益氣養(yǎng)陰方對胃腸道腫瘤化療后患者腸道菌群及免疫功能的影響*

張玉星，朱凱，俞仲賢，凌云，周春祥

1.南京中醫(yī)藥大學，江蘇南京210000；2.張家港市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇張家港215000；3.常熟市第一人民醫(yī)院，江蘇常熟215000

近年來的統(tǒng)計表明，全球胃腸道腫瘤占腫瘤發(fā)病率的40%左右，是威脅人類健康的第二大腫瘤疾病［1］。常規(guī)治療手段主要是手術切除配合放、化療，對患者的身體素質有一定要求，且化療存在細胞毒性，對機體不良反應多，會導致一系列免疫下降、消化道反應［2］。研究表明，腸道菌群與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系［3-4］，結直腸癌患者的腸道菌群與正常人群存在顯著差異［5］，癌癥患者的致病菌豐度顯著增多［6-7］，且菌群會隨著癌癥的發(fā)展而變化［8-9］，將結直腸癌患者腸道菌群移植至無菌小鼠，可引起小鼠結腸炎甚至結腸癌的產生，說明菌群失調可誘發(fā)癌癥［10］，在免疫療法中腸道菌群也起到一定作用［11］。

在中醫(yī)理論中，化療藥物屬“火毒”“藥毒”范疇，傷津耗氣。在臨床上發(fā)現(xiàn)多數(shù)患者經(jīng)過化療之后會出現(xiàn)咽干口燥、神疲乏力、少氣懶言、舌紅少津等氣陰兩虛癥狀?；煏е戮贺S度及多樣性降低，條件致病菌增多［12］，雖達到殺傷腫瘤細胞的目的，但同時可能是腫瘤復發(fā)或轉移的原因之一。

益氣養(yǎng)陰方由蘇葉、佛手、枳殼、茯苓、太子參、麥冬、薏苡仁、白術、石斛組成，可有效緩解氣陰兩虛癥狀，兼扶正固本。藥理學上太子參［13-14］、茯苓［15-16］、石斛［17-18］、薏苡仁［19-20］、白術［21］等具有調節(jié)免疫功能的作用。有動物實驗證明，此方能增強免疫抑制模型小鼠的體液免疫、細胞免疫、非特異性免疫功能，促進小鼠的胃腸蠕動［22-23］。本研究觀察了益氣養(yǎng)陰方對胃腸道腫瘤化療后出現(xiàn)氣陰兩虛癥狀患者的具體生理生化指標及腸道菌群變化，推測可能的作用機制，為今后更廣泛的臨床應用提供證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2018年8月至2019年12月在江蘇省張家港市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科及常熟市第一人民醫(yī)院中醫(yī)科就診的患者100例，隨機分為益氣養(yǎng)陰方高劑量組、益氣養(yǎng)陰方低劑量組和安慰劑組，每組分別為34例、32例和34例，各組基本信息見表1。為了比較患者與健康人群的菌群差異，另取30位健康志愿者（來自張家港市中醫(yī)醫(yī)院的體檢科）的糞便作為正常腸道菌群指標，年齡（60.97±3.33）歲；男19人，女11人。本研究經(jīng)過南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會同意，所有患者均對本試驗知情并簽署知情同意書。

1.2 病例納入與排除標準納入標準:①胃腸道腫瘤患者經(jīng)過手術治療后；②經(jīng)過兩次化療，即將開始第3次化療；③預計能夠存活3個月或者以上；④卡氏評分≥60分；⑤使用常規(guī)化療藥治療，如:奧沙利鉑、卡培他濱、多西他賽、雷替曲塞等；⑥根據(jù)1994年國家中醫(yī)藥管理局頒布的《中醫(yī)病證診斷療效標準》，屬于氣陰兩虛證。

表1 各組患者一般資料比較（±s，例）

表1 各組患者一般資料比較（±s，例）

歲男 女 胃癌 結直腸癌益氣養(yǎng)陰方高劑量組組別n 年齡/34 62.41±8.10 22 12 13 21益氣養(yǎng)陰方低劑量組32 62.94±9.40 21 11 17 15安慰劑組34 63.82±5.89 23 11 20 14

