孟燕華，閆倩倩，賀 婷，張永杰

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 太原030006）

蛋糕通常是以蛋、糖、面粉和/或油脂為主要原料，經(jīng)調(diào)制成面糊，澆入模盤，焙烤后制成的一種組織松軟的糕狀制品[1]。蛋糕含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，水分和蛋白質(zhì)含量較高，使得蛋糕的保存期較短，容易腐敗變質(zhì)。導(dǎo)致蛋糕腐敗變質(zhì)的主要因素是微生物污染，包括細(xì)菌、酵母菌、霉菌等。近年來，多地都有蛋糕食品微生物超標(biāo)的相關(guān)報道[2-6]。

蛋糕微生物的污染源可能是工人、原材料、環(huán)境、包裝等[7]。蛋糕微生物在條件適宜時開始生長繁殖，隨著微生物種類和數(shù)量的劇增，蛋糕就會發(fā)生惡變，表現(xiàn)為糖類、脂肪分解，蛋白質(zhì)變質(zhì)，產(chǎn)生臭味等。微生物過量生長除導(dǎo)致蛋糕變質(zhì)外，有些微生物還會產(chǎn)生毒素，一旦進(jìn)入人體，會對人體健康造成危害[8]。特別是蛋糕被真菌污染后，真菌在蛋糕上形成明顯的菌落（即霉斑），直接導(dǎo)致蛋糕失去商業(yè)價值。研究引起蛋糕變質(zhì)的微生物種類，對于在蛋糕加工和存放過程中采取合理的防控措施，以及保障消費(fèi)者的身體健康具有重要的意義。目前關(guān)于蛋糕微生物的研究報道絕大多數(shù)都是對微生物數(shù)量的檢測[6]，而對具體微生物種類（尤其是真菌）的關(guān)注較少。

真菌廣泛分布于各種自然和人為環(huán)境中，其物種數(shù)非常豐富，據(jù)估計至少有150 萬種，被描述過的約11 萬種[9]。為了準(zhǔn)確鑒別不同的物種，近年來國際上提出了DNA 條形碼計劃，并推薦細(xì)胞核核糖體DNA 中的ITS 序列作為真菌首要的DNA條形碼[10]。本文以引起某品牌蛋糕發(fā)霉變質(zhì)的真菌為研究對象，分析蛋糕污染真菌的種類，評價ITS 條形碼用于蛋糕污染真菌鑒定的可行性；分析是否存在潛在的致病菌。通過確定引起蛋糕發(fā)霉變質(zhì)的真菌種類，指導(dǎo)蛋糕的合理加工與儲存，保障消費(fèi)者的食用安全。

1 材料與方法

1.1 材料

某品牌4 種不同風(fēng)味的蛋糕（以A，B，C，D 表示不同的風(fēng)味），每種風(fēng)味各2～3 份樣品（以“字母+數(shù)字” 表示每種風(fēng)味的不同樣品，如A1，A2，A3），共11 份樣品（圖1）。這些樣品是山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院某退休教師發(fā)現(xiàn)家中購買的蛋糕霉變后送來的，送到實(shí)驗(yàn)室時剛過保質(zhì)期1 d（蛋糕正常的保質(zhì)期為3～4 d），但能看到蛋糕表面真菌生長形成的菌落（圖1）。

圖1 研究使用的蛋糕樣品Fig.1 Cake samples used in this study

1.2 儀器與設(shè)備

T100 PCR 儀，美國BIO-RAD 公司；Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)，美國BIO-RAD 公司。

1.3 方法

1.3.1 真菌菌株的分離與培養(yǎng) 以添加鏈霉素和四環(huán)素的PDA 培養(yǎng)基（即馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）作為分離真菌菌株的培養(yǎng)基。在無菌工作臺中，用接種針從蛋糕上可見的真菌菌落上挑取少許菌絲到PDA 平板上，置20 ℃黑暗條件下培養(yǎng)，待菌落長大后，從菌落邊緣挑取菌絲轉(zhuǎn)接到PDA斜面保藏。

