平間差異不顯著，這可能與較低銅添加量已經(jīng)達(dá)到生產(chǎn)需求有關(guān)。NRC(2001)規(guī)定體重為650 kg、產(chǎn)量為40 kg的奶牛銅需要量為15.6 mg/kg[13]。本研究中基礎(chǔ)飼糧銅含量為15.06 mg/kg，添加3.5 mg/kg銅后奶牛的產(chǎn)奶量進(jìn)一步提高，但添加7.0 mg/kg銅對(duì)產(chǎn)奶量的提升效果有限，付輯光等[2]研究同樣表明奶牛銅的需要量為18.09～23.09 mg/kg，并且更高添加量對(duì)提高產(chǎn)奶量的作用較小，說(shuō)明在奶牛生產(chǎn)中銅的實(shí)際需求量更高，但過(guò)多添加銅對(duì)提升奶牛的生產(chǎn)能力有限。Wang等[14]研究表明補(bǔ)充羥基蛋氨酸銅相較于CuSO4對(duì)奶牛DMI的影響較小，但有提高產(chǎn)奶量和4% FCM的趨勢(shì)，并推測(cè)羥基蛋氨酸銅相較于CuSO4有更高的利用率，尤其是在應(yīng)對(duì)環(huán)境不利的應(yīng)激狀況下效果更好，因而能夠提高產(chǎn)奶量和4% FCM。本研究中2種銅源對(duì)奶牛DMI、產(chǎn)奶量和4% FCM的影響較小，試驗(yàn)結(jié)果的差異性可能與試驗(yàn)過(guò)程中的環(huán)境因素和補(bǔ)充銅源均已達(dá)到奶牛生產(chǎn)需求有關(guān)。

3.2 不同水平銅源對(duì)奶牛乳成分的影響

乳脂率、乳蛋白率、乳糖率和總固形物是評(píng)價(jià)乳品質(zhì)的重要標(biāo)準(zhǔn)。常新耀等[12]添加不同水平CuSO4未發(fā)現(xiàn)對(duì)奶牛乳蛋白率和乳糖率造成顯著影響，本研究結(jié)果同樣表明補(bǔ)充不同水平銅對(duì)乳蛋白率和乳糖率的影響較小，說(shuō)明飼糧中添加銅不會(huì)改變?nèi)榈鞍缀腿樘呛?。Engle等[15]的研究表明飼糧添加CuSO4未改變奶牛乳脂率，但能夠降低C18∶1反式脂肪酸和C18共軛二烯酸的濃度。本研究中添加不同水平銅降低了乳脂率，試驗(yàn)結(jié)果的差異性可能與試驗(yàn)牛品種有關(guān)。有研究表明，產(chǎn)奶量與乳脂率具有顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系[16]，本研究中補(bǔ)充銅提高了產(chǎn)奶量從而使得乳脂含量有所下降。然而，補(bǔ)充銅是否會(huì)對(duì)乳中脂肪酸組成造成影響有待進(jìn)一步研究。付輯光等[2]研究表明銅水平對(duì)奶?？偣绦挝餆o(wú)影響，這與本研究結(jié)果一致。Wang等[14]研究表明添加羥基蛋氨酸銅相較于CuSO4未對(duì)奶牛乳脂率、乳蛋白率、乳糖率和總固形物造成顯著影響，這與本研究結(jié)果一致，說(shuō)明銅源對(duì)乳成分的影響較小。

3.3 不同水平銅源對(duì)奶?？寡趸芰Φ挠绊?/h3>

黃元龍等[17]研究表明飼糧添加CuSO4(10和25 mg/kg)可提高綿羊血清CER和SOD活性，并與銅添加量呈正相關(guān)關(guān)系，這與本研究結(jié)果一致，CER作為轉(zhuǎn)運(yùn)銅的重要蛋白其自身也需要銅來(lái)合成，也具備減少脂質(zhì)過(guò)氧化物生成的作用，SOD作為含銅酶可以催化超氧陰離子歧化為氧氣和過(guò)氧化氫，對(duì)于機(jī)體的氧化與抗氧化平衡具有重要作用，增加飼糧銅水平會(huì)使機(jī)體內(nèi)包括CER和SOD的含銅酶活性提高，從而提高反芻動(dòng)物的抗氧化能力。本研究中，補(bǔ)充銅可提高GSH-Px活性并與銅添加量呈正相關(guān)關(guān)系，這與前人的研究結(jié)果一致[2]，增加飼糧銅水平可提高SOD活性，減少超氧陰離子蓄積從而增強(qiáng)GSH-Px活性。程延彬[18]研究表明，蛋氨酸銅和CuSO4對(duì)提高奶牛CER和SOD活性的作用相同，本研究中LGC和CuSO4對(duì)提升奶?？寡趸芰o(wú)顯著差異，這表明在相同銅添加量的情況下，LGC對(duì)于提升奶?？寡趸芰Φ淖饔幂^小。

3.4 不同水平銅源對(duì)奶牛銅代謝的影響

本研究中，隨著銅采食量的提高，奶牛銅的排泄量增加，這與付輯光等[2]研究結(jié)果一致，奶牛對(duì)于銅的利用率較低，僅為5%～10%[5]，過(guò)多的添加銅很容易造成環(huán)境污染。有機(jī)銅可提高反芻動(dòng)物銅的生物利用度已經(jīng)得到試驗(yàn)證明，蛋氨酸銅在母羊中具有更高的腸道吸收能力和更低的銅排泄率，這是由于腸道中無(wú)機(jī)來(lái)源的礦物質(zhì)離子可能會(huì)與其他消化成分重組形成不溶性復(fù)合物，從而降低腸道吸收，而有機(jī)礦物質(zhì)則通過(guò)粘膜吸收氨基酸并將其完全吸收到血液中[19]，有機(jī)形態(tài)的銅也能夠避免與其他元素的拮抗作用，從而提高利用效率[20]。其他研究也報(bào)道了與CuSO4相比，有機(jī)銅排泄量較低[21-22]。本研究中LGC在奶牛體內(nèi)的銅沉積率要高于CuSO4，說(shuō)明奶牛對(duì)于LGC的吸收效率更高。

4 結(jié) 論

在基礎(chǔ)銅含量為15.06 mg/kg的飼糧中添加3.5和7.0 mg/kg的CuSO4或LGC均可提高奶牛的產(chǎn)奶量和抗氧化能力。LGC相較于CuSO4可提高奶牛的銅沉積率，減少糞銅排放量，從生產(chǎn)性能和環(huán)境保護(hù)綜合考慮，在奶牛飼糧中添加3.5 mg/kg的LGC效果最好，在保證生產(chǎn)需求的基礎(chǔ)上又能夠降低環(huán)境污染。