宋恭帥，趙巧靈，朱勤超，張曉頔，王萍亞，薛 靜，陳 康，王宏海，戴志遠，2，沈 清，2*

（1 浙江工商大學(xué)海洋食品研究院 杭州310012 2 浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點實驗室 杭州310012 3 舟山市食品藥品檢驗檢測研究院 浙江舟山316012）

中華鱉，俗稱甲魚，是一種珍貴的水產(chǎn)經(jīng)濟動物[1]，富含維生素、蛋白質(zhì)及人體所需的必要微量元素等，對心腦血管疾病有很好的防控作用[2]，是中國傳統(tǒng)的滋補佳品。近年來，由于甲魚養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，多種甲魚加工產(chǎn)品不斷面市，主要包括酒、膠囊等保健產(chǎn)品，冷凍及真空包裝的即食產(chǎn)品等[3]。隨著甲魚加工產(chǎn)品的多元化發(fā)展，大量甲魚內(nèi)臟等加工副產(chǎn)物被丟棄，造成了資源浪費及環(huán)境污染。甲魚油的開發(fā)對甲魚加工副產(chǎn)物的高值化利用具有重要意義。甲魚油中富含n-3 系多不飽和脂肪酸（n-3 PUFA），主要是EPA 和DHA，具有抗血小板凝聚、降血脂、延緩血栓形成等生理活性功能，是開發(fā)高級保健食品的優(yōu)質(zhì)原料[1-2]。粗制甲魚油中含有大量雜質(zhì)，包括游離脂肪酸（FFA）、磷脂、類固醇、脂溶色素、蛋白質(zhì)等，尤其是甲魚油中PUFA 氧化降解和非脂肪成分酸敗產(chǎn)生的腥臭味物質(zhì)，具有一定毒害作用[4-5]。油脂中的不良氣味成分易降低其生理活性功能及感官特性，從而嚴重影響產(chǎn)品品質(zhì)[6-7]。在甲魚油生產(chǎn)加工時，用一種高效檢測方法分析其揮發(fā)性成分變化具有重要意義。

揮發(fā)性成分分析技術(shù)主要包括成分收集與分析。目前，水產(chǎn)加工制品中揮發(fā)性成分的收集方法有動態(tài)頂空萃取法（DHE）[8]、超臨界流體萃取法（SFE）[9]、同時蒸餾萃取法（SDE）[10]等。這些方法普遍費時、費力，且不適合處理大批量樣品。相比之下，頂空固相微萃取法（HS-SPME）具有操作簡便、無溶劑、選擇性好、適用性強等特點，應(yīng)用更為廣泛[11]。然而，HS-SPME 仍存在一些問題，如萃取時間、萃取溫度的控制、萃取頭使用壽命等[12]。激光（Laser）是一種高質(zhì)量的光源，具有高亮度、高方向性、高單色性及高相干性等特性，被廣泛應(yīng)用于工業(yè)產(chǎn)生中[13]。Filik 等[14]利用激光拉曼光譜在波長514.5 nm 條件下分析含氫非晶碳膜構(gòu)造。Norris等[15]綜述了基質(zhì)輔助激光解吸/電離成像質(zhì)譜法研究生物和臨床組織標本。

本研究充分考慮了HS-SPME 的不足與激光輻照的優(yōu)點，旨在開發(fā)一種快速、高效的激光照射解吸（LID）方法，取代傳統(tǒng)的熱輔助解吸（HAD）方法，優(yōu)化工藝參數(shù)（激光照射功率、照射時間、樣品含量），以提高甲魚油揮發(fā)性化合物的釋放，并通過頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù) （HS-SPMEGC/MS）鑒定甲魚油中的揮發(fā)性成分。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲魚油，由浙江省水產(chǎn)質(zhì)量檢測中心提供。

