胡冠華,王德寶,蘇琳,趙麗華,田建軍,張忠海,朱浩田,靳燁*

1(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特,010018) 2(內(nèi)蒙古澳菲利食品股份有限公司,內(nèi)蒙古 巴彥淖爾,015000)

食源性功能肽是指生物體從外界攝入的活性肽,以特定的氨基酸序列存在于膳食蛋白質(zhì)中,蛋白質(zhì)在降解過程中釋放出具有生理活性的功能肽[1]。鈣是人體中必不可少的礦物質(zhì)元素,具有多種重要的生理功能。鈣不足容易導(dǎo)致佝僂病、骨質(zhì)疏松、高血壓等疾病[2]。飲食攝入是人體骨骼補(bǔ)充鈣的唯一來源,而鈣的吸收受膳食中的植酸鹽、草酸鹽以及其他陽離子如鋅離子、鎂離子和鐵離子的影響[3]。目前市面上的補(bǔ)鈣產(chǎn)品多為離子鈣,例如碳酸鈣、乳酸鈣和葡萄糖酸鈣,在腸道環(huán)境中易形成沉淀,嚴(yán)重降低了人體對鈣的吸收[4]。螯合鈣因其吸收性好、生物利用度高,被認(rèn)為是離子鈣的替代品[5],在小腸內(nèi)按照肽的吸收原理進(jìn)行吸收,能夠有效促進(jìn)人體對鈣的吸收[6]。

鈣螯合肽被認(rèn)為是改善鈣生物利用度的新型功能性成分,到目前為止,已有大量的鈣結(jié)合肽從各種食品資源中分離出來,如魚骨[7]、乳清[8]、大豆[9]等。酪蛋白磷酸肽(casein phosphopeptides,CPPs)是研究最多的促鈣吸收肽,通過絲氨酸的磷酸殘基與鈣螯合形成可溶性的穩(wěn)定復(fù)合物,增加腸道對鈣的吸收[10]。本文綜述了近年來國內(nèi)外報道的鈣螯合肽的制備、分離純化、結(jié)構(gòu)分析及生物活性等內(nèi)容,以期為我國功能肽的利用和開發(fā)提供參考。

1 鈣螯合肽的制備

1.1 蛋白質(zhì)降解

蛋白質(zhì)的氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)賦予其獨特的功能,為了將蛋白質(zhì)降解為肽類和氨基酸,需要采用各種理化手段,打破蛋白質(zhì)的多級結(jié)構(gòu)[11]。酶解法因其條件溫和、反應(yīng)專一、安全環(huán)保等特點,廣泛應(yīng)用于活性生物肽的制備。

蛋白酶具有特定的酶切位點,不同蛋白酶可制備不同分子質(zhì)量和生物活性的肽。一般酶解反應(yīng)在蛋白酶最適條件下進(jìn)行,以獲取最佳的酶解效果。劉靜[12]分別選用5種蛋白酶酶解牦牛骨粉,篩選出堿性蛋白酶為最優(yōu)蛋白酶,當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.5%,溶液pH 7.0,酶解溫度50 ℃,酶底比4 000 U/g,酶解4 h,此時多肽得率為22.06%。由于蛋白酶的作用位點、活性部位及化學(xué)性質(zhì)相差較大,為了得到生物活性更高的蛋白肽,也有研究采用復(fù)合酶、雙酶水解方式。魏新穎[13]將木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行復(fù)配酶解雞肉蛋白制備鈣螯合肽,發(fā)現(xiàn)雙酶分步酶解所得產(chǎn)物的鈣螯合能力大于雙酶同步酶解，并通過響應(yīng)面實驗設(shè)計優(yōu)化,得到最佳酶解工藝：木瓜蛋白酶添加量0.3%,酶解3.5 h,風(fēng)味蛋白酶添加量0.18%,酶解2.84 h,酶解產(chǎn)物鈣螯合力為(61.64±1.04) mg/g(pro)。WU等[14]采用不同的酶解方式(單酶、雙酶分步、雙酶同步)酶解豬骨膠原蛋白,發(fā)現(xiàn)底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%,pH 9.0,50 ℃下水解4 h,酶用量為8 000 U/g(堿性與中性按1∶1同時添加),水解度顯著高于其他水解方式。以上結(jié)果表明,多種蛋白酶協(xié)同作用可增加蛋白的酶解效果。還有研究報道,在高壓脈沖、超聲波、微波等現(xiàn)代技術(shù)輔助下蛋白質(zhì)的水解效果會大大提高。王靜雅等[15]在高壓脈沖電壓輔助下酶解河蚌肉,與單酶解相比水解度提高18.0%。DONG等[16]利用熱壓法輔助酶法提取雞骨中的蛋白,先在(130±0.5) ℃下加熱120 min,后風(fēng)味蛋白酶酶解,發(fā)現(xiàn)水解效果顯著高于單純酶解。

