二次殺菌對(duì)貯藏期間醬鹵羊肚肌原纖維蛋白氧化、特性及結(jié)構(gòu)的影響

侯 然，趙 偉，盧士玲，韓 平，劉 璐，艾延文，董 娟,*

（1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214000）

低溫肉制品在肉制品市場(chǎng)中占據(jù)主導(dǎo)地位[1]。其中，醬鹵肉制品是選用鮮（凍）畜禽肉和可食副產(chǎn)品與香辛料一起經(jīng)預(yù)煮、浸泡、燒煮、鹵制等工藝加工而成的肉制品[2]。醬鹵羊肚因其具有較好的口感和風(fēng)味，深受消費(fèi)者的喜愛(ài)，該產(chǎn)品經(jīng)過(guò)二次殺菌后，可有效延長(zhǎng)其貯藏期。目前，熱處理是最常使用的殺菌方式，可通過(guò)殺死致病菌和腐敗菌而延長(zhǎng)貯藏期。熱處理主要分為商業(yè)殺菌和巴氏殺菌，其中巴氏殺菌較為溫和，因能較好地保存蛋白等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及風(fēng)味而被廣泛應(yīng)用[3]。熱處理會(huì)導(dǎo)致食物中蛋白質(zhì)的氧化變性，同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)改變[4]。Zhang Lili等[5]研究表明100 ℃和120 ℃會(huì)導(dǎo)致鱈魚魚糜凝膠蛋白無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)受損，并且隨著處理溫度的升高，無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)被破壞程度越高，導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集，使網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的框架變得更加脆弱，孔洞變大，從而減少了蛋白質(zhì)和水之間的水合作用，導(dǎo)致魚糜凝膠的質(zhì)地特性遭到破壞。但也有研究表明無(wú)論生鮮肉的特性如何，適當(dāng)?shù)臅r(shí)間和溫度組合下，熱誘導(dǎo)的結(jié)締組織和肌原纖維蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變性與蛋白水解之間相互作用會(huì)增加肉的嫩度[6]，從而改善產(chǎn)品品質(zhì)。隨著科技的進(jìn)步，非熱處理技術(shù)現(xiàn)被認(rèn)為是熱處理的替代技術(shù)或補(bǔ)充[7]，而超高壓是一種新型的非熱處理技術(shù)。超高壓處理可以改變微生物群[8]，同時(shí)也會(huì)引起蛋白質(zhì)發(fā)生氧化，使其構(gòu)象發(fā)生改變，改善肉的品質(zhì)[9-10]。Rakotondramavo等[11]研究表明，高壓處理（500 MPa、20 ℃、5 min）高級(jí)法國(guó)熟火腿可通過(guò)巰基反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)氧化，并且導(dǎo)致蛋白變性和聚集，使產(chǎn)品硬度增加。Xue Siwen等[12]的研究表明，靜態(tài)高壓條件對(duì)肌原纖維蛋白產(chǎn)生了一定的作用，使其暴露出一些掩埋基團(tuán)，從而改善了蛋白凝膠化，提高了產(chǎn)品品質(zhì)。綜上所述，超高壓和熱處理對(duì)改善肉品品質(zhì)、延長(zhǎng)貯藏期具有一定的優(yōu)勢(shì)，但目前對(duì)處理后醬鹵羊肚貯藏期間肌原纖維蛋白的影響還鮮見(jiàn)報(bào)道。

鑒于此，本研究采用超高壓和熱處理技術(shù)對(duì)醬鹵羊肚進(jìn)行二次殺菌，通過(guò)分析二次殺菌后貯藏期間肌原纖維蛋白氧化、理化特性和結(jié)構(gòu)的變化，探討兩種二次殺菌方式對(duì)貯藏期間醬鹵羊肚蛋白的影響，闡明肌原纖維蛋白氧化狀態(tài)、特性與蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的相關(guān)性，揭示醬鹵羊肚品質(zhì)變化的微觀機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮綿羊羊肚購(gòu)于新疆西部牧業(yè)股份有限公司，購(gòu)買后將其裝入保鮮袋內(nèi)快速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，去除羊肚表面的污物及油脂后清洗干凈。