排除標準（自擬）:①攝食困難；②近1個月內使用免疫調節(jié)劑；③有明確軀體及精神心理疾病的患者；④患有嚴重高血壓、心臟病以及糖尿病等其他合并病種。

1.3 治療方法根據(jù)動物實驗結果，對小鼠效果顯著的兩個劑量分別是相當成人半日的用藥量和成人1日的用藥量［22-23］，據(jù)此設立益氣養(yǎng)陰方低劑量組與益氣養(yǎng)陰方高劑量組，分別每日攝入半日用藥量即1支口服液與1日用藥量即兩支口服液。益氣養(yǎng)陰方組成:紫蘇葉、佛手、枳殼、茯苓、太子參、麥冬、薏苡仁、白術、石斛。以上諸藥提取為浸膏（南京中醫(yī)藥大學藥學院提供），成人每人每日用量5.26 g。為方便試驗，后經(jīng)北京海德潤醫(yī)藥集團有限公司提純萃取濃縮后，制成口服液，每兩支口服液含藥量為成人1日用量。安慰劑組每日服用兩支安慰劑，安慰劑由北京海德潤醫(yī)藥集團有限公司提供。

1.4 觀察指標分別于治療前、治療后采集患者外周靜脈血測定各指標。骨髓抑制指標利用全自動血細胞分析儀測定，肝腎功能檢查是利用全自動生化分析儀測定，腫瘤標記物是分離血清后利用化學發(fā)光免疫測定法檢測，細胞免疫指標（CD3+、CD4+、CD8+）采用流式細胞儀檢測。以上均由張家港市中醫(yī)醫(yī)院檢驗科和常熟市第一人民醫(yī)院檢驗科完成檢測。

1.5 糞便菌群檢測采集健康組、患者服藥前后的糞便，-80℃冰箱保存，由廣州基迪奧生物有限公司進行16S rRNA測序。實驗流程為:使用HiPure Stool DNA Kits（糞便DNA提取試劑盒）抽提樣本中DNA，以引物對341F:CCTACGGGNGGCWGCAG；806R:GGACTACHVGGGTATCTAAT擴增16 s rDNA的V3+V4區(qū)，切膠回收PCR擴增產物，連接測序接頭，構建測序文庫，使用iseq2500 PE250測序平臺測序。所有樣本測序深度都達到飽和。用Uparse軟件對所有樣品的全部Effective Tags序列聚類，將97%一致性的序列聚類，成為OTUs（Operational Taxonomic Units）結果，與數(shù)據(jù)庫中序列一致性為97%以上的序列認為屬于相同種類。

1.6 統(tǒng)計學方法采用Microsoft Excel 2010軟件進行圖表制作，采用SPSS 20.0軟件對樣本的生理生化指標、腸道菌群進行統(tǒng)計分析，實驗所得數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組患者治療前后肝腎功能、骨髓抑制、腫瘤指標比較各組患者治療前后肝腎功能、骨髓抑制指標和腫瘤標記物采用t檢驗分析發(fā)現(xiàn)，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 各組患者治療前后免疫功能比較治療后，益氣養(yǎng)陰方高劑量組CD3+由（61.59±7.73）%提高至（64.04±8.45）%（t＝-2.130 4，P＝0.040 9），CD4+/CD8+比值由1.21±0.41提高至1.47±0.76（t＝-2.048 9，P＝0.049 9）；益氣養(yǎng)陰方低劑量組CD4+/CD8+比值由1.27±0.50提高至1.70±0.92（t＝-2.384 0，P＝0.023 4）。見表2。

表2 各組患者治療前后免疫功能比較（±s）

表2 各組患者治療前后免疫功能比較（±s）

指標益氣養(yǎng)陰方高劑量組（n＝34）益氣養(yǎng)陰方低劑量組（n＝32）安慰劑組（n＝34）治療前治療后CD3+61.59±7.73 64.04±8.45 62.42±7.40 65.28±9.0治療前治療后治療前治療后3 62.33±9.56 65.76±13.57 t值，P值-2.130 4，0.040 9-1.788 8，0.083 4-1.741 5，0.091 2 CD4+38.09±7.58 38.63±7.95 40.85±8.74 41.89±9.54 40.29±9.52 39.82±13.57 t值，P值-0.360 7，0.720 7-0.703 5，0.487 0 0.365 6，0.717 0 CD4+/CD8+1.21±0.41 1.47±0.76 1.27±0.50 1.70±0.92 1.42±0.70 1.67±0.77 t值，P值-2.048 9，0.049 9-2.384 0，0.023 4-1.932 8，0.063 1

2.3 各組患者治療前后腸道菌群特征分析因樣本質量因素，最終得到益氣養(yǎng)陰方高劑量組、益氣養(yǎng)陰方低劑量組和安慰劑組腸道菌群數(shù)據(jù)的樣本數(shù)分別為30例、30例、31例，健康組30人。