蛋白質(zhì)的水解程度受原料、蛋白酶、酶解條件等因素的影響較大,有必要針對不同底物確定最佳蛋白酶酶解工藝,以便在現(xiàn)代技術(shù)的輔助下高效制備生物活性產(chǎn)品。

1.2 分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定

由于酶解過程的連續(xù)性和蛋白酶的非專一性,酶解產(chǎn)物組成復(fù)雜,需通過分離純化技術(shù)制備具有特定分子質(zhì)量區(qū)間以及功能活性的多肽組分。為得到純度更高的螯合肽,通常將多種分離純化技術(shù)聯(lián)合使用。以具有特定截留分子質(zhì)量的超濾膜、固定化金屬離子親和層析法(immobilized metal ion affinity chromatography,IMAC)和羥基磷灰石色譜(hydroxyapatite chromatography,HAC)作為第一步將酶解產(chǎn)物進(jìn)行粗分,然后利用葡聚糖凝膠色譜柱或離子交換色譜法(ion exchange chromatography,IEC)進(jìn)一步分離,最后采用反相高效液相色譜(reversed phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)得到純度和活性較高的組分。ZHANG等[17]通過HAC和RP-HPLC對太平洋鱈魚骨的酶解物進(jìn)行分離,得到一種新的十肽,鑒定為KGDPGLSPGK(命名為Peptide-K,分子質(zhì)量：954.5 Da),其表現(xiàn)出高的鈣結(jié)合活性(2.53±0.12) mg/g(pro)。CAI等[18]利用凝膠過濾色譜和RP-HPLC,從裂殖壺菌屬中分離純化出一種具有特定鈣結(jié)合能力的新型肽(Phe-Tyr),此肽的鈣結(jié)合能力達(dá)到128.77 mg/g(pro)。酶解產(chǎn)物經(jīng)分離純化得到單一組分后,可以通過飛行時間質(zhì)譜(time-of-flight mass spectrometer,TOF-MS)分析其氨基酸序列和分子質(zhì)量。ZHAO等[8]利用陰離子交換色譜,Sephadex G-25凝膠過濾和RP-HPLC從乳清蛋白水解物中獲得了一種分子質(zhì)量為237.99 Da的鈣結(jié)合肽,通過TOF-MS確定其氨基酸序列為Gly-Tyr,鈣結(jié)合能力為75.38 mg/g(pro),與乳清蛋白水解產(chǎn)物復(fù)合物相比提高了122%。CHEN等[19]采用酶解和膜分離法制備鈣結(jié)合肽,經(jīng)過Sephadex G-15凝膠色譜和RP-HPLC分離純化,得到一種具有較高的鈣結(jié)合活性的肽(76.8±4.5 mg/g(pro)),通過TOF-MS分析確定其氨基酸序列為Glu-Pro-Ala-His,分子質(zhì)量為453.3 Da?？傊?有多種選擇可用于分離純化肽,但存在用時過長、效率較低等問題。從工業(yè)角度出發(fā),需要開發(fā)更加高效的技術(shù),大規(guī)模開發(fā)和制備附加值產(chǎn)品。

