隋 悅，紀(jì)曉林，孫一含，喬昕昱，奚 倩，董秀芳，啟 航*

（1 大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 遼寧大連116034 2 國家海洋食品工程技術(shù)研究中心 遼寧大連116034 3 塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 新疆阿拉爾843300）

脂質(zhì)氧化是脂質(zhì)及含油食品敗壞的主要原因之一。脂質(zhì)在儲藏期間，因空氣中的氧氣、光照、微生物和酶的作用，產(chǎn)生一些有毒的化合物[1]，這些化合物會對食用油脂的風(fēng)味、色澤以及組織產(chǎn)生不良的影響，以至于縮短貨架期，降低油脂的營養(yǎng)品質(zhì)，而且在酸敗過程中產(chǎn)生對人體有害的過氧化物和自由基，可導(dǎo)致機(jī)體衰老，引發(fā)腫瘤、心血管病等各種病癥[2-3]。選擇功能性脂質(zhì)抗氧化劑對于保持食品品質(zhì)具有實(shí)際意義。

巖藻黃質(zhì)是一類脂溶性色素，廣泛存在于具有光合作用的藻類、海洋浮游植物、水生貝殼類等動植物組織內(nèi)，而藻類中巖藻黃質(zhì)廣泛分布于褐藻綱、金藻綱、硅藻綱中，在紅藻綱以及甲藻綱中只含少部分的種類[4]。在褐藻中巖藻黃質(zhì)的含量比胡蘿卜素和葉黃素的總量之和還要高。國內(nèi)外對于巖藻黃質(zhì)活性已有大量研究，巖藻黃質(zhì)具有抗肥胖活性、抗炎活性、抗腫瘤活性、調(diào)節(jié)血糖量、抗氧化活性等功效[5-8]，是海洋資源中豐富存在的天然抗氧化劑。

電子自旋共振（electron spin resonance，ESR）又稱電子順磁共振，是在磁場中測量未成對的電子[9]，可以探測和識別具有未成對電子的分子，是檢測自由基最直接、有效的方法[10]，其檢測靈敏度高，樣品消耗量小，效率較高。近年來ESR 技術(shù)被逐漸應(yīng)用到食品行業(yè)的質(zhì)量控制和檢測。2016年Qi 等[11-12]用ESR 技術(shù)檢測UVA 照射下海參刺參體壁勻漿中的ROS 和海參刺參自溶。2017年，李楠等[13]使用ESR 技術(shù)研究水產(chǎn)品加工過程中的氧化物質(zhì)生成及抗氧化劑與其相互作用的關(guān)系。2018年，馮丁丁等[14]使用ESR 技術(shù)研究海參熱加工過程中的氧化物質(zhì)。董秀芳等[15]使用ESR 技術(shù)研究4 種天然提取物在即食海參殺菌工藝中的作用。

本研究以魚油與豬油為模型檢測巖藻黃質(zhì)的抗氧化活性，采用ESR 檢測技術(shù)研究巖藻黃質(zhì)對魚油、玉米油、亞油酸、亞油酸鹽的自由基清除活性的影響，為解決食品中脂質(zhì)氧化提供了新的天然抗氧化劑。對于利用ESR 技術(shù)手段開發(fā)海洋來源的天然抗氧化劑，具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

巖藻黃質(zhì)（50%，褐藻來源），美侖生物有限公司；脂肪酶（30 000 U/mg）、4-硝基苯基月桂酸酯（98%），北京百靈威科技有限公司；亞油酸鈉（95%）、亞油酸、魚油，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；玉米油，上海西隴生化科技有限公司；α-（4-吡啶基-N-氧化物）-N-叔丁基硝酮（POBN），TCI（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；Triton X-100，西格瑪奧德里奇公司。其它試劑均為國產(chǎn)分析純級。

1.2 設(shè)備與儀器

臺式冷凍離心機(jī) （Sorvall Legend Micro17R型），Thermo Scientific；電子順磁共振波譜儀（ESR）（A200），德國Bruker Opertics；數(shù)顯勻漿機(jī)（T25），德國IKA 公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-4型），常州智博瑞儀器制造有限公司；超低溫冰箱（MDF-U53V），SANYO 公司；立式壓力蒸汽滅菌器（YXQ-LS-50SII），上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；漩渦混合器（Ms1），上海精科實(shí)業(yè)有限公司；干浴器（DRY BLOCK HEATER 2），德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理 采用甲醇溶液，在40 ℃下將50%純度的巖藻黃質(zhì)粉末提取2 h，離心后收集上清液-30 ℃貯藏備用。根據(jù)HPLC 法鑒定，提取液中巖藻黃質(zhì)的純度達(dá)到90%以上。