2.3.1 癌癥類型、性別對菌群的影響依據(jù)性別、癌癥類型將入選患者分組，使用雙樣本異方差t檢驗比較其門水平上腸道菌群結構及豐度，結果顯示，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3。因此，腸道菌群數(shù)據(jù)分析不考慮性別及癌癥類型。

表3 癌癥類型、性別對患者糞便菌群影響（±s）

表3 癌癥類型、性別對患者糞便菌群影響（±s）

癌癥類型/性別n 厚壁菌門擬桿菌門變形菌門放線菌門胃癌45 54.30±30.13 18.81±24.06 24.27±29.30 2.23±2.56結直腸癌46 58.91±25.51 17.66±21.44 16.81±22.70 5.29±10.29 t值，P值-0.777 6，0.438 9 0.238 4，0.812 2 1.325 6，0.188 7-1.935 2，0.058 5女性29 51.44±31.32 20.81±25.71 23.60±30.06 3.70±4.76男性62 59.06±25.93 17.02±21.16 19.20±24.33 3.81±8.73 t值，P值1.122 9，0.267 3-0.680 2，0.499 8-0.679 2，0.500 5 0.078 2，0.937 8

2.3.2 癌癥組（癌癥患者）與健康組腸道菌群多樣性比較以sobs、shannon、simpson、chao和ace指數(shù)作為個體腸道菌群多樣性的評判指標，比較胃腸道腫瘤化療后患者與健康組腸道菌群多樣性，癌癥患者菌群多樣性低于健康組，差異均有極顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見表4。

2.3.3 癌癥患者腸道菌群結構使用異方差t檢驗比較患者與健康組之間菌群結構差異，發(fā)現(xiàn)患者厚壁菌門（56.69±27.99）%顯著低于健康組（70.73±12.01）%（t＝-3.812 9，P＝0.000 2），變形菌門（20.52±26.44）%顯著高于健康組（4.92±6.98）%（t＝-5.112 9，P＝0.000 001），放線菌門（3.77±7.69）%顯著高于健康組（1.40±1.22%）（t＝2.820 6，P＝0.005 8），擬桿菌門（18.25±22.78）%與健康組（22.91±11.41）%比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖1。

表4 癌癥患者與健康組腸道菌群多樣性比較（±s）

表4 癌癥患者與健康組腸道菌群多樣性比較（±s）

sobs shannon simpson chao ace健康組30 321.77±29.21 4.74±0.46 0.91±0.03 385.62±組別n 29.14 392.54±31.38癌癥組91 260.05±65.81 3.64±1.11 0.78±0.17 328.83±77.09 327.17±73.77 t值，P值-7.008 3，0.000 0-7.612 5，0.000 0-7.021 0，0.000 0-5.817 0，0.000 0-6.727 3，0.000 0

圖1 胃腸道癌癥患者化療后與健康組腸道菌群組成結構差異比較（±s）

2.4 益氣養(yǎng)陰方對患者腸道菌群的影響

2.4.1 各組患者治療前后腸道菌群多樣性比較

各組患者治療前后菌群多樣性比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表5。

2.4.2 各組患者治療前后腸道菌群門水平豐度比較患者治療前后腸道菌群采用成對t檢驗比較，發(fā)現(xiàn)在門水平上益氣養(yǎng)陰方高劑量組變形菌門由（29.37±31.80）%下降至（18.70±25.67）%（t＝2.215 4，P＝0.035 4）。見表6。

使用成對t檢驗比較患者治療前后優(yōu)勢菌屬的變化發(fā)現(xiàn)，益氣養(yǎng)陰方高劑量組變形菌門中埃希-志賀菌屬由（10.74±16.66）%下降至（3.66±7.71）%（t＝2.091 6，P＝0.047 7），安慰劑組埃希-志賀菌屬由（4.01±6.76）%上升至（4.61±6.77）%（t＝-2.072 4，P＝0.047 6）。見表7。