2 鈣螯合肽的結(jié)構(gòu)特征

目前,紅外光譜和核磁共振等已被廣泛的用于研究螯合物的化學(xué)鍵、結(jié)合位點、組成等問題。雖然鈣螯合肽的構(gòu)效關(guān)系尚未完全建立,但已經(jīng)確定了一些可能影響螯合活性的結(jié)構(gòu)特征,包括肽的分子質(zhì)量、氨基酸組成及序列和特定的氨基酸基團(tuán)。

2.1 分子質(zhì)量

蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)物通常為不同分子質(zhì)量產(chǎn)物的混合物。研究顯示,肽的螯合能力與分子質(zhì)量大小具有一定的相關(guān)性,大多數(shù)情況下,分子質(zhì)量越小的螯合肽活性越強(qiáng)。分子質(zhì)量大的肽其內(nèi)部活性基團(tuán)與螯合位點無法最大程度的暴露,與鈣離子的接觸機(jī)率低,螯合能力較低。TAM等[20]首次從日本青蟹蛋白酶解物中鑒定出一種分子質(zhì)量為948.4 Da的新型鈣結(jié)合肽,對比10 k～30 kDa,3～10 kDa,1～3 kDa和<1 kDa的4個肽段的鈣結(jié)合活性,發(fā)現(xiàn)<1 kDa的肽段鈣親和力最高為(277.96±20.93) mg/g(pro)。劉麗莉[21]利用超濾膜將發(fā)酵液逐步分離,發(fā)現(xiàn)不同分子質(zhì)量肽螯合鈣的能力相差很多,10 kDa以上肽段螯合能力較低,2～4 kDa 肽段的螯合率最高達(dá)41.23%。李超楠[22]以米蛋白為原料,研究不同分子質(zhì)量的多肽(未分級肽段、<3 kDa、3 k～5 kDa、5 k～10 kDa 和 >10 kDa)對鈣螯合能力的影響,結(jié)果表明3 k～5 kDa肽段螯合能力最強(qiáng)。BUDSEEKOAD等[23]利用超濾法將綠豆蛋白水解物分離為8個組分,測定鈣的結(jié)合性能,發(fā)現(xiàn)<5 kDa的肽鈣結(jié)合活性最強(qiáng)。但是也有研究顯示,高分子質(zhì)量的鈣結(jié)合肽同樣具有較強(qiáng)的活性。LV等[24]研究大豆促鈣吸收肽對鈣的吸收作用時表明,分子質(zhì)量為10～30 kDa的肽比 3～10 kDa及 1～10 kDa的肽結(jié)合活性更強(qiáng)。

上述研究結(jié)果所存在的差異,可能是多方面原因?qū)е拢?1)蛋白來源、組成結(jié)構(gòu)不同所致；(2)評估肽段大小的方法不同；(3)分離純化方法的不同。因此有待進(jìn)一步深入探索關(guān)于不同分子質(zhì)量對螯合活性的影響。