1.2 儀器與設(shè)備

50/30 μm 二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（DVB/CAR/PDMS）涂層萃取頭，美國Supelco 公司；Trace GC Ultra 氣相色譜與DSQ Ⅱ質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Thermo Fisher Scientific 公司；二極管激光器，長春鐳仕光電科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 頂空固相微萃取條件 將老化好的50/30 μm DVB/CAR/PDMS 涂層萃取頭插入進樣瓶頂空部分，待吸附反應(yīng)結(jié)束，取出萃取頭并插入GC 進樣口，250 ℃解吸3 min。

1.3.1.1 激光照射解吸 利用二極管激光器對甲魚油樣品進行照射，其最長工作波長為450 nm，最大允許輸出功率為50 W。激光照射甲魚油的同時，萃取頭對揮發(fā)出來的物質(zhì)進行吸附。分別考察激光照射功率、照射時間、樣品含量這3 個單因素對甲魚油中主要揮發(fā)性成分萃取效果的影響。試驗過程如下：設(shè)置不同照射功率（6，8，10，12，14 W）、不同照射時間（3，4，5，6，7 min）和不同樣品添加量（2，3，4，5，6 g），并參照前期研究的關(guān)于魚油中主體揮發(fā)性成分[16]，以己醛、壬醛、1-戊烯-3-醇、庚醛和戊醛的峰面積作為評價指標。通過單因素試驗，確定各因素最佳值。

1.3.1.2 熱輔助解吸 參照Fratini 等[17]報道的關(guān)于熱輔助解吸結(jié)合頂空固相微萃取 （HAD-HSSPME）的方法，具體操作方法如下：稱取3 g 樣品置于15 mL 頂空進樣瓶中，并將老化好的萃取頭插入進樣瓶頂空部分，80 ℃下吸附30 min。

1.3.2 GC-MS 檢測條件 GC 條件：色譜柱為TR-35 MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣：高純氦氣；進樣口溫度250 ℃，不分流進樣；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min 升至90℃，再以10 ℃/min 升至230 ℃，保持7 min。

MS 條件：離子源溫度200 ℃；電子離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度250 ℃；檢測器溫度280 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 30～500。

1.3.3 化合物分析 通過NIST 2.0 譜庫做自動檢索確認分析，且僅當(dāng)正反匹配度（SI/RSI）均大于800 （最大值為1 000）的鑒定結(jié)果才予以保留。采用峰面積歸一化法求得各揮發(fā)性成分在樣品中的相對百分含量[18]。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 激光照射功率對甲魚油中揮發(fā)性成分萃取效果的影響 在激光照射過程中，照射功率的大小與被照物體表面溫度升高速率快慢密切相關(guān)。陳國星等[19]通過不同激光功率對不銹鋼表面清洗效果影響的研究，發(fā)現(xiàn)隨著功率的增大，激光清洗效果明顯提高。如圖1所示，壬醛、己醛、庚醛、1-戊烯-3-醇、戊醛的峰面積均隨照射功率的升高先增大而后減小，其中以壬醛的變化趨勢最為顯著。在油脂中，醛類化合物是不良風(fēng)味的重要組成成分，主要來自不飽和脂肪酸的氧化降解，且醛類的感覺閾值一般很低，對整體風(fēng)味貢獻大[20]。當(dāng)功率為10 W 時，5 種主要揮發(fā)性成分的峰面積最大，說明該功率下，萃取效果最佳；當(dāng)激光功率過低時，甲魚油中的揮發(fā)性成分不能完全揮發(fā)出來；當(dāng)功率過高時，導(dǎo)致油表面溫度過高，致使脂肪酸發(fā)生氧化酸敗從而產(chǎn)生新的揮發(fā)性物質(zhì)。故最佳照射功率為10 W。

圖1 照射功率對揮發(fā)性成分萃取率的影響Fig.1 The effect of laser power on the extraction efficiency of the selected characteristic compounds