1.3.2 巖藻黃質(zhì)對魚油氧化模型的抗氧化作用取80 μL 魚油于1.5 mL EP 管中并向其中添加20 μL 含有巖藻黃質(zhì)的甲醇溶液，巖藻黃質(zhì)在魚油中終質(zhì)量濃度為4 mg/mL，二者充分振蕩混合均勻。將空白組和試驗(yàn)組一同放入恒溫振蕩水域鍋中，150 r/min，在50 ℃溫度下，使用恒溫振蕩器加熱不同的時(shí)間（0，3，6，9 h），加熱過程中保持150 r/min 轉(zhuǎn)速。每組試驗(yàn)進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)。采用傳統(tǒng)的TBARS 試驗(yàn)方法對魚油氧化產(chǎn)生的氧化物進(jìn)行定量。將15%三氯乙酸以及0.375%硫代巴比妥酸溶于0.25 mol/L 鹽酸溶液中。取1 mL 上述溶液添加到氧化后的魚油中渦旋振蕩，隨后在80 ℃的水浴中加熱15 min，在冰浴中冷卻到室溫，并在532 nm 下測定粉色色素原溶液吸光值。

1.3.3 巖藻黃質(zhì)對豬油氧化模型的抗氧化作用參照Wettasinghe 等[16]的方法，并稍作修改。取100 g 五花肉，并向其中添加20%去離子水，再向其中添加甲醇溶解的提取物巖藻黃質(zhì)，使其質(zhì)量濃度為0.003 mg/mL，作為試驗(yàn)組，空白組直接加入甲醇即可。隨后將其勻漿。將勻漿液至于80 ℃水浴中，加熱40 min，每隔5 min 攪拌一次。將加熱攪拌后的勻漿液置于4 ℃層析柜中，在第0，10，20天時(shí)采用硫代巴比妥酸法進(jìn)行MDA 檢測。

硫代巴比妥酸法：在第0，10，20 天時(shí)取2 g肉加入5 mL 10% TCA 溶液高速劇烈振蕩2 min，隨后加入5 mL 0.02 mol/L 的TBA 水溶液，再高速劇烈振蕩30 s。將上述體系進(jìn)行離心（3 000×g，10 min），將上清夜采用Waterman No.3 進(jìn)行過濾，將過濾后的上清液至于沸水中45 min 后，在532 nm 下測量吸光值。

1.3.4 基于ESR 技術(shù)研究巖藻黃質(zhì)對4 種油脂氧化模型的自由基清除作用

1.3.4.1 巖藻黃質(zhì)對魚油及玉米油氧化模型的自由基清除作用 檢測脂質(zhì)氧化初期所產(chǎn)生的脂質(zhì)自由基采用由Velasco 等[17]描述的電子自旋共振波譜技術(shù)。取1 mL 魚油或玉米油于2 mL EP 管中，向上述EP 管中加入含有POBN 的甲醇溶液并使體系內(nèi)POBN 終濃度為（1.00±0.05）mmol/L，POBN 為一種典型的脂類自由基捕獲劑，又稱叔丁基氮酮。再向EP 管中添加不同濃度的巖藻黃質(zhì)使其在體系中的終質(zhì)量濃度為10，50，100，200，300 ng/mL 以及BHT（陽性對照），同時(shí)向空白中添加等體積的甲醇。將EP 管置于80 ℃水浴鍋中，在第1，2，3 小時(shí)采用ESR 對脂質(zhì)自由基清除情況進(jìn)行考察。采用毛細(xì)管吸取約80 μL 樣品溶液，并采用凡士林將管底封住，放入石英玻璃管中隨后放入ESR 諧振腔內(nèi)進(jìn)行檢測。ESR 檢測條件：微波功率1.79 mW，掃描寬度80 Gauss，調(diào)制頻率100 kHz，調(diào)制幅度1.0 Gauss，轉(zhuǎn)換時(shí)間240 ms，時(shí)間常量65.36 ms。波譜圖中首個(gè)出現(xiàn)峰的峰高與峰谷的距離代表了POBN 與自由基加和產(chǎn)物的量。峰高與峰谷差值越大則產(chǎn)生自由基的量越大，反之亦然。