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫代巴比妥酸5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）、2,4-二硝基苯肼、氫氧化鈉 北京博奧拓達(dá)科技有限公司；標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DZ-400/2C真空包裝機(jī) 上海青浦食品包裝機(jī)械廠；Multifuge X1R高速冷凍離心機(jī) 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；T25 digital ULTRA-TURRAX高速分散器 艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司；EONC酶標(biāo)儀美國(guó)伯騰儀器有限公司；DYY-8C電泳儀 北京六一生物科技有限公司；970CRT熒光分光光度計(jì) 上海精密儀器儀表有限公司；Senterra拉曼光譜儀 德國(guó)布魯克公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

根據(jù)劉楊銘等[13]的方法對(duì)羊肚進(jìn)行醬鹵。真空包裝好的醬鹵羊肚經(jīng)處理后分為3 組，分別為未經(jīng)二次殺菌處理的空白羊肚（CN組）、經(jīng)過(guò)超高壓處理的醬鹵羊肚（UHPT組）、經(jīng)過(guò)熱處理的醬鹵羊肚（HT組）。超高壓處理?xiàng)l件為：溫度25 ℃、壓力400 MPa、保壓時(shí)間15 min；熱處理?xiàng)l件為：85 ℃水浴40 min。取出經(jīng)超高壓和熱處理的樣品并迅速置于冰水中冷卻，取出后與CN組共同置于4 ℃冰箱中貯藏24 d，每3 d取一次樣品進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定，并取第0、12、24天的紫外吸收光譜、內(nèi)源熒光光譜、拉曼光譜進(jìn)行分析。

1.3.2 肌原纖維蛋白提取

取一定量的醬鹵羊肚，剔除可見(jiàn)脂肪和結(jié)締組織，切碎后稱取10 g于離心管中，按1∶2（m/V）的比例向上述所得沉淀中加入0.7 mol/L pH 6.5的磷酸鹽緩沖液，12 000 r/min勻漿15 s。勻漿液在4 ℃、5 000×g離心15 min，收集上清液，此步驟重復(fù)2 次，上清液即為肌原纖維蛋白溶液[13]。蛋白含量用雙縮脲法測(cè)定，用牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 羰基含量的測(cè)定

參考Levine等[14]的方法測(cè)定羰基含量，在50 mL的聚乙烯離心管中，取1.3.2節(jié)中提取的肌原纖維蛋白溶液稀釋為1 mg/mL，并取出1 mL與5 mL 10 mmol/L 2,4-二硝基苯肼溶液混合，在25 ℃下避光反應(yīng)40 min（空白反應(yīng)不含2,4-二硝基苯肼）。加入5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的三氯乙酸溶液，振蕩后離心（5 000×g、5 min），棄去上清液。蛋白沉淀用1 mL乙醇-乙酸乙酯溶液（1∶1，V/V）洗滌3 次。待溶劑完全揮發(fā)后，將蛋白質(zhì)懸浮于1 mL 6 mol/L鹽酸胍溶液中，在37 ℃條件下水浴保溫30 min。測(cè)定在370 nm波長(zhǎng)處的吸光度，羰基含量計(jì)算時(shí)摩爾吸光系數(shù)取22 000 L/（mol·cm），結(jié)果以蛋白質(zhì)量計(jì)。

1.3.4 總巰基含量的測(cè)定

總巰基含量參照Yongsawatdigul等[15]的方法進(jìn)行測(cè)定。取1 mL 1 mg/mL的蛋白樣品溶液，加入8 mL的Tris-甘氨酸溶液（pH 8，每升該溶液中含有10.4 g Tris、6.9 g甘氨酸、1.2 g乙二胺四乙酸、480 g尿素）。溶液經(jīng)均質(zhì)后5 000×g離心15 min，在上清液中加入0.5 mL 10 mmol/L Ellman試劑反應(yīng)0.5 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定412 nm波長(zhǎng)處的吸光度，使用摩爾吸光系數(shù)13 600 L/（mol·cm）計(jì)算總巰基含量。CN組除不加Ellman試劑，其他處理方法均如上所述。

