張莉華，陳少軍

（1 浙江醫(yī)藥高等?？茖W校食品學院 浙江寧波315000 2 浙江醫(yī)藥高等?？茖W校中藥學院 浙江寧波315000）

新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）肺炎（新冠肺炎）于2019年12月以來在國內(nèi)外爆發(fā)、蔓延，已成為全球高度關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件[1-4]。世界衛(wèi)生組織于2020年2月12日宣布，將新冠肺炎命名為COVID-19 （Corona Virus Disease 2019）[5]。COVID-19 被證實為是一種急性呼吸道傳染病，具有潛伏期長、傳染性強和人群普遍易感的特點[2，6-7]。COVID-19 的防治是當前面臨的緊急問題。通過一系列預防控制和醫(yī)療救治措施，我國境內(nèi)疫情得到抑制和緩解，而境外的發(fā)病人數(shù)呈上升趨勢[4]。在沒有特效藥的情況下，中醫(yī)藥在預防和治療COVID-19 全過程中都發(fā)揮著重要作用[8]。

藥食同源的生姜是防治過程中常用到的一味藥。對國家和各省市、國醫(yī)大師、院士和知名中醫(yī)臨床專家發(fā)布的眾多中藥預防方案進行研究發(fā)現(xiàn)，黃芪、金銀花和生姜在預防用藥中值得予以關(guān)注[9]。預防方案中的足浴方是以花椒和生姜等辛香之品為主[10]。對《瘟疫論》、《廣瘟疫論》中治療瘟疫用藥規(guī)律分析，單味藥甘草、生姜和芍藥使用頻率最高[11]。在抗新型冠狀病毒基于花生四烯酸代謝通路防治“細胞因子風暴”的研究中，發(fā)現(xiàn)中藥厚樸、生姜、金銀花、大黃等對花生四烯酸代謝通路具有抑制成分[12]。同時，從中藥化學成分數(shù)據(jù)庫中篩選并發(fā)現(xiàn)生姜等中藥對SARS-CoV-2 病毒的3CL 水解酶有藥理活性作用[13]。從國家及各省市公布的中醫(yī)藥抗SARS 和新型冠狀病毒方案中篩選出46 個能作用于新型冠狀病毒S 蛋白與人體ACE2 結(jié)合區(qū)域且具有較高結(jié)合能的中草藥活性成分，它們主要歸屬于桑葉、蒼術(shù)、浙貝母、生姜、金銀花、連翹、草果等7 味中藥[14]。綜上，生姜具有潛在的COVID-19 防治作用。

生姜自古以來就是藥食兩用佳品，具有解表散寒、溫中止嘔、溫肺止咳和解毒功效。雖然它現(xiàn)在廣泛用于防治COVID-19，但其預防機理仍未清楚。本文以生姜活性成分6-姜辣素、8-姜酚和10-姜酚（三者均是藥典含量測定指標成分）為研究對象，采用化學相似性搜索方法預測其作用靶點；采用人工數(shù)據(jù)挖掘病毒性肺炎的疾病靶點，由交集獲得生姜活性成分作用于病毒性肺炎的靶點，然后進行基因本體富集和通路富集分析，并構(gòu)建 “成分-靶點-通路” 網(wǎng)絡，為了解生姜防治COVID-19 作用機理提供依據(jù)，也為飲食調(diào)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 活性成分作用靶點的預測

藥物靶點的確認是藥物開發(fā)研究的核心步驟之一。SwissTargetPrediction 是以小分子化學結(jié)構(gòu)二維/三維結(jié)構(gòu)相似性原理來預測潛在靶點[15]。它包含有37 634 個小分子成分的化學庫和有3 068個靶點的大分子蛋白庫[15]。首先在Pubchem database 檢索并將6-姜辣素（Pubchem CID：442793）、8-姜酚（Pubchem CID：168114）和10-姜酚（Pubchem CID：168115）的 Canoncial SMILES 結(jié)構(gòu)分別導入到SwissTargetPrediction 服務器。獲得靶蛋白數(shù)據(jù)人工審核后做Venn 集合分析。取預測出來的靶蛋白做方法學驗證。