1.3.4.2 巖藻黃質(zhì)對亞油酸氧化模型的自由基清除作用 取450 μL 去離子水于2 mL EP 管中，將50 μL 溶解有亞油酸的甲醇溶液添加到EP 管中使其終質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL。添加2.5 μL 濃度為1 mmol/L 的POBN 溶液，再向EP 管中添加不同濃度的巖藻黃質(zhì)使其終質(zhì)量濃度為10，50，100，200，300 ng/mL 以及BHT（陽性對照），同時(shí)向空白中添加等體積的甲醇。將EP 管置于（80±0.1）℃水浴鍋中，在第10，20，30 分鐘采用ESR 對脂質(zhì)自由基清除情況進(jìn)行考察。

采用毛細(xì)管吸取約80 μL 樣品溶液，并采用凡士林將管底封住，放入石英玻璃管中，隨后放入ESR 諧振腔內(nèi)進(jìn)行檢測。ESR 檢測條件參照1.3.4.1節(jié)試驗(yàn)中的檢測條件。

1.3.4.3 巖藻黃質(zhì)對亞油酸鹽氧化模型的自由基清除作用 取4 mg 亞油酸鹽溶于10 mL 去離子水中并取0.5 mL 于2 mL EP 管中。向上述2 mL EP 管中添加巖藻黃質(zhì)醇溶液使其在體系中的終質(zhì)量濃度為50，100，200，300 ng/mL?？瞻捉M中添加相同體積不含巖藻黃質(zhì)的醇溶液，并向所有EP管中添加自由基捕獲劑POBN，使其在體系中的終質(zhì)量濃度為（1.00±0.05）mg/mL。將EP 管置于（80±0.1）℃水浴鍋中，在第10，20，30 分鐘時(shí)采用ESR 對脂質(zhì)自由基清除情況進(jìn)行考察。ESR 檢測條件參照1.3.4.1 節(jié)試驗(yàn)中的檢測條件。

圖1 魚油加熱期間MDA 值變化Fig.1 Changes of MDA content during fish oil heating

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 采用Excel 2013 版軟件和SPSS 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05 被認(rèn)為顯著，P＜0.01 被認(rèn)為極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 巖藻黃質(zhì)對魚油氧化模型的抗氧化作用

魚油富含n-3 系多不飽和脂肪酸，這些高度不飽和脂肪酸極易被氧化酸敗，降低魚油的營養(yǎng)價(jià)值，甚至產(chǎn)生毒害作用。為此向魚油中加入抗氧化物質(zhì)成為了研究重點(diǎn)[18]。如圖1所示，在加熱氧化初期巖藻黃質(zhì)表現(xiàn)出極強(qiáng)的抗魚油氧化能力，當(dāng)加熱氧化時(shí)間為3 h 時(shí)，與空白組相比抑制78.1% MDA 生成，加熱氧化時(shí)間為6 h 時(shí)，與空白組相比抑制52.9% MDA 生成。但隨著加熱時(shí)間的延長巖藻黃質(zhì)的抑制作用出現(xiàn)減弱，當(dāng)加熱氧化9 h 時(shí)，抑制48.5% MDA 生成。這可能是因?yàn)閹r藻黃質(zhì)對光、熱、pH 值等條件較為敏感[19]，使巖藻黃質(zhì)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，導(dǎo)致其抗氧化能力下降。但在整個(gè)過程中巖藻黃質(zhì)均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗魚油氧化能力。

2.2 巖藻黃質(zhì)對豬肉油氧化模型的抗氧化作用

目前常用的抗氧化劑如BHT、BHA、TBHQ 等對肉的腐敗變質(zhì)有一定的作用，但因具有潛在的致癌性，發(fā)達(dá)國家已限制流通使用[20]。人們更加關(guān)注安全、高效的天然抗氧化劑[21]。

圖2 豬肉儲藏時(shí)期MDA 值的變化Fig.2 Changes of MDA content in pork during storage

如圖2所示，貯藏時(shí)間的延長會促進(jìn)五花肉樣品中的脂質(zhì)氧化，使脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）增高。經(jīng)巖藻黃質(zhì)處理的試驗(yàn)組在第10 天到第20 天期間MDA 無明顯變化。與魚油氧化模型不同，豬肉避光貯藏在4 ℃冰箱中為巖藻黃質(zhì)提供了良好的穩(wěn)定環(huán)境，使巖藻黃質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，故其抗氧化能力保留時(shí)間較長，在第10 天以及第20 天巖藻黃質(zhì)均表現(xiàn)出良好的抗氧化能力。該結(jié)果表明巖藻黃質(zhì)對豬油脂質(zhì)氧化具有抑制作用。