1.3.5 蛋白組成的測(cè)定

將肌原纖維蛋白溶液稀釋至質(zhì)量濃度為2 mg/mL，加入等體積的2×樣品緩沖液，混合1 min后，在100 ℃條件下水浴4 min，冷卻至室溫備用，隨后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。電泳凝膠選用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的分離膠和質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的濃縮膠，上樣量為10 μL，電壓80 V，當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠時(shí)將電壓調(diào)至160 V。電泳結(jié)束后，將電泳膠片剝出，用考馬斯亮藍(lán)染色30 min后用脫色液進(jìn)行多次脫色，直至膠片透明，利用凝膠成像儀進(jìn)行成像。

1.3.6 濁度及溶解度的測(cè)定

濁度及溶解度的測(cè)定參考Xiong Youling L.等[16]的方法。將肌原纖維蛋白溶液稀釋至質(zhì)量濃度為1 mg/mL，40 ℃保溫30 min，快速冷卻后測(cè)定肌原纖維蛋白溶液在320 nm波長(zhǎng)處的吸光度，根據(jù)吸光度的大小作為判斷濁度的依據(jù)。1 mg/mL肌原纖維蛋白溶液經(jīng)過(guò)5 000×g離心20 min后，取上清液，測(cè)定離心后上清液蛋白質(zhì)量濃度。蛋白的溶解度按下式進(jìn)行計(jì)算。

1.3.7 紫外吸收光譜的測(cè)定

用酶標(biāo)儀進(jìn)行紫外吸收光譜測(cè)定[17]。取1 mg/mL的肌原纖維蛋白溶液經(jīng)7 000×g離心30 min后，用0.7 mol/L pH 6.5的磷酸鹽緩沖液將上清液稀釋至0.5 mg/mL。利用酶標(biāo)儀進(jìn)行掃描，掃描波長(zhǎng)范圍為220～400 nm，掃描速率中速，數(shù)據(jù)間隔為0.5 nm。

1.3.8 內(nèi)源熒光光譜的測(cè)定

內(nèi)源熒光光譜的測(cè)定參考Xu Yanshun等[18]的方法并稍作修改，將肌原纖維蛋白溶液（1 mg/mL）用0.6 mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋到0.5 mg/mL，以0.6 mol/L磷酸鹽緩沖液作為空白，利用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行光譜掃描時(shí)，設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為295 nm，發(fā)射光譜范圍為300～400 nm，掃描范圍設(shè)置為300～600 nm，掃描速率設(shè)為10 nm/s，激發(fā)和發(fā)射狹縫為 5 nm，掃描5 次。

1.3.9 拉曼光譜的測(cè)定

將肌原纖維蛋白溶液進(jìn)行真空冷凍干燥后，采用拉曼光譜儀進(jìn)行掃描，選用50 倍顯微鏡，分辨率為5～9 cm－1，激光器波長(zhǎng)為785 nm，激光功率為100 mW，保持15～20 ℃恒溫，累計(jì)掃描2 次，每個(gè)樣品掃描3 遍，記錄位移范圍在100～3 000 cm－1的拉曼光譜。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 次重復(fù)，使用Excel 2010軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，使用SPSS 24.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和皮爾遜相關(guān)性分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05表示差異顯著，使用Origin 2018軟件作圖。拉曼光譜數(shù)據(jù)利用PeakFit 4.12軟件進(jìn)行尋峰、擬合，并計(jì)算峰面積，通過(guò)峰面積計(jì)算蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 二次殺菌方式對(duì)貯藏過(guò)程中肌原纖維蛋白氧化的影響

2.1.1 對(duì)肌原纖維蛋白羰基含量的影響

圖1 二次殺菌后醬鹵羊肚肌原纖維蛋白的羰基含量變化Fig.1 Changes in carbonyl content of myofibrillar protein in sauced sheep tripe after secondary sterilization