2.2 氨基酸組成及序列

除了分子質(zhì)量外,多肽的氨基酸組成及序列也對鈣螯合能力起著重要的作用。研究表明,某些螯合活性好的促鈣吸收肽中通常存在半胱氨酸(Cys)、谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、絲氨酸(Ser)。CHEN等[25]從羅非魚魚鱗的酶解液中分離出一種高鈣螯合肽,并通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜鑒定出該肽的序列為 Asp-Gly-Asp-Asp-Gly-Glu-Ala-Gly-Lys-Ile-Gly,Asp、Gly 和 Glu 這3種氨基酸殘基在該多肽的含量最高,其中Asp和Glu存在，會為鈣離子提供有力的配位環(huán)境。同時LIU等[26]采用雙酶復(fù)合工藝對大西洋鮭魚骨頭進(jìn)行酶解,利用RP-HPLC對肽螯合鈣進(jìn)行分離純化,通過四極桿飛行時間質(zhì)譜確定其分子質(zhì)量及氨基酸序列,發(fā)現(xiàn)魚骨中鑒定出的22種肽中有17種肽具有Glu和Asp殘基,推測Glu和Asp殘基可能對鈣螯合肽的結(jié)合活性起作用。另外,在沒有Glu和Asp殘基的5種肽中,有4個肽具有Ser或Thr殘基,所以認(rèn)為Ser、Thr同樣對鈣離子的螯合活性貢獻(xiàn)較大。這與JUNG等[27]和KIM等[28]報道一致,認(rèn)為Ser、Thr、Met和Tyr可能有助于鈣結(jié)合。此外,據(jù)報道,含有組氨酸(His)殘基的肽對鈣離子也具有高親和力。HUANG等[29]從蝦加工副產(chǎn)物中分離出了一種含有組氨酸的三肽Thr-Cys-His,具有高鈣結(jié)合能力,推斷可能是His殘基存在的原因。

2.3 特定基團(tuán)和殘基

通過對比多肽與鈣螯合前后的光譜圖變化,可以證明螯合物的產(chǎn)生、解決螯合物的化學(xué)鍵問題,分析其反應(yīng)基團(tuán),對多肽螯合鈣結(jié)構(gòu)鑒定和螯合機(jī)制的研究具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn),鈣螯合肽可以通過特定的氨基酸基團(tuán)和殘基,如羧基、羰基、氨基、亞氨基和含硫巰基參與配位反應(yīng)。ZHANG等[30]采用胰蛋白酶和中性蛋白酶從太平洋鱈魚骨中制備鈣結(jié)合肽(CBP),經(jīng)紫外光譜和傅立葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)顯示,CBP通過羧基和氨基與Ca2+結(jié)合,形成肽鈣復(fù)合物。HOU等[31]用胰蛋白酶對南極磷蝦水解,產(chǎn)物經(jīng)HAC、RP-HPLC分離純化、TOF-MS確定其氨基酸序列為VLGYIQIR,分子質(zhì)量為960.58 Da,并根據(jù)FTIR結(jié)果推測,鈣離子的螯合位點可能涉及Gln、Ile和Arg殘基的羰基。WANG等[32]報道小麥胚芽蛋白水解物中的鈣螯合肽,通過FTIR,X射線衍射和核磁共振波譜研究肽鈣的螯合機(jī)理,結(jié)果顯示羧基的氧原子與酰胺基的氮原子提供主要的結(jié)合位點。CUI等[33]通過肽組學(xué)鑒定了海參卵中新型七肽鈣(NDEELNK)復(fù)合物的鈣結(jié)合模式,發(fā)現(xiàn)NDEELNK肽以1∶1的化學(xué)計量比自發(fā)地結(jié)合鈣,并且位點可能涉及NDEELNK肽中2個Glu和1個Asp殘基的羧基氧和氨基氮原子。SUN等[34]通過蛋白的結(jié)構(gòu)和熱力學(xué)特性,闡明了蛋清水解產(chǎn)物五肽(DHTKE)與鈣離子之間的結(jié)合方式,DHTKE肽以1∶1的化學(xué)計量比自發(fā)地結(jié)合鈣,且位點對應(yīng)于肽的羧基氧,氨基氮和咪唑氮原子。