2.3 基于ESR 技術(shù)研究巖藻黃質(zhì)對食品氧化模型的抗氧化作用

2.3.1 巖藻黃質(zhì)對魚油及玉米油氧化模型的抗氧化作用 ESR 波譜技術(shù)能檢測自由基中的單電子自旋翻轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的共振現(xiàn)象，目前被廣泛應(yīng)用在食品加工貯藏中氧化過程產(chǎn)生的自由基分析[22]。但是由于一些小分子自由基極不穩(wěn)定，很難直接利用ESR 波譜檢測到信號[23]。通過添加自旋捕集劑生成加合物，濃度達(dá)到或大于10-7～10-6mol/L 可以檢測到該加合物的信號來表征原有自由基。本試驗(yàn)向食品模型中添加POBN 捕獲劑以便捕獲模型氧化產(chǎn)生的自由基[24]。

如圖3和圖4所示，當(dāng)隨著巖藻黃質(zhì)濃度增加，抑制效果也隨著明顯提升。各濃度巖藻黃質(zhì)對魚油氧化抑制效果隨著加熱時(shí)間的增加而有所增強(qiáng)。當(dāng)巖藻黃質(zhì)質(zhì)量濃度為10 ng/mL，加熱氧化1 h 時(shí)模型中自由基殘留率為（91.30±11.86）%，而當(dāng)加熱氧化2 h 時(shí)自由基殘留率降低到（75.76±9.01）%。試驗(yàn)表明當(dāng)巖藻黃質(zhì)質(zhì)量濃度較低時(shí)抑制能力不如BHT 強(qiáng)，但隨著質(zhì)量濃度的增加，當(dāng)增加到100 ng/mL 時(shí)抑制效果明顯強(qiáng)于BHT，且隨著加熱氧化時(shí)間延長大濃度巖藻黃質(zhì)抑制效果明顯強(qiáng)于BHT。上述結(jié)果表明巖藻黃質(zhì)能夠顯著抑制魚油氧化過程中產(chǎn)生的脂質(zhì)自由基。

圖3 巖藻黃質(zhì)對魚油氧化模型加熱過程中脂質(zhì)自由基生成量的影響Fig.3 Effect of fucoxanthin on the amount of lipid free radical production of fish oil model during the thermal processing

圖4 巖藻黃質(zhì)對魚油氧化模型加熱過程中脂質(zhì)自由基生成量的ESR 圖Fig.4 ESR spectrum of effecting of fucoxanthin on the amount of lipid free radical production of fish oil model during the thermal process

如圖5和圖6所示，當(dāng)巖藻黃質(zhì)質(zhì)量濃度較低以及加熱時(shí)間較短時(shí)，抑制玉米油產(chǎn)生自由基的效果隨質(zhì)量濃度的變化不大。這可能是由于玉米油中主要的不飽和脂肪酸為亞油酸和亞麻油酸，二者含量占總脂肪酸含量的50%以上[25]，使其不飽和度較低。因?yàn)橛衩子秃休^多的維生素E，具有良好的抗氧化作用[26]。且玉米油中的植物甾醇含量也很高，甾醇和甾醇酯總量超過1 000 mg/kg[27]。此外有報(bào)導(dǎo)介紹，玉米油甘油酯上第二位酯化的脂肪酸，有98%是不飽和脂肪酸，而外側(cè)第1和第3 位上酯化的幾乎全部是飽和脂肪酸[28]。由此在加熱時(shí)間較短以及巖藻黃質(zhì)濃度較低時(shí)，抑制效果變化不大。在短時(shí)間加熱時(shí)只有當(dāng)巖藻黃質(zhì)質(zhì)量濃度達(dá)到100 ng/mL 時(shí)表現(xiàn)出明顯的抑制作用。長時(shí)間加熱下高濃度巖藻黃質(zhì)有較強(qiáng)的抑制能力。圖中各個(gè)時(shí)間點(diǎn)下BHT 抑制效果與巖藻黃質(zhì)質(zhì)量濃度為50 ng/mL 時(shí)相接近。該研究結(jié)果表明高質(zhì)量濃度的巖藻黃質(zhì)能夠有效抑制玉米油氧化初期所產(chǎn)生的自由基。