如圖1所示，相比CN組，貯藏初期經(jīng)過(guò)超高壓和熱處理后的肌原纖維蛋白羰基含量均上升更快；因此，兩種二次殺菌方式均使蛋白發(fā)生氧化，其中UHPT組的羰基含量始終高于CN組和HT組。有研究表明高壓處理后自由基在肌漿和肌原纖維部分以及非可溶性蛋白質(zhì)部分中形成[19]。因此，UHPT組的羰基含量高于HT組可能是非蛋白質(zhì)來(lái)源的自由基導(dǎo)致的。當(dāng)貯藏時(shí)間為0～15 d時(shí)，HT組的羰基含量高于CN組，但當(dāng)貯藏時(shí)間為15～24 d時(shí)，HT組的羰基含量變化趨于平穩(wěn)并顯著低于CN組（P＜0.05）。有研究表明熱處理會(huì)增加蛋白表面疏水性、羰基含量、蛋白質(zhì)聚集體和席夫堿以及硫代巴比妥酸反應(yīng)物值[20-21]，從而使蛋白質(zhì)的氧化程度增加。因此，HT組羰基含量低于CN組可能是貯藏后期形成了蛋白質(zhì)聚集體，使羰基作用位點(diǎn)被包埋導(dǎo)致的。

2.1.2 對(duì)肌原纖維蛋白總巰基含量的影響

圖2 二次殺菌后醬鹵羊肚肌原纖維蛋白的總巰基含量變化Fig.2 Changes in total sulfhydryl content of myofibrillar protein in sauced sheep tripe after secondary sterilization

巰基含量是反映蛋白氧化程度的指標(biāo)之一[22]。如圖2所示，各組總巰基含量在貯藏初期（0～15 d）整體呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，且HT組和UHPT組下降速率更快，說(shuō)明二次殺菌處理使蛋白質(zhì)的氧化程度增高。HT組第0天的總巰基含量高于CN組，這可能是由于熱處理使蛋白質(zhì)變性后導(dǎo)致被包埋的巰基暴露。有研究報(bào)道，巰基氧化過(guò)程可能是自由基、活性氧或其他硫基基團(tuán)引發(fā)二硫鍵的形成，促進(jìn)其氧化[23]；因此，UHPT組的總巰基含量整體顯著低于CN組和HT組（P＜0.05），可能是由于超高壓處理引起了自由基、活性氧和巰基基團(tuán)共同作用，形成了二硫鍵，使蛋白發(fā)生氧化。貯藏后期（15～24 d）總巰基含量上升，可能是由于貯藏后期細(xì)胞損傷時(shí)，還原酶被釋放并接近底物，從而改變自然氧化機(jī)制，有效地將暴露和氧化的硫基還原[23]。

2.1.3 肌原纖維蛋白的SDS-PAGE分析結(jié)果

圖3 二次殺菌后醬鹵羊肚肌原纖維蛋白的SDS-PAGE圖Fig.3 SDS-PAGE profile of myofibrillar protein in sauced sheep tripe after secondary sterilization

圖3為3 組樣品肌原纖維蛋白的SDS-PAGE分析圖，蛋白特征條帶的識(shí)別參照Chapleau等[24]的方法。經(jīng)過(guò)二次殺菌后，主要受到影響的蛋白為肌動(dòng)蛋白（44.3 kDa）和原肌球蛋白（34～36 kDa）。3 組樣品在貯藏期間的肌動(dòng)蛋白和原肌球蛋白的電泳條帶顏色逐漸變淺，并且在30 kDa左右出現(xiàn)新條帶，說(shuō)明貯藏期間蛋白發(fā)生降解，產(chǎn)生了小分子蛋白。在新出現(xiàn)的條帶中，熱處理的條帶顏色逐漸加深，而CN組和UHPT組的條帶變化不穩(wěn)定，可能是因?yàn)闊崽幚砑觿×说鞍踪|(zhì)聚集體的形成[25]。貯藏期間，UHPT組的條帶顏色變化最為明顯，其次為HT組，說(shuō)明超高壓處理和熱處理均破壞了蛋白之間的相互作用，促使肌原纖維蛋白的氧化降解，且壓力作用更明顯。