1.2 病毒性肺炎相關(guān)疾病靶點收集

病毒性肺炎相關(guān)疾病蛋白分別從The Comparative Toxicogenomics 數(shù)據(jù)庫（http：//ctdbase.org/，CTD database）和 GeneCards （https：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫中以“viral pneumonia”為關(guān)鍵詞進行查詢并人工校對，然后用String 11.0 對疾病相關(guān)蛋白相互作用進行分析。

1.3 生姜活性成分預防病毒性肺炎靶點

對第1 步驟獲得的SwissTargetPrediction 預測的靶點集合和第2 步驟獲得病毒性肺炎疾病相關(guān)蛋白集合交集分析并Venn 作圖。交集的靶蛋白可能是生姜防治COVID-19 的潛在作用靶蛋白，并用GeneMANIA 分析。

1.4 富集分析和網(wǎng)絡構(gòu)建

將上一步驟的交集靶蛋白信息分別導入到Omicshare 平臺和DAVID 數(shù)據(jù)庫進行GO 富集分析和KEGG 通路注釋，并用Cytoscape 3.3 軟件構(gòu)建了“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡作用圖。

2 結(jié)果

2.1 生姜活性成分作用靶點的預測結(jié)果

SwissTargetPrediction 預測結(jié)果經(jīng)人工審核校對后，6-姜辣素、8-姜酚和10-姜酚的預測靶點分別是107，105 和106 個。這些靶蛋白主要分布在激酶（kinase），核受體（nuclear receptor）和A 類G 蛋白偶聯(lián)受體（Fmaily A G protein-coupled receptor）中（圖1a，b，c）。因6-姜辣素、8-姜酚和10-姜酚化學結(jié)構(gòu)高度相似，如Venn 圖所示，生姜3 個活性成分共涉及到168 個靶蛋白，其中三者都作用的靶蛋白有51 個（圖1d）。表1中列出前15 位的靶蛋白，其中HTR1A，ALOX5 和HSD11B1分別排在前3 位。

圖1 活性成分的預測靶蛋白分布餅圖Fig.1 Pie chart of predicted targets for active compounds

表1 SwissTargetPrediction 預測的前15 位潛在生姜活性成分作用靶點Table 1 The potential top 15 targets of active compounds from ginger by SwissTargetPrediction

在DrugBank 數(shù)據(jù)庫中分別查到小分子藥物丁螺環(huán)酮（Buspirone），齊留通（Ziltuton）和甲潑尼龍 （Methylprednisolone）可分別作用于HTR1A，ALOX5 和HSD11B1 蛋白。將這3 個小分子藥物的SMILE 化學結(jié)構(gòu)上傳到SwissTargetPrediction進行預測，可發(fā)現(xiàn)目標蛋白在預測結(jié)果中分別排第4 位，第1 位和第13 位（表2），說明SwissTargetPrediction 方法學具有較高的準確性。

2.2 病毒性肺炎疾病靶蛋白相互作用

以“viral pneumonia”為關(guān)鍵詞，從CTD 數(shù)據(jù)庫中檢索并審核得到34 個病毒性肺炎疾病相關(guān)蛋白集。同樣從GeneCard 數(shù)據(jù)庫中檢索到4 078個原始數(shù)據(jù)，為提高準確度和減少工作量，本研究以相關(guān)性得分＞15 篩選并刪掉重復值等，確定239個疾病相關(guān)蛋白集。這2 個蛋白集合并，最終獲得253 個與病毒性肺炎疾病相關(guān)的蛋白。這253 個構(gòu)成了一個非常復雜的蛋白相互作用網(wǎng)絡 （圖2）。表3列有其涉及到的前10 種生物過程，均與免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)和細胞因子反應等密切相關(guān)。

表2 用于方法學驗證的3 個對照藥SwissTargetPrediction 預測結(jié)果Table 2 The SwissTargetPrediction results of three control drugs for methodology validation

圖2 String 2.0 做出的253 個病毒性肺炎相關(guān)蛋白的相互作用網(wǎng)絡Fig.2 The protein-protein interactions network of 253 viral pneumonia-related targets using String 2.0