2.1.2 激光照射時間對甲魚油中揮發(fā)性成分萃取效果的影響 在相同激光功率條件下，照射時間越長，樣品吸收能量越多，溫度變化越大。李士斌等[21]研究了激光照射時長對激光破巖的影響，結(jié)果表明，在保證其它試驗參數(shù)不變的前提下，鉆孔深度和孔直徑隨照射時長的增加而逐漸增加。由圖2可知，在3～5 min 內(nèi)5 種特征揮發(fā)性成分的峰面積均隨時間延長而增大，5 min 時各物質(zhì)峰面積達到最大值。當(dāng)照射時間超過5 min 時，各物質(zhì)的峰面積均逐漸減小，這可能是由于甲魚油表面溫度過高，使部分油脂被氧化而發(fā)生異構(gòu)化等原因所致。因此，最佳照射時間為5 min。

2.1.3 樣品添加量對甲魚油中揮發(fā)性成分萃取效果的影響 在相同激光功率和照射時間下，樣品添加量越大，溫度升高越慢，揮發(fā)性成分逸出速率越小。由圖3可知，己醛、庚醛、1-戊烯-3-醇、壬醛的峰面積受添加量影響較大，樣品添加量為2～3 g 時，這4 種揮發(fā)性成分的峰面積均隨添加量增大而逐漸變大；當(dāng)添加量為3 g 時，峰面積均達到最大值，之后峰面積逐漸變小。而戊醛的峰面積則幾乎沒什么變化，主要原因是戊醛在甲魚油中的含量本身就很低。故選擇3 g 為最佳樣品添加量。

2.2 甲魚油中揮發(fā)性成分測定

采用LID-HS-SPME-GC/MS，在最優(yōu)操作參數(shù)條件下，即激光功率10 W、照射時間5 min、樣品添加量3 g，測定甲魚油中揮發(fā)性成分，結(jié)果如表1所示。甲魚油中共鑒定出53 種揮發(fā)性物質(zhì)，包括醛類11 種、醇類10 種、酮類11 種、烴類16種及其它類5 種。揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量與樣品整體風(fēng)味特征之間無直接關(guān)系，其對整體風(fēng)味的貢獻是由其在風(fēng)味體系中的濃度和感覺閾值共同決定[25]。

圖2 照射時間對揮發(fā)性成分萃取率的影響Fig.2 The effect of irradiation time on the extraction efficiency of the selected characteristic compounds

圖3 樣品添加量對揮發(fā)性成分萃取率的影響Fig.3 The effect of sample volume on the extraction efficiency of the selected characteristic compounds

在油脂中，醛類化合物具有脂肪味、魚腥味、青草味等，主要來自脂質(zhì)氧化降解。一般地，醛類的感覺閾值比其它化合物低，且具有氣味加和作用，微量存在時也會對整體風(fēng)味產(chǎn)生較大的影響[26]。甲魚油中含有10 種脂肪醛（己醛、戊醛、（E）-2-己烯醛、壬醛、庚醛、（E，E）-2，4-庚二烯醛、辛醛、癸醛、1-十二碳烯-3-醛、2-乙基丁烯醛）及1種芳香醛（對甲基苯甲醛），這些物質(zhì)可能是由于不飽和脂肪酸氧化降解后所形成的過氧化物的裂解產(chǎn)生的，其中，己醛的含量最高（1.36%）。己醛是亞油酸氧化酸敗的重要特征產(chǎn)物，具有魚腥味、青草味，且感官閾值低，僅為4.5 μg/kg[27]；壬醛含量次之（0.83%），其是油酸的氧化產(chǎn)物，具有脂肪味、魚腥味，其閾值為1 μg/kg。己醛、壬醛含量越高，甲魚油魚腥味越強烈。

表1 不同提取方法制備甲魚油樣品中揮發(fā)性成分變化Table 1 Volatile flavor profiles of turtle oil extracted with different methods