2.2 二次殺菌方式對(duì)貯藏過(guò)程中肌原纖維蛋白特性的影響

蛋白質(zhì)的溶解度是通過(guò)排斥力和吸引力之間的作用力來(lái)控制的，它也受到變性蛋白質(zhì)的數(shù)量和聚集程度的影響[26]。由表1可知，第0天的UHPT處理組的溶解度較HT組和CN組低，而HT組和UHPT組的濁度較CN組高（P＜0.05）。有研究表明超高壓能引起肌原纖維蛋白溶解度降低，并認(rèn)為不溶性聚集體是由氫鍵的形成引起的[27]。因此，超高壓處理可能導(dǎo)致了肌原纖維蛋白離子鍵和疏水作用力的改變，形成聚集體，而使溶解度下降、濁度上升。高溫會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)部分變性和聚集體形成[28]，使HT組的濁度上升。在貯藏期間，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，HT組和UHPT組的濁度也呈顯著下降趨勢(shì)（P＜0.05）。這可能是貯藏期間蛋白質(zhì)發(fā)生氧化降解，使小片段的難溶蛋白形成較大的聚集體沉淀而導(dǎo)致的。超高壓處理和熱處理都導(dǎo)致了蛋白質(zhì)的聚集，顯著改變了肌原纖維蛋白的濁度（P＜0.05），但超高壓處理對(duì)肌原纖維蛋白的濁度影響較小。

表1 二次殺菌后醬鹵羊肚肌原纖維蛋白溶解度與濁度的變化Table 1 Changes in solubility and turbidity of myofibrillar protein in sauced sheep tripe after secondary sterilization

2.3 二次殺菌方式對(duì)貯藏期間肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 肌原纖維蛋白紫外吸收光譜

蛋白質(zhì)紫外吸收光譜的特征峰在270 nm波長(zhǎng)處。如圖4所示，在270 nm波長(zhǎng)處的特征吸收峰紫外吸收強(qiáng)度第0天由高到低依次為HT組＞UHPT組＞CN組，該結(jié)果表明二次殺菌導(dǎo)致色氨酸和酪氨酸殘基暴露于蛋白質(zhì)表面，使紫外吸收強(qiáng)度增加。在第12、24天，270 nm波長(zhǎng)處的特征吸收峰紫外吸收強(qiáng)度由高到低依次為CN組＞UHPT組＞HT組。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，HT組和UHPT組的紫外吸收強(qiáng)度均低于CN組。貯藏期間，經(jīng)過(guò)二次殺菌處理的肌原纖維蛋白的紫外吸收強(qiáng)度下降，可能是生色基團(tuán)發(fā)生氧化導(dǎo)致的[29]。

圖4 二次殺菌后醬鹵羊肚肌原纖維蛋白的紫外吸收光譜Fig.4 Ultraviolet absorption spectra of myofibrillar protein from sauced sheep tripe after secondary sterilization

表2 二次殺菌后醬鹵羊肚肌原纖維蛋白的折疊比Table 2 Folding ratios of myofibrillar protein in sauced sheep tripe after secondary sterilization

折疊比是評(píng)估蛋白質(zhì)折疊性的信息指標(biāo)，可以用來(lái)研究蛋白質(zhì)的展開、重新折疊、還原，甚至是蛋白質(zhì)之間的相互作用，折疊比增加意味著色氨酸或酪氨酸的暴露，折疊比下降可能是蛋白質(zhì)相互作用后吸收率損失造成的[30]。如表2所示，經(jīng)過(guò)二次殺菌后，折疊比上升，并且熱處理的折疊比更大。說(shuō)明熱處理導(dǎo)致肌原纖維蛋白的展開程度更高，使色氨酸和酪氨酸暴露，而超高壓處理的蛋白結(jié)構(gòu)相比熱處理的結(jié)構(gòu)更緊密。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，HT組折疊比下降，可能是蛋白質(zhì)之間的相互作用導(dǎo)致的。UHPT組折疊比先下降后升高，可能是蛋白之間的相互作用與蛋白質(zhì)展開的共同作用導(dǎo)致的，但具體的作用機(jī)制還有待研究。