表3 String 2.0 計算出的前10 位病毒性肺炎相關(guān)疾病蛋白的生物過程Table 3 The top 10 biological process of viral pneumonia-related targets using String 2.0

2.3 生姜活性成分防治病毒性肺炎的靶點確認

將試驗第1 步驟獲得生姜活性成分的SwissTargetPrediction 預測靶蛋白集與第2 步驟獲得2個病毒性肺炎相關(guān)蛋白集進行交集發(fā)現(xiàn)，3 個集合共同交集于數(shù)目為3 的集合，且SwissTargetPrediction 與GeneCard 還交集于數(shù)目15 的集合 （圖3a）。這樣獲得了生姜活性成分作用于病毒性肺炎疾病密切相關(guān)的18 個靶蛋白（表4）。采用Gene-MANIA 分析發(fā)現(xiàn)，這18 個興趣蛋白相互作用最主要的方式是物理相互作用 （physical interactions），占42.62%（圖3b），說明這些蛋白在功能上具有一定的相似性。

圖3 18 個生姜活性成分作用病毒性肺炎的潛在靶點Fig.3 The 18 target of active compounds of ginger for viral pneumonia

表4 生姜活性成分作用于病毒性肺炎的18 個潛在靶蛋白Table 4 Potential 18 targets for active compounds of ginger related to viral pneumonia

2.4 富集分析和網(wǎng)絡構(gòu)建

將這18 個重要靶蛋白分別輸入到Omicshare進行GO 富集分析，排前5 的生物過程分別是：白細胞分化（leukocyte differentiation）、肽基酪氨酸磷酸化（peptidyl-tyrosine phosphorylation）、肽基酪氨酸修飾（peptidyl-tyrosine modification）、細胞活化 （cell activation）和細胞表面受體信號通路（cell surface receptor signaling pathway）（圖5）。

將這18 個重要靶蛋白分別輸入到DAVID 進行KEGG 富集分析，共獲得21 條靶標富集的疾病通路（P＜0.05，false discovery rates，F(xiàn)DR＜0.05）。前3 位分別是非小細胞肺癌通路 （Non-small cell lung cancer）、癌癥通路（Pathways in cancer）和病毒致癌通路（Viral carcinogenesis）（表5）。最后，采用Cytoscape 軟件構(gòu)建生姜的 “3 個活性成分-18個靶點-21 條通路”作用網(wǎng)絡，初步闡釋了生姜多成分、多靶點和多通路防治COVID-19 的機理研究。

圖4 核心靶蛋白的前20 位基因本體生物過程富集信息Fig.4 The top 20 GO biological process （BP）of 18 key targets

表5 生姜活性成分作用的病毒性肺炎相關(guān)靶點富集的KEGG 通路Table 5 KEGG pathways of viral pneumonia-related targets for active compounds of ginger

3 討論

COVID-19 屬于中醫(yī)疫病，病位在肺，基本病機特點為“濕、熱、毒、瘀”，常見病機是邪毒犯肺，挾熱下利，肺失宣降，水停生濕[16-17]。因此，在防治方案中，辛味和苦味藥物配伍使用最多，采用了辛開苦降的治療大法[18]。作為藥食同源的代表藥，生姜歸肺經(jīng)，辛溫發(fā)散，能溫肺散寒、化痰止咳，能對肺部疾病有較好的作用，這意味著對COVID-19能起一定治療作用。同時，生姜還歸經(jīng)于脾經(jīng)和胃經(jīng)，具有溫中止嘔和解毒的功效。部分COVID-19患者表現(xiàn)出嘔吐、腹瀉等消化道癥狀[4]。因此，生姜對COVID-19 患者帶的 “疫毒” 具有潛在解毒作用，還可能對脾胃等臟腑具有潛在保護作用。