1.3.2 真菌菌株的鑒定與分析 將分離獲得的真菌菌株接種到鋪有滅菌玻璃紙的PDA 培養(yǎng)基表面，經(jīng)培養(yǎng)后收集菌絲體，用十六烷基三甲基溴化銨法 （cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）提取基因組DNA[11]。以提取的DNA 為模板，使用引物ITS5 和ITS4 擴(kuò)增ITS 序列[12]。擴(kuò)增產(chǎn)物由金唯智生物科技有限公司（天津，中國）進(jìn)行Sanger測序。得到測序結(jié)果后，用FinchTV 軟件查看測序峰圖（http：//downloads.informer.com/finchtv/），去掉引物及測序質(zhì)量較差的端部序列后留下的序列進(jìn)行后續(xù)分析。首先，利用DNAMAN 軟件對所有菌株的ITS 序列進(jìn)行比對，以97%的相似性閾值歸并成不同的可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）。然后，對各個OTU 選擇1 個代表序列在BOLD（http：//www.barcodinglife.org/index.php/IDS_OpenIdEngine）和GenBank（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性搜索，以此來確定各OTU 可能代表的真菌種類。此外，對找出的各個OTU 的代表序列在ISHAM 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行搜索（http：//its.mycologylab.org/），分析是否代表潛在的致病性真菌。最后，利用鄰接法和K2P 模型，利用MEGA 軟件對各個OTU 的代表序列及BOLD/GenBank 數(shù)據(jù)庫中的相近序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進(jìn)行1 000 次重復(fù)的自展檢驗(yàn)[13]。

1.3.3 真菌菌株回接試驗(yàn) 先將每一OTU 的代表菌株培養(yǎng)在PDA 平板中，然后從菌落邊緣切取菌塊，接種到購買的相同企業(yè)當(dāng)日生產(chǎn)的（A）香醇芝士蛋糕（原味）和（C）切塊夾心蛋糕上，分別置于4，20 和30 ℃培養(yǎng)，3 d 后觀察真菌的生長情況。以不接真菌的蛋糕為空白對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離

本研究從11 份蛋糕樣品上共分離到34 株真菌分離物。其中，從每份蛋糕樣品上分離到1～5 個真菌菌株，從每種風(fēng)味的蛋糕（各2～3 份樣品）上共得到5～12 個真菌菌株（表1，圖2）。

表1 不同風(fēng)味蛋糕中分離的真菌菌株數(shù)和物種數(shù)Table 1 Number of isolates and OTUs of fungi isolated from cakes

圖2 代表性真菌分離物的菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of representative fungal isolates

2.2 菌株鑒定

從所有34 株真菌分離物中擴(kuò)增ITS 序列，以97%的相似性閾值鑒別出9 種不同的真菌（表1，表2），全部為子囊菌，與公共數(shù)據(jù)庫中已知序列的相似性都超過了99%。在這9 種真菌中，枝孢屬（Cladosporium）有3 種（OTU1-3）；脈孢菌屬（Neurospora）有1 種（OTU4）；青霉屬（Penicillium）有2種（即OTU5-6）；曲霉屬（Aspergillus）有1 種（即OTU7）；鏈格孢屬（Alternaria）有1 種（即OTU8）；1種 （OTU9）為魯氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）。在這9 種OTU 中，OTU1 為優(yōu)勢種類（占總菌株數(shù)的44%），且在各種風(fēng)味的蛋糕中均分離到；OTU3，4，5 各自在至少2 種不同風(fēng)味的蛋糕中分離到，而其它OTU 只從1 種風(fēng)味的蛋糕中分離到（表1）。從每種風(fēng)味的蛋糕中共分離到2～6 種真菌不等（表1）。

表2 各OTU 所包含的菌株數(shù)及物種鑒定結(jié)果Table 2 Number of cultures and identification of each OTU

2.3 系統(tǒng)發(fā)育和潛在致病性分析

利用各OTU 的代表序列及公共數(shù)據(jù)庫中的相近序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，支持前面物種劃分的結(jié)果，即存在9 種不同的OTU，且每一分支都有較高的支持度 （圖3）。這些OTU 的代表序列在ISHAM 條形碼數(shù)據(jù)庫中都能找到相似性很高的序列（＞98%），暗示這些菌株具有潛在的致病性（表3）。

圖3 基于ITS 序列的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.3 Phylogeny constructed using ITS sequences

2.4 菌株回接試驗(yàn)

將前面檢測到的9 種真菌接種在香醇芝士蛋糕（原味）和切塊夾心蛋糕上進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果顯示，除OTU9 因生長慢而未觀察到生長外，其它真菌均能在這兩種蛋糕上生長（圖4）。多數(shù)真菌在20℃和30 ℃培養(yǎng)3 d 后，可在蛋糕上形成明顯的菌落，而在4 ℃培養(yǎng)時未能將菌落擴(kuò)展到蛋糕上。OTU7 在30 ℃培養(yǎng)時，產(chǎn)生的孢子會四處分散生長。值得注意的是，2 種蛋糕的空白對照在20 ℃和30 ℃放置3 d 也觀察到有真菌菌落形成，其中的真菌可能來源于蛋糕自身攜帶或包裝材料污染。另外，我們還發(fā)現(xiàn)切塊夾心蛋糕在30 ℃放置3 d，會呈現(xiàn)水漬狀并略有塌陷。