2.3.2 肌原纖維蛋白內(nèi)源熒光光譜

通常，如果λmax小于330 nm，色氨酸處于“非極性”環(huán)境；如果λmax大于330 nm，色氨酸處于“極性”環(huán)境[31]。如圖5所示，超高壓和熱處理后第0天的肌原纖維蛋白的λmax發(fā)生藍(lán)移（CN組：338.5 nm；HT組：336 nm；UHPT組：333 nm），并且隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，藍(lán)移更加明顯，這說(shuō)明超高壓和熱處理會(huì)使色氨酸殘基從極性環(huán)境向非極性環(huán)境轉(zhuǎn)移。還有研究指出，一些色氨酸殘基暴露于極性環(huán)境，與疏水性基團(tuán)相互作用導(dǎo)致的蛋白聚集體形成有關(guān)[32]。通過(guò)λmax可知，HT組中色氨酸殘基相比UHPT組極性環(huán)境更強(qiáng)。因此，熱處理使肌原纖維蛋白的聚集程度高于超高壓處理組，并導(dǎo)致HT組濁度高于UHPT組，該結(jié)果與濁度結(jié)果相互印證。有研究表明·OH氧化會(huì)導(dǎo)致肌原纖維蛋白內(nèi)源熒光強(qiáng)度的降低[33]。在貯藏初期，熱處理使蛋白質(zhì)發(fā)生氧化變性，色氨酸殘基暴露而使熒光強(qiáng)度高于CN組，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白氧化程度加劇，可能使色氨酸殘基熒光猝滅，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度下降。經(jīng)過(guò)超高壓處理后，肌原纖維蛋白受到壓力的影響發(fā)生蛋白質(zhì)的折疊與聚集，結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使色氨酸殘基被包埋在內(nèi)部導(dǎo)致熒光強(qiáng)度低于CN組，但隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，肌原纖維蛋白產(chǎn)生斷裂，導(dǎo)致色氨酸殘基暴露，使熒光強(qiáng)度迅速上升，到貯藏后期，由于熒光猝滅加劇而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度上升緩慢。綜上所述，超高壓和熱處理可以通過(guò)改變肌原纖維蛋白所處的極性環(huán)境和蛋白結(jié)構(gòu)，而使蛋白氧化程度和特性發(fā)生改變。

圖5 二次殺菌后醬鹵羊肚肌原纖維蛋白的內(nèi)源熒光光譜Fig.5 Endogenous fluorescence spectra of myofibrillar protein in sauced sheep tripe after secondary sterilization

2.3.3 肌原纖維蛋白拉曼光譜分析結(jié)果

圖6 二次殺菌后醬鹵羊肚肌原纖維蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.6 Secondary structures of myofibrillar protein in sauceed sheep tripe after secondary sterilization

拉曼光譜是研究二級(jí)結(jié)構(gòu)的方法之一，光譜中酰胺I帶在1 600～1 700 cm－1處由蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)成分疊加形成的，其中1 640～1 645 cm－1和1 680～1 690 cm－1處為β-轉(zhuǎn)角形成的吸收峰，1 645～1 660 cm－1處為α-螺旋形成的吸收峰，1 660～1 670 cm－1和1 670～1 680 cm－1處分別為無(wú)規(guī)卷曲和β-折疊形成的吸收峰[34]。如圖6所示，貯藏0 d時(shí)，熱處理組肌原纖維蛋白的α-螺旋相對(duì)含量減少了12%，同時(shí)β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)卷曲和β-折疊相對(duì)含量分別增加了6%、4%和2%。有研究表明α-螺旋相對(duì)含量主要與蛋白質(zhì)之間的氫鍵含量呈正相關(guān)[35]；因此，熱處理可能會(huì)破壞肌原纖維蛋白的氫鍵，使蛋白質(zhì)的α-螺旋相對(duì)含量減少。超高壓處理組的α-螺旋和β-折疊相對(duì)含量分別減少了5%和9%，而β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲的相對(duì)含量分別增加了10%和4%，說(shuō)明超高壓對(duì)α-螺旋的影響比熱處理組小，并且β-折疊和β-轉(zhuǎn)角之間可能發(fā)生相互轉(zhuǎn)化[36]。有研究表明β-折疊相對(duì)含量的減少說(shuō)明具有疏水作用的蛋白位點(diǎn)暴露，導(dǎo)致蛋白表面疏水性增加[37]。因此，超高壓處理可能使蛋白氫鍵斷裂，同時(shí)疏水作用位點(diǎn)暴露使蛋白質(zhì)疏水性增加，結(jié)構(gòu)變得緊密。隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，超高壓處理組α-螺旋相對(duì)含量減少，無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量增加，說(shuō)明貯藏期間肌原纖維蛋白發(fā)生了氫鍵的斷裂，并且α-螺旋結(jié)構(gòu)向無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，使蛋白結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了有序到無(wú)序的轉(zhuǎn)變，這與Sheng Long等[38]報(bào)道的結(jié)果相似。而熱處理后，貯藏期間肌原纖維蛋白的α-螺旋相對(duì)含量先上升后下降可能與蛋白的熱變性有關(guān)。相比熱處理，超高壓處理對(duì)貯藏前期的蛋白氫鍵破壞較小，保證了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的相對(duì)穩(wěn)定，但在貯藏后期，蛋白結(jié)構(gòu)的改變較為明顯。