圖5 巖藻黃質(zhì)對玉米油氧化模型加熱過程中脂質(zhì)自由基生成量的影響Fig.5 Effect of fucoxanthin on the amount of lipid free radical production of corn oil model during the thermal processing

圖6 巖藻黃質(zhì)對玉米油氧化模型加熱過程中脂質(zhì)自由基生成量的ESR 圖Fig.6 ESR spectrum of effecting of fucoxanthin on the amount of lipid free radical production of corn oil model during the thermal processing

2.3.2 巖藻黃質(zhì)對亞油酸氧化模型的自由基清除作用 結(jié)果如圖7和圖8所示，在不同加熱氧化時(shí)間下脂質(zhì)自由基的抑制效果均隨巖藻黃質(zhì)質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。當(dāng)加熱氧化20 min 時(shí)，模型中巖藻黃質(zhì)質(zhì)量濃度為100 ng/mL 時(shí)脂質(zhì)自由基殘留率為（64.51±7.60）%。當(dāng)巖藻黃質(zhì)質(zhì)量濃度為200 ng/mL 時(shí)，自由基殘留率下降到（40.76±10.13）%。而當(dāng)巖藻黃質(zhì)質(zhì)量濃度達(dá)到300 ng/mL 時(shí)，自由基殘留率下降到（38.94±0.59）%，但巖藻黃質(zhì)抑制效果不如人工合成的BHT 作用效果強(qiáng)。趙文恩等[29]研究了5 種類胡蘿卜素對亞油酸甲酯氧化的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種類胡蘿卜素均通過自身消耗達(dá)到抗氧化效果。

圖7 巖藻黃質(zhì)對亞油酸氧化模型加熱過程中脂質(zhì)自由基生成量的影響Fig.7 Effect of fucoxanthin on the amount of lipid free radical production of linoleic acid model during the thermal processing

圖8 巖藻黃質(zhì)對亞油酸氧化模型加熱過程中脂質(zhì)自由基生成量的ESR 圖Fig.8 ESR spectrum of effecting of fucoxanthin on the amount of lipid free radical production of linoleic acid model during the thermal processing

2.3.3 巖藻黃質(zhì)對亞油酸鹽氧化模型的自由基清除作用 如圖9和圖10各加熱時(shí)間下隨著巖藻黃質(zhì)質(zhì)量濃度的增加，抑制效果均得到增強(qiáng)，但當(dāng)巖藻黃質(zhì)質(zhì)量濃度增加到200 ng/mL 后，抑制效果逐漸平緩，達(dá)到了抑制的上限。當(dāng)加熱20 min，巖藻黃質(zhì)質(zhì)量濃度為200 ng/mL 時(shí)，自由基殘留率為（54.37±1.72）%，而當(dāng)巖藻黃質(zhì)質(zhì)量濃度為300 ng/mL 時(shí)，自由基殘留率為（46.66±9.96）%。在加熱時(shí)間較短時(shí)（10，20 min），巖藻黃質(zhì)表現(xiàn)出較好的抑制自由基效果，加熱時(shí)間10 min，巖藻黃質(zhì)質(zhì)量濃度為300 ng/mL 時(shí)，自由基殘留率為（33.10±1.06）。隨著加熱時(shí)間的延長，BHT 和VC 表現(xiàn)出了更好的抑制效果。由于VC 為水溶性[30]，所以在亞油酸鹽模型中重現(xiàn)性不佳。

3 結(jié)論

巖藻黃質(zhì)可以有效抑制魚油與豬油的氧化。同時(shí)，基于ESR 檢測方法發(fā)現(xiàn)巖藻黃質(zhì)能夠有效抑制魚油、玉米油、亞油酸、亞油酸鹽4 種食品模型氧化初期所產(chǎn)生的脂質(zhì)自由基，對上述4 種食品模型具有較強(qiáng)的抗氧化作用。本研究為日后開發(fā)抗氧化功能食品提供了一定的理論基礎(chǔ)和參考方向，有一定的潛在價(jià)值。

圖9 巖藻黃質(zhì)對亞油酸鹽模型加熱過程中脂質(zhì)自由基生成量的影響Fig.9 Effect of fucoxanthin on the amount of lipid free radical production of linoleate model during the thermal processing

圖10 巖藻黃質(zhì)對亞油酸鹽模型加熱過程中脂質(zhì)自由基生成量的ESR 圖Fig.10 ESR spectrum of effecting of fucoxanthin on the amount of lipid free radical production of linoleate model during the thermal process