表5 各組患者治療前后腸道菌群多樣性比較（±s）

表5 各組患者治療前后腸道菌群多樣性比較（±s）

sobs shannon simpson chao ace益氣養(yǎng)陰方高劑量組 30 治療前243.47±65.06 3.66±1.13 0.79±0.16 310.70±74組別n 時間.55 308.55±67.51 30 治療后256.90±65.76 3.87±1.12 0.81±0.14 321.97±78.41 318.45±72.59 t值，P值-1.290 6，0.207 0 -1.063 6，0.296 3 -0.952 4，0.348 8 -0.894 3，0.378 5 -0.888 6，0.381 5益氣養(yǎng)陰方低劑量組 30 治療前254.03±61.49 3.47±1.17 0.74±0.19 320.03±75.57 319.72±72.60 30 治療后247.27±52.96 3.68±1.10 0.79±0.15 316.86±67.73 315.23±69.35 t值，P值0.659 6，0.514 7 -1.277 4，0.211 6 -1.750 4，0.090 6 0.265 5，0.792 5 0.379 4，0.707 2安慰劑組31 治療前281.94±64.63 3.78±1.01 0.80±0.15 354.90±73.94 352.40±73.73 31 治療后260.42±60.77 3.89±1.11 0.81±0.16 336.94±80.73 333.30±78.13 t值，P值1.773 4，0.086 3 -0.547 1，0.588 4 -0.685 1，0.498 6 1.148 3，0.259 9 1.3390，0.190 6

表6 各組患者治療前后腸道菌群門水平豐度比較（±s）

表6 各組患者治療前后腸道菌群門水平豐度比較（±s）

時間厚壁菌門擬桿菌門變形菌門放線菌門健康組-70.73±12.01 22.91±11.41 4.92±6.98 1.40±1.組別n 22益氣養(yǎng)陰方高劑量組30治療前47.17±29.62 20.04±24.03 29.37±31.80 3.16±3.24 30治療后48.90±29.54 22.26±24.57 18.70±25.67 4.85±8.81 t值-0.318 2-0.824 7 2.215 4-1.074 4 P值0.752 6 0.416 3 0.035 4 0.291 5益氣養(yǎng)陰方低劑量組30治療前61.38±25.96 13.28±20.52 18.94±23.99 5.79±12.13 30治療后69.42±17.32 11.95±12.96 12.21±15.61 5.93±8.42 t值-1.709 4 0.538 9 1.420 0-0.071 2 P值0.098 1 0.594 0 0.166 3 0.943 7安慰劑組31治療前61.19±25.86 21.28±22.82 13.98±20.51 2.41±3.83 31治療后57.49±25.95 18.46±19.17 19.85±27.09 2.42±2.60 t值0.558 2 0.772 5-0.920 6-0.008 8 P值0.580 9 0.445 9 0.364 6 0.993 0

表7 各組患者治療前后腸道菌群屬水平豐度比較（±s）

表7 各組患者治療前后腸道菌群屬水平豐度比較（±s）

志賀菌屬組別n時間埃希-健康組1.40±4.16益氣養(yǎng)陰方高劑量組30 治療前10.74±16.66 30 治療后3.66±7.71 t值2.091 6 P值0.047 7益氣養(yǎng)陰方低劑量組30 治療前9.97±15.46 30 治療后6.04±10.51 t值1.873 8 P值0.071 1安慰劑組31 治療前4.01±6.76 31 治療后4.61±6.77 t值-2.072 4 P值-0.047 6

2.4.3 各組患者治療前后變形菌門豐度比較由于腸道菌群個體差異較大，考慮到變形菌門為條件致病菌，在腸道慢性炎癥中起到重要作用。參照健康組變形菌門豐度均在12%以下，以12%為分組標準，將各組患者進一步分為高變形菌門組（≥12%）和低變形菌門組（＜12%），減少個體差異，比較確定益氣養(yǎng)陰方對變形菌門及該門中的埃希-志賀菌屬的影響。

成對t檢驗比較發(fā)現(xiàn)，益氣養(yǎng)陰方高劑量組中的高變形菌門組的變形菌門由（50.33±29.40）%降低至（19.39±20.41）%（t＝2.304 0，P ＝0.035 9），埃希-志賀菌屬由（19.39±20.41）%降低至（4.28±6.04）%（t＝2.283 1，P＝0.045 5）；益氣養(yǎng)陰方低劑量組中的高變形菌門組的變形菌門由（46.59±23.85）%降低至（19.24±12.97）%（t＝2.919 2，P＝0.017 1），埃希-志賀菌屬由（25.63±18.39）%降低至（13.66±13.84）%（t＝2.445 6，P＝0.037 0）；安慰劑組中低變形菌門組的變形菌門由（4.63±2.75）%上升至（21.26±30.61）%（t＝-2.437 9，P ＝0.023 7），埃希-志賀菌屬由（0.66±0.64）%上升至（4.59±7.98）%（t＝-2.161 6，P＝0.043 6）。見表8。