2.4 二次殺菌后醬鹵羊肚肌原纖維蛋白氧化狀態(tài)、特性和二級(jí)結(jié)構(gòu)的相關(guān)關(guān)系

由表3可知，貯藏時(shí)間與羰基含量、無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量呈極顯著正相關(guān)，與濁度和α-螺旋相對(duì)含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與總巰基含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），說(shuō)明貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)顯著促進(jìn)肌原纖維蛋白的氧化，改變蛋白特性，并使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生有序到無(wú)序的轉(zhuǎn)變。肌原纖維蛋白的羰基含量與總巰基含量、濁度、α-螺旋相對(duì)含量、無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與溶解度呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。總巰基含量與濁度、溶解度呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。說(shuō)明蛋白氧化與蛋白特性和結(jié)構(gòu)之間存在一定的相關(guān)性。溶解度和濁度與蛋白結(jié)構(gòu)之間并不具有顯著相關(guān)性，說(shuō)明蛋白結(jié)構(gòu)與特性之間并不存在直接相關(guān)性，但可能存在間接的相關(guān)性。在二級(jí)結(jié)構(gòu)中，β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量與其他3 種結(jié)構(gòu)相對(duì)含量均具有顯著相關(guān)性，而穩(wěn)定的α-螺旋、β-折疊相對(duì)含量與不穩(wěn)定的無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量之間不存在相關(guān)性，因此結(jié)構(gòu)由有序到無(wú)序狀態(tài)轉(zhuǎn)化可能是通過(guò)β-轉(zhuǎn)角完成的。

表3 二次殺菌后肌原纖維蛋白貯藏時(shí)間、氧化、特性和二級(jí)結(jié)構(gòu)的相關(guān)關(guān)系Table 3 Correlation between storage time and oxidation properties and secondary structures of myofibrillar protein after secondary sterilization

3 結(jié) 論

本研究表明，醬鹵羊肚在貯藏期間經(jīng)超高壓和熱處理后肌原纖維蛋白中肌動(dòng)蛋白和原肌球蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。二次殺菌后使蛋白質(zhì)的氧化程度增高，而UHPT組的羰基含量高于HT組，可能是非蛋白質(zhì)來(lái)源的自由基導(dǎo)致的。從蛋白特性上來(lái)看，超高壓處理和熱處理都導(dǎo)致了蛋白質(zhì)的聚集，顯著改變了肌原纖維蛋白的濁度（P＜0.05），但超高壓處理對(duì)肌原纖維蛋白的濁度影響較小。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析表明，超高壓與熱處理對(duì)醬鹵羊肚中肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu)均具有顯著影響（P＜0.05），但相比熱處理，超高壓處理對(duì)貯藏前期的蛋白氫鍵破壞較小，保證了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的相對(duì)穩(wěn)定，但在貯藏后期蛋白結(jié)構(gòu)的改變較為明顯。皮爾遜相關(guān)性分析表明，貯藏時(shí)間對(duì)蛋白氧化狀態(tài)、蛋白特性和二級(jí)結(jié)構(gòu)具有顯著影響，并且蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)與蛋白氧化之間存在顯著相關(guān)性，而蛋白氧化與蛋白溶解度和濁度之間也具有一定的相關(guān)性。綜上，超高壓導(dǎo)致更嚴(yán)重的蛋白氧化，但對(duì)貯藏期間的蛋白結(jié)構(gòu)維持較好，保證了醬鹵羊肚的品質(zhì)。因此，相比熱處理，超高壓是更具有優(yōu)勢(shì)的二次殺菌方式。