醇類化合物主要是由醛類、糖類及氨基酸的氧化還原而產(chǎn)生，也可是源于脂肪酸二級氫過氧化物的降解或羰基化合物還原[28]。醇類可分為飽和與不飽和醇類，因不飽和醇類的感覺閾值更低，其對整體風(fēng)味的貢獻更大[29]。1-戊烯-3-醇是亞油酸的氫過氧化物降解產(chǎn)生，是主要的不飽和醇類化合物，具有魚腥味等特征風(fēng)味[24]。甲魚油中1-戊烯-3-醇含量為1.23%，且閾值為400 μg/kg，對整體風(fēng)味具有一定貢獻。

酮類化合物的產(chǎn)生機制與醛、醇類化合物類似，主要通過油脂中氫過氧化物熱氧化降解產(chǎn)生[30]。甲魚油中酮類化合物總含量占比最少，但其感覺閾值較低，對魚油整體風(fēng)味的影響仍較大。在檢測到的化合物中，2-壬酮、2-十一酮、2-癸酮、2-辛酮和2-庚酮的感覺閾值，分別為5.5，7，35，50.3及140 μg/kg，其中，2-辛酮的含量最高，為0.19%，對甲魚油整體風(fēng)味的貢獻更大。此外，這些酮類化合物具有脂香味、水果味、花香味等。

烴類化合物是甲魚油中含量最高的揮發(fā)性物質(zhì)，占64.98%，其主要是由于脂肪酸烷基自由基的均裂產(chǎn)生。各種烴類（C8-C20）的感覺閾值通常較高，對魚油整體風(fēng)味幾乎沒有作用。另外，部分揮發(fā)性小分子含氧雜環(huán)化合物，如2，5-二甲基呋喃、環(huán)氧柏木烷可能對整體風(fēng)味有輔助作用。2，5-二甲基呋喃具有溫和的豆香味，而環(huán)氧柏木烷具有甘甜木香[31]。

（續(xù)表1）

2.3 LID 與HAD 方法對比

為了評價LID-HS-SPME-GC/MS 的萃取性能，與傳統(tǒng)的HAD-HS-SPME-GC/MS 進行對比。HAD-HS-SPME-GC/MS 的操作參數(shù)如下：加熱溫度80 ℃、萃取時間30 min、樣品添加量3 g。經(jīng)由LID 和HAD 作用后甲魚油中揮發(fā)性成分的總離子流圖如圖1所示，將各個色譜峰所對應(yīng)的質(zhì)譜在NIST 圖庫進行檢索并結(jié)合參考文獻，確定甲魚油中揮發(fā)性成分的種類，再采用面積歸一化法計算出每一種成分在樣品中的相對含量，結(jié)果如表1所示。

由圖4可知，經(jīng)LID 處理后峰數(shù)多于HAD，且峰強度更大。從表1可知，在LID 作用下，甲魚油中共檢測到53 種揮發(fā)性化合物；而經(jīng)由HAD處理后，則檢測到50 種化合物。2，6，7-三甲基癸烷、十四烷、肉豆蔻酸異丙酯未檢出，從總離子流圖中可以看出，該3 種物質(zhì)的出峰時間主要集中在36.71～39.65 min。此外，甲魚油中重要的揮發(fā)性成分，包括壬醛、己醛、庚醛、1-戊烯-3-醇、己醇、2-壬酮、2-癸酮、2-辛酮等在2 種方法作用下均有檢測到，但經(jīng)LID 處理后的樣品中各物質(zhì)的相對含量均高于被HAD 處理的樣品。

對比結(jié)果表明，由2 種方法處理后，甲魚油中的揮發(fā)性成分均能被有效地檢測到。但是LID 的萃取效果明顯優(yōu)于HAD，原因在于該方法作用下，甲魚油中檢出的揮發(fā)性物質(zhì)種類更多、相對含量更高，且操作時間更短，僅需5 min，而HAD 則需30 min。這說明具有高能量、高密集度、低發(fā)散性等優(yōu)點的激光能有效地在短時間內(nèi)加速甲魚油中揮發(fā)性物質(zhì)的揮發(fā)。