表8 益氣養(yǎng)陰方對不同豐度的變形菌門的影響（±s）

表8 益氣養(yǎng)陰方對不同豐度的變形菌門的影響（±s）

組別n時間變形菌門t值P值埃希-志賀菌屬t值P值50.33±29.40 19.39±20.41 16 治療后19.39±20.41 2.304 0 0.035 9 4.28±6.04 2.283 1 0.045 5益氣養(yǎng)陰方高劑量組-變形菌門豐度低組14 治療前5.02±2.71 1.61±2.55 14 治療后6.49±4.52-0.879 5 0.396 4 6.24±16.77-0.988 2 0.341 1益氣養(yǎng)陰方低劑量組-變形菌門豐度高組10 治療前46.59±23.85 25.63±18.39 10 治療后19.24±12.97 2.919 2 0.017 1 13.66±13.84 2.445 6 0.037 0益氣養(yǎng)陰方低劑量組-變形菌門豐度低組20 治療前5.08±2.37 6.66±13.51 20 治療后3.36±1.87 0.491 8 0.628 5 2.07±5.15 0.051 6 0.959 4安慰劑組-變形菌門豐度高組9治療前36.84±26.35 12.13±7.70 9治療后16.41±14.89 1.996 7 0.080 9 14.31±15.62-0.512 6 0.622 1安慰劑組-變形菌門豐度低組22 治療前4.63±2.75 0.66±0.64 22 治療后21.26±30.61-2.437 9 0.023 7 4.59±7.98-2.161益氣養(yǎng)陰方高劑量組-變形菌門豐度高組16 治療前6 0.043 6

3 討論

3.1 益氣養(yǎng)陰方對胃腸道腫瘤化療后患者血液指標的影響益氣養(yǎng)陰方高劑量組CD3+顯著升高，益氣養(yǎng)陰方各劑量組CD4+/CD8+比值均顯著上升。CD3+代表了T細胞的增殖或成熟，CD4+/CD8+代表輔助性T細胞與殺傷性T細胞之間的平衡，當體內存在慢性炎癥反應時，CD8+細胞數(shù)量增多，CD4+/CD8+比值下降［24］，提示按高劑量服用益氣養(yǎng)陰方在抑制炎癥的同時還能夠改善患者免疫功能。

3.2 胃腸道腫瘤化療后患者與健康組比較化療后，腸道菌群多樣性顯著低于健康組（P＜0.05），菌群組成上變形菌門占比顯著高于健康組（P＜0.05），與已有研究結果類似［12，25］。變形菌門為革蘭陰性菌，外膜由脂多糖組成，能夠激活核因子κB信號通路，引起炎癥。該類菌過度增殖會導致腸道缺氧，腸上皮功能障礙，抑制有益菌增殖，破壞腸道內正常菌群結構，干擾正常抗炎機制［26］。研究表明，炎癥反應會阻礙腫瘤的治愈進程［27-28］。因此，在腫瘤治療過程中應抑制能夠引起并加重炎癥的菌群增殖。仔細觀察患者菌群數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，并非所有患者都具有變形菌門異常增多的表達，因此，以變形菌門作為指示菌，進一步分析益氣養(yǎng)陰方的作用。

3.3 益氣養(yǎng)陰方對胃腸道腫瘤化療后患者腸道菌群的影響服藥后對患者菌群多樣性并無顯著提升，但觀察到益氣養(yǎng)陰方高劑量組多樣性指標增大，安慰劑組下降，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），也許與服藥時間較短有關。益氣養(yǎng)陰方高劑量組變形菌門、埃希-志賀菌屬菌顯著降低，安慰劑組顯著增多。已知埃希-志賀菌屬為變形菌門中較為確定的致病菌，能夠誘發(fā)并延長炎癥反應，在結直腸腫瘤患者中豐度較高［29］。為進一步確定益氣養(yǎng)陰方對變形菌門的影響，將各組患者細分為高變形菌門組和低變形菌門組，結果顯示，益氣養(yǎng)陰方各劑量均可顯著降低組中的高變形菌門組的變形菌門和埃希-志賀菌屬，對組中的低變形菌門組則無顯著作用；而安慰劑組的低變形菌門組的變形菌門和埃希-志賀菌屬顯著上升。以上提示益氣養(yǎng)陰方對患者菌群的改變主要是變形菌門及該門中的埃希-志賀菌屬，可降低其過度增殖，改善腸道微環(huán)境。

綜上，益氣養(yǎng)陰方可改善胃腸道腫瘤化療后患者的免疫功能及腸道菌群，高劑量即成人1日用量效果更好，可長期服用。