此外還發(fā)現(xiàn)螯合反應(yīng)與蛋白質(zhì)的磷酸化位點有關(guān)。CPPs中的磷酸化絲氨酸殘基能夠與鈣離子結(jié)合形成可溶性復(fù)合物,將鈣包裹其中避免鈣在人體腸道內(nèi)形成沉淀,有效提高鈣的吸收利用率。且磷酸絲氨酸殘基的數(shù)量和位置對于結(jié)合活性有重要作用。SATO等[35]發(fā)現(xiàn)磷酸化絲氨酸基團(tuán)與鈣螯合肽的結(jié)合成正相關(guān),并證明了酪蛋白分子的磷酸鹽部分對增強(qiáng)人體小腸吸收鈣離子是非常必要的。ZONG等[36]研究磷酸絲氨酸的位置對于鈣結(jié)合的重要性,研究表明含有3個Ser的磷酸肽結(jié)合鈣能力最強(qiáng),有效抑制磷酸鈣沉淀,磷酸肽中的不連續(xù)Ser結(jié)合鈣能力弱,更容易釋放鈣。雖然已經(jīng)報道了一些特定的基團(tuán)是螯合物形成的必須形式,但仍需要進(jìn)一步研究鈣螯合肽的螯合機(jī)理,包括肽鏈上螯合位點的位置、分子結(jié)構(gòu)和動態(tài)過程。

3 鈣螯合肽的生理活性

3.1 促進(jìn)鈣元素生物利用度

肽鈣螯合物具有良好的溶解度、吸收性和穩(wěn)定性,在胃腸道的弱堿性環(huán)境中能夠有效地運(yùn)輸鈣離子通過腸上皮細(xì)胞,被機(jī)體吸收和利用。CHEN等[37]研究鱈魚皮源螯合肽在體外胃腸道消化過程中的穩(wěn)定性,發(fā)現(xiàn)只有少量肽發(fā)生降解,約75%的肽表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。GAO等[38]研究CPP和可溶性膳食纖維模擬胃腸道中的理化性質(zhì),結(jié)果表明該共聚物的最大鈣結(jié)合水平達(dá)到了46.8%,比原來的CPP高35.17%。

目前,評價肽鈣螯合物生物利用度的方法主要有體外細(xì)胞模型(Caco-2、HT-29 細(xì)胞模型)和體內(nèi)動物試驗。Caco-2 細(xì)胞來自人體結(jié)腸癌細(xì)胞株,在體外培養(yǎng)時自動分化形成類似于人體小腸上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特征,且與小腸上皮細(xì)胞具有相似的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和標(biāo)志酶的功能表達(dá)。CAI等[1]從海洋微生物中分離得到一種肽YL,利用Caco-2細(xì)胞體外促鈣吸收轉(zhuǎn)運(yùn)顯示YL-Ca具有良好的熱穩(wěn)定性和溶解性,與氯化鈣相比可將鈣在 Caco-2 細(xì)胞中的吸收率提高3倍,并保護(hù)鈣離子免受營養(yǎng)抑制劑如單寧酸、草酸鹽、植酸鹽等影響。SUN等[34]使用Caco-2細(xì)胞研究蛋清肽鈣復(fù)合物的體外吸收,結(jié)果表明與不含鈣的對照相比,肽鈣復(fù)合物可使跨Caco-2細(xì)胞單層的鈣吸收提高7倍以上。這些結(jié)果證明鈣螯合肽在促鈣吸收轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起重要作用。HT-29細(xì)胞系由于具有不同細(xì)胞分化模式的能力而常被用于研究鈣的體外吸收模型。COSENTINO等[39]證明CPPs能通過增加HT-29細(xì)胞中的鈣濃度來改善鈣的吸收。