圖4 激光解吸法（a）與熱輔助解吸法（b）作用下甲魚油揮發(fā)性成分總離子流圖Fig.4 The gas chromatograms of volatiles of turtle oil obtained by techniques of LID （a）and HAD （b）

2.4 激光照射作用機理

激光對甲魚油照射過程中，甲魚油表面吸收大量激光能量。由于激光的瞬時熱效應(yīng)，使甲魚油中所含的揮發(fā)性成分受熱向外膨脹，相當(dāng)于給揮發(fā)性成分粒子一個向上的牽引力，當(dāng)牽引力足夠大時，揮發(fā)性成分粒子就逸出油面，聚集在頂空瓶上端，再通過萃取頭吸附。在一定范圍內(nèi)，激光照射功率越大，油表面溫度升高越快，揮發(fā)性成分揮發(fā)速率越快，從而使萃取效果越好，揮發(fā)性成分含量也就越高。

2.5 方法可行性驗證

為驗證LID-HS-SPME-GC/MS 方法的可行性，主要從靈敏度、精密度、回收率等方面進行評價。靈敏度評價包括檢出限和定量限的測定，檢測限是指在規(guī)定的試驗條件下，分析方法所能檢出樣品中被測組分的最低濃度；定量限是指分析方法可定量測定樣品中待測組分的最低濃度[32]。精密度測定就是在相同檢測條件下做重復(fù)試驗，并用相對標準偏差表示，相對標準偏差（RSD，%）=標準偏差/被測組分含量的算術(shù)平均值×100，一般測定日內(nèi)精密度和日間精密度?；厥章士捎糜谂袛嘣摲椒ǖ臏蚀_度。

采用己醛、壬醛、1-戊烯-3-醇、庚醛、己醛、2-十一酮、戊醛、2-辛酮這8 種甲魚油中特征風(fēng)味化合物作為該分析方法可行性驗證指標，結(jié)果如表2所示。由表2可知，該分析方法的檢出限和定量限分別為0.13～0.71 ng/g，0.41～1.86 ng/g，這說明該方法有良好的靈敏度。測定日內(nèi)與日間精密度時，設(shè)置3 個濃度水平，每個水平檢測6 次[33]。甲魚油中所有特征化合物的日內(nèi)精密度的RSD 均低于14.11%，而日間精密度的RSD 在6.97%～13.64%。一般分析方法精密度的RSD ＜20%，則表明該方法精密度良好[34]。此外，各揮發(fā)性物質(zhì)的回收率在95.6%～104.0%。該結(jié)果驗證了LID-HS-SPMEGC/MS 方法是靈敏、精密和高效的，且在甲魚油中揮發(fā)性成分快速分析方面具有良好的性能。

表2 從檢出限、定量限、精密度及回收率評價LID-HS-SPME-GC/MS 方法的可行性Table 2 Method validation of LID-HS-SPME-GC/MS device in terms of detection and quantification limits，accuracy and recovery

3 結(jié)論

LID-HS-SPME-GC/MS 分析方法具有良好的靈敏度、精密度及回收率，且在分析鑒定甲魚油中揮發(fā)性成分時具有高效性。與傳統(tǒng)的加熱輔助頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用 （HAD-HS-SPME-GC/MS）相比，LID-HS-SPME-GC/MS 能在更短的萃取時間內(nèi)檢測到更多揮發(fā)性物質(zhì)，且含量更高。說明該方法可用于甲魚油中揮發(fā)性成分的快速且全面的檢測分析。之后，本課題組將進一步優(yōu)化該新型、高效的分析方法，并應(yīng)用到其它液體樣品的揮發(fā)性成分分析中。