表3 各OTU 在ISHAM 數(shù)據(jù)庫中搜索的結(jié)果Table 3 Results of searching each OTU against the ISHAM Barcoding Database

3 結(jié)論與討論

蛋糕因水分活度高、易受微生物污染而變質(zhì)。本文調(diào)查了引起某品牌蛋糕變質(zhì)的真菌，共得到34 株真菌分離物。利用真菌通用DNA 條形碼ITS序列對這些菌株進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)9 種不同的OTU，包括枝孢屬、脈孢菌屬、青霉屬、曲霉屬、鏈格孢屬和魯氏接合酵母等。何艷霞等[14]在對蒸蛋糕的微生物菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究時，也發(fā)現(xiàn)了枝孢屬、青霉屬、曲霉屬和鏈格孢屬的物種。然而，本研究檢測到的這些真菌屬大都包含一些親緣關(guān)系較近的物種，難以通過ITS 序列進(jìn)行區(qū)分，需要使用其它DNA 片段或通過多個基因片段的聯(lián)合分析，才能準(zhǔn)確鑒定到種。例如，對于枝孢屬，ITS 在不同物種間的分辨率較低，推薦使用肌動蛋白act 和翻譯延長因子tef1 的聯(lián)合分析[15]；曲霉屬除ITS 外，還被推薦使用鈣調(diào)蛋白基因CaM[16]；青霉屬還可使用線粒體CO1 基因[17]。因此，若要將本文所得的真菌菌株準(zhǔn)確鑒定到種，尚需對其它基因片段進(jìn)行擴(kuò)增分析，必要時還要結(jié)合形態(tài)特征觀察的結(jié)果進(jìn)行綜合判斷。除真菌外，我們從研究使用的蛋糕上還分離到8 株細(xì)菌，其中1 株被鑒定到芽孢桿菌屬（Bacillus）。

圖4 真菌菌株回接試驗(yàn)Fig.4 Inoculating fungal isolates back to cakes

蛋糕上這些真菌的來源應(yīng)該至少存在以下2種可能。一種可能是蛋糕本身攜帶真菌。在蛋糕加工過程中，自身攜帶的一些真菌孢子仍具有活力，條件適宜時利用蛋糕的營養(yǎng)進(jìn)行萌發(fā)、生長。另一種可能是來自各種外界環(huán)境，如物流配送環(huán)節(jié)、零售店鋪的室內(nèi)環(huán)境、消費(fèi)者的貯存環(huán)境等都可能造成霉菌污染。實(shí)際上，本研究發(fā)現(xiàn)的許多真菌屬（如枝孢屬、青霉屬、曲霉屬、鏈格孢屬）都是空氣中的常見真菌[18]。因此，空氣微生物造成蛋糕污染的可能性很大。然而，在回接試驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)買回的蛋糕即使在未拆封包裝盒的情況下，在20 ℃和30 ℃放置3 d 后也可能長出霉菌斑 （圖4），這又支持了第1 種假設(shè)。

通過搜索人體和動物病原真菌數(shù)據(jù)庫ISHAM，我們發(fā)現(xiàn)這些污染蛋糕的真菌可能對人體具有潛在的致病性。因此，發(fā)霉的蛋糕不但不能再食用，還應(yīng)在丟棄時進(jìn)行無害化處理（如通過高溫處理滅活真菌）。另外，本研究發(fā)現(xiàn)的多數(shù)真菌屬（如青霉屬、曲霉屬、鏈格孢屬）包含許多產(chǎn)毒素的物種[19]，因此，從蛋糕上分離到的這些真菌也有可能產(chǎn)生毒素，從而可能引起食物中毒。目前已有多起因食用污染微生物的蛋糕引起的食物中毒事件，雖然都是由細(xì)菌污染引起[8，20-21]。也有研究顯示污染蛋糕的真菌能夠產(chǎn)生毒素[22]，但真菌毒素的產(chǎn)生受多種因素的影響，本研究分離到的真菌菌株是否產(chǎn)毒素仍有待驗(yàn)證。