動物模型被廣泛用于體內(nèi)生物利用度研究,據(jù)報道鈣螯合肽能促進(jìn)鈣吸收,增加骨礦物質(zhì)密度和強(qiáng)度,降低骨質(zhì)疏松癥的風(fēng)險。HUA等[40]研究小球藻蛋白肽鈣螯合物對低鈣飲食喂養(yǎng)大鼠鈣吸收代謝的影響,發(fā)現(xiàn)肽鈣螯合物能顯著增加大鼠體重,提高大鼠血清鈣、骨礦物質(zhì)密度和骨礦物質(zhì)含量的水平,降低血清堿性磷酸酶,并抑制骨骼的形態(tài)變化。ZHANG等[7]通過建立去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松模型來驗證,太平洋鱈魚骨制備的鈣結(jié)合肽具有抗骨質(zhì)疏松的生物活性,結(jié)果表明該螯合肽可以提高鈣的生物利用度和血清鈣,降低骨轉(zhuǎn)換率,從而改善骨質(zhì)疏松癥。QU等[41]研究烏耳蛋白水解產(chǎn)物肽鈣復(fù)合物對治療廢用性骨質(zhì)疏松癥的保護(hù)作用,結(jié)果表明木耳肽鈣復(fù)合物有助于改善小鼠的骨礦物質(zhì)密度,骨礦物質(zhì)和有機(jī)物含量,并有效減輕與骨有關(guān)酶的改變代謝,以避免更嚴(yán)重的骨質(zhì)流失。

3.2 抑菌抗氧化活性

肽鈣螯合物不僅可以促進(jìn)機(jī)體對鈣元素的生物利用度,還具有抗氧化、抑菌等生物活性作用。王夢婭等[42]利用復(fù)合酶解法得到大竹蟶源鈣螯合肽,通過硫代巴比妥酸和抑菌圈試驗結(jié)果表明鈣螯合肽有良好的抗氧化活性和抑菌活性。蒲傳奮等[43]探究玉米醇溶蛋白肽制備的多肽螯合鈣的抗氧化和抗菌活性,結(jié)果表明肽鈣螯合物的 DPPH自由基清除率為85.6%,相當(dāng)于α-生育酚的89.53%,能有效地抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌,說明此肽鈣螯合物具有一定的抗氧化和抑菌活性。丁利君等[44]利用木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶酶解羅非魚,將多肽酶解液與氯化鈣進(jìn)行螯合,實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)該螯合物對多種微生物,如腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、熒光假單胞菌、啤酒酵母、白色念珠菌、黑曲霉等都有一定的抑制作用,特別是對細(xì)菌的生長抑制效果更加明顯。鈣螯合肽的抗氧化活性是由于其能夠螯合鈣離子從而阻止自由基的生成,還與其自身的一些活性基團(tuán)有關(guān),如酪氨酸、組氨酸和半胱氨酸的吲哚基、咪唑基和巰基,這些基團(tuán)在肽的抗氧化中起到重要作用。

4 結(jié)語

食源性的鈣螯合肽營養(yǎng)價值高、吸收性好,不僅可以解決鈣元素在人體內(nèi)吸收差和生物活性低的問題,同時也具有抗氧化、抑菌、免疫調(diào)節(jié)等生理作用,可用作醫(yī)藥產(chǎn)品和保健食品的開發(fā)等,也可以用于抗氧化劑、抑菌劑、食品添加劑、有機(jī)肥料、動物飼料等產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn),具有很高的應(yīng)用價值和開發(fā)前景。但目前的研究尚存在一些問題,例如：(1)對其安全性評價的研究較少,目前只是在體外模擬或小鼠實驗,有必要在有缺鈣風(fēng)險的人群中對肽鈣螯合物及其作為鈣補(bǔ)充劑的應(yīng)用進(jìn)行進(jìn)一步研究；(2)肽鈣螯合物的構(gòu)效關(guān)系和活性機(jī)制不完全明確；(3)游離態(tài)的礦質(zhì)元素和螯合態(tài)的礦質(zhì)元素很難準(zhǔn)確分離；(4)螯合物的高效分離與純化技術(shù)還有待提高；(5)生物活性的進(jìn)一步挖掘與研究等問題還有待解決。上述諸多方面問題應(yīng)得到各方的聯(lián)合關(guān)注,以期為相關(guān)副產(chǎn)物的研究開發(fā)提供科技理論支撐。