生姜能作用于COVID-19 密切相關(guān)的靶蛋白，如IL2 誘導的T 細胞激酶（ITK），C-X-C 趨化因子受體2（CXCR2），細胞周期蛋白激酶CDK4，細胞周期蛋白CCND1 等（表4）。ITK 和CXCR2 蛋白與炎癥反應密切相關(guān)。ITK 在T 細胞中表達并在T 細胞受體信號通路發(fā)揮核心作用[19]。在ITK敲除和ITK 激酶失活的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，總IgE升高，減少肥大細胞脫顆粒，從而減少氣道炎癥和氣道高反應性[19]。CXCR2 是感染后循環(huán)和肺浸潤中性粒細胞中最主要的趨化因子受體，在白細胞募集和激活中起至關(guān)重要作用[20]。COVID-19 患者感染后炎癥反應增強，血漿中炎癥因子IL2、IL7、IL10、GSCF、IP10、MCP1、MIP1A 和TNFα 等表達水平顯著升高，從而引發(fā)細胞因子風暴[6]。因此，生姜活性成分可能是通過ITK，CXCR2 等來調(diào)節(jié)COVID-19 患者的炎癥反應，從而起防范作用。在Cdk4-/-小鼠中，肺損傷后，淋巴細胞募集受到損害，CDK4 參與了白細胞遷移與黏附，與機體免疫反應密切相關(guān)[21]。社區(qū)獲得性肺炎患者的全血單核細胞中，CDK2 顯著下降，CCND1 明顯下降[22]。因此，生姜活性成分是通過多靶標發(fā)揮COVID-19防治作用的。因此，生姜還可通過CDK4 和CCND1等對炎癥導致細胞損傷起保護作用。需要注意是是，本研究只選了生姜的3 種活性成分（藥典含量測定指標成分），暫時未發(fā)現(xiàn)這3 個成分對COVID-19 研究熱點靶蛋白ACE2 或Mpro 等有作用，這也說明了生姜在防治過程中起著輔助和調(diào)理作用。

生姜活性成分作用的18 個重要靶蛋白生物過程富集主要集中在炎癥反應和免疫應答過程中，如白細胞分化，造血或淋巴器官發(fā)育，對細胞因子的反應，免疫系統(tǒng)的發(fā)育，T 細胞活化和白細胞激活等（圖4）。SARS-CoV 感染過程中免疫效應細胞釋放大量促炎性細胞因子和趨化因子，引發(fā)了細胞因子風暴，導致致命的不可控制的全身炎癥反應[23]。這說明生姜可直接參與COVID-19 的炎癥反應調(diào)節(jié)。同時，GO 富集還包括細胞表面受體信號通路、調(diào)控凋亡，翻譯等一系列生物學過程，說明生姜對炎癥因子導致機體損傷有改善保護作用。

KEGG 通路分析發(fā)現(xiàn)生姜活性成分參與了多種信號通路（表5）。排第1 位的非小細胞肺癌通路（Non-small cell lung cancer）與肺部損傷相關(guān)，排第3 位的病毒致癌通路 （Viral carcinogenesis）和第7 位的乙型肝炎病毒（Hepatitis B）與病毒感染有關(guān)，還有趨化因子信號途徑（Chemokine signaling pathway）與免疫反應相關(guān)（表5）。這些通路直接與COVID-19 發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系。值得注意的是，靶蛋白還參與了眾多癌癥通路，如非小細胞肺癌通路、腫瘤通路、膠質(zhì)細胞瘤通路、胰腺癌通路、前列腺癌通路、膀胱癌通路、子宮內(nèi)膜癌通路和急性骨髓性白血病通路等（表5）。研究報告癌癥患者比非癌癥患者更易感染COVID-19，且肺癌是最常見的類型，這些患者的預后較差[24]。推測生姜對COVID-19 患者的飲食調(diào)理有一定的幫助。

綜上所述，本文以生姜活性成分6-姜辣素、8-姜酚和10-姜酚為研究對象，通過化學相似法預測作用靶點，人工數(shù)據(jù)挖掘病毒性肺炎疾病相關(guān)蛋白，交集獲得生姜活性作用于病毒性肺炎的相關(guān)蛋白，并進行GO 富集和通路富集分析，構(gòu)建了作用網(wǎng)絡。發(fā)現(xiàn)生姜活性成分是通過多靶點和多信號通路作用于病毒性肺炎，具有多靶點和整體調(diào)節(jié)的特點。這為了解其防治COVID-19 提供理論依據(jù)，也為日常食物調(diào)